Nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng Bacillus Thuringiensis sinh Protein tinh thể diệt côn trùng cánh vảy

VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

-------------------

NGUYỄN THỊ HIỀN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA MỘT SỐ

CHỦNG Bacillus thuringiensisSINH PROTEIN TINH THỂ DIỆT CÔN TRÙNG CÁNH VẢY

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Chuyên ngành: Vi sinh vật

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS NGÔ ĐÌNH BÍNH

Hà Nội, 2012

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của tôi. Các số liệu và kết quả trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong các công trình nghiên cứu khác.

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Hiền

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Ngô Đình Bính -Trưởng phòng Di truyền Vi sinh vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, người thầy đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành luận văn tốt nghiệp.

Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ phòng Di truyền Vi sinh vật, đã tận tình chỉ bảo và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp này.

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè, những người đã luôn bên cạnh động viên, ủng hộ, tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi học tập và hoàn thành luận văn của mình.

Hà Nội, ngày …tháng…năm 2012

Học viên

Nguyễn Thị Hiền

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 3

1.1. Đại cương về Bacillus thuringiensis 3

1.1.1. Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng B. thuringiensis 3

1.1.2. Đặc điểm hình thái của Bt 6

1.1.3. Đặc điểm sinh hoá 8

1.1.4. Đặc điểm phân loại 8

1.1.5. Phân loại gene độc tố của vi khuẩn Bacillus thuringiensis 9

1.1.6. Các loại độc tố của Bacillus thuringiensis 11

1.1.7. Cấu trúc của các nhóm độc tố tinh thể 13

1.1.8. Cơ chế tác động của protein tinh thể lên côn trùng 14

1.1.9. Nghiên cứu và ứng dụng Bt ở Việt Nam 15

1.1.10. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình hình thành bào tử và tinh thể độc 16

1.1.11.Gene cry1C và dưới loài Bacillus thuringiensis subsp. aizawai 18

1.2. Đại cương về côn trùng bộ cánh vảy 19

1.2.1. Côn trùng bộ cánh vảy 19

1.2.2. Côn trùng thử nghiệm 19

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1. Vật liệu 24

2.1.1. Sinh phẩm 24

2.1.2. Hóa chất và thiết bị 24

2.2. Phương pháp nghiên cứu 26

2.2.1. Phân loại các chủng Bt bằng phản ứng huyết thanh 26

2.2.2 Xác định mật độ bào tử Bt 27

2.2.3 Thử hoạt tính diệt côn trùng thử nghiệm 27

2.2.4 Tách chiết DNA plasmid 28

2.2.5 Sàng lọc chủng Bt mang gene cry1C bằng PCR 29

2.2.6 Tách dòng đoạn gene cry1C 30

2.2.7 Xác định trình tự nucleotide 32

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33

3.1 Sàng lọc chủng Bacillus thuringiensis subsp. aizawai mang gene cry1C

có hoạt tính diệt sâu xanh da láng và sâu tơ 33

3.1.1 Phân loại hình dạng tinh thể của các chủng Bt nghiên cứu 33

3.1.2 Phân loại Bt bằng huyết thanh 35

3.1.3 Hoạt tính diệt của các chủng Bta trên sâu xanh da láng và sâu 36

Nồng độ bào tử 36

Hoạt tính của các chủng Bta diệt sâu xanh da láng và sâu tơ 37

3.2 Tách dòng và đọc trình tự đoạn gene cry1C 39

3.2.1 Khuếch đại gene cry1C của các chủng Bta bằng PCR 39

3.2.2 Tách dòng đoạn gene cry1C 40

3.2.3 Xác định trình tự đoạn gene cry1C 44

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46

TÀI LIỆU THAM KHẢO 47

BẢNG NHỮNG TỪ VIẾT TẮT

STT

Viết tắt	Viết đầy đủ
1	Amp	Ampicillin
2	Bp	Base pair
3	Bt	Bacillus thuringiensis
4	Bta	Bacillus thuringiensis subspecies aizawai
5	dH2O	Nước khử ion
6	DNA	Deoxyribonucleotide acid
7	E. coli	Escherichia coli
8	EDTA	Ethylene diamine tetra-acetic acid
9	OD	Optical density
10	PCR	Polymerase chain reaction
11	SDS	Sodium dodecyl sulphate
12	Sol	Solution
13	TE	Tris EDTA
14	X-gal	5- Bromo- 4 Chloro- 3 indolyl β- D- galactoside

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 63 trang tài liệu này.

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 1.1. Phân loại gene cry của Bt 10

Bảng 3.1. Sự đa dạ ng hình thá i tinh thể của các chủng Bt 34

Bảng 3.2. Hoạt tính diệt sâu xanh da láng của các chủng Bta sau 3 ngày thử nghiệm .37 Bảng 3.3: Hoạt tính diệt sâu tơ của các chủng Bt sau 3 ngày thử nghiệm 38

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Bào tử và tinh thể của B. thuringiensis 7

Hình 1.2. Tinh thể của vi khuẩn B. thuringiensis 8

Hình 1.3. Mô hình cấu trúc không gian 3 chiều của protein độc tố Cry1Ac 14

Hình 1.4. Cơ chế diệt sâu của vi khuẩn B. thuringiensis 15

Hình 1.5. Vòng đời sâu tơ 21

Hình 1.6. Rau bắp cải bị sâu hại 21

Hình 1.7. Vòng đời của sâu xanh da láng 23

Hình 3.1. Hình dạng khuẩn lạc Bt trên môi trường MPA sau 72h nuôi ở 28ºC. 33

Hình 3.2. Hình dạng bào tử và tinh thể của Bt phóng đại 1000 lần 34

Hình 3.3. Ngưng kết của chủng TN 6.12 phân lập với type huyết thanh dưới kính hiển vi quang học độ phóng đại 400 lần 36

Hình 3.4. Hoạt tính diệt sâu xanh da láng của các chủng Bta nghiên cứu 37

Hình 3.5. Hoạt tính diệt sâu tơ của các chủng Bta nghiên cứu… 38

Hình 3.6. Điện di đồ sản phẩm PCR của các chủng Bta nghiên cứu 39

Hình 3.7. Khuẩn lạc xanh, trắng xuất hiện trên môi trường LBA sau khi nuôi cấy qua đêm 41

Hình 3.8 Điện di đồ sản phẩm PCR colony với mồi M13 42

Hình 3.9. Điện di đồ sản phẩm cắt DNA plasmid tách chiết từ các dòng khuẩn lạc trên agarose 1%. 43

Hình 3.10. Điện di đồ sản phẩm PCR gene cry1C từ các DNA plasmid tái tổ hợp….…44

MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề

Việt Nam có khí hậu nhiệt đới gió mùa, với độ ẩm không khí cao là điều kiện thuận lợi cho các loài sâu hại cây nông - lâm nghiệp phát triển. Côn trùng bộ cánh vảy là bộ lớn trong lớp côn trùng gồm bướm và bướm đêm, trên

180.000 loài đã được mô tả và có mặt ở khắp nơi trên thế giới, chúng gây thiệt hại nghiêm trọng trong nền kinh tế nông nghiệp của nước nhà.

Để bảo vệ năng suất cây trồng, người nông dân thường sử dụng thuốc hóa học với nồng độ cao để phun ngay sau khi dịch sâu hại bùng phát. Trung bình mỗi hectar cây trồng phải phun từ 5–7 kg thuốc. Tuy nhiên, việc sử dụng tràn lan các loại hóa chất diệt côn trùng đã để lại dư lượng thuốc trong nông phẩm, gây độc hại đối với sức khỏe người sử dụng và gây ô nhiễm môi trường. Thay vào các biện pháp hóa học thì các biện pháp sinh học được khuyến khích sử dụng. Hiện nay, thuốc trừ sâu sinh học từ Bacillus thurinngiensis (Bt) chiếm hơn 90% thị phần thuốc trừ sâu sinh học trên thế giới và hoàn toàn không độc với con người, động vật và môi trường [24].

Dưới loài Bacillus thuringiensis subsp. aizawai (Bta) được nghiên cứu nhiều nhất trong 82 dưới loài của Bacillus thuringiensis. Bacillus thurigiensis subsp. aizawai có khả năng sinh tổng hợp protein tinh thể gây độc với côn trùng bộ cánh vảy (Lepidoptera), trong đó có loài sâu tơ (Plutella xylostella), sâu xanh (Helicoverpa armigera Hibber), sâu khoang (Spodoptera litura) và một số côn trùng bộ 2 cánh (Diptera). Cry1C là một loại protein thể độc do Bta sinh ra trong quá trình hình thành bào tử, có hoạt tính chống lại côn trùng bộ cánh vảy rất mạnh. Vì vậy, để có thể sản xuất được thuốc trừ sâu Bt đặc hiệu riêng với côn trùng cánh vảy hoặc chuyển gene mã hóa protein tinh thể kháng côn trùng bộ cánh vảy vào cây trồng, chúng tôi đã tiến hành đề tài:

“Nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng Bacillus thuringiensis sinh protein tinh thể diệt côn trùng cánh vảy’’.