Ảnh Hưởng Của Ppt Lên Khả Năng Tái Sinh Của Đốt Lá Mầm Và Một Nửa Hạt‌

Nội dung 2: Khảo sát các điều kiện thích hợp để ứng dụng trong qui trình chuyển gen tạo astaxanthin vào đậu tương‌

2.2.5. Ảnh hưởng của PPT lên khả năng tái sinh của đốt lá mầm và một nửa hạt‌

Khảo sát ảnh hưởng của PPT ở các nồng độ khác nhau lên sự tái sinh chồi của đốt lá mầm để xác định nồng độ thích hợp cho chọn lọc chồi chuyển gen.

Đốt lá mầm được nuôi cấy trên môi trường tạo chồi tối ưu, bổ sung chất chọn lọc PPT ở các nồng độ khác nhau (0; 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8 mg/l). Mỗi nghiệm thức gồm 10 mẫu, lặp lại 3 lần. Thí nghiệm được bố trí theo kiểu đơn yếu tố, hoàn toàn ngẫu nhiên. Mẫu được nuôi cấy trên kệ sáng (18 giờ chiếu sáng/ngày) với cường độ

2.000 - 3.000 lux, nhiệt độ 25±2oC. Ghi nhận kết quả sau 3 tuần

Chỉ tiêu theo dõi: tỉ lệ mẫu chết, không tái sinh, hình thái mẫu.

2.2.6. Ảnh hưởng của PPT lên sự sinh trưởng của chồi in vitro‌

Khảo sát ảnh hưởng của PPT, ở các nồng độ khác nhau, lên khả năng tạo rễ, phát triển của chồi in vitro, từ đó xác định nồng độ PPT thích hợp duy trì áp lực chọn lọc trong giai đoạn tạo rễ, phát triển cây in vitro.

Chồi in vitro cao khoảng 3 cm được nuôi cấy trên môi trường tạo rễ RM, bổ sung PPT ở các nồng độ khác nhau (0; 1; 2; 3; 4; 5 mg/l). Mỗi nghiệm thức gồm 10 mẫu, lặp lại 3 lần. Thí nghiệm được bố trí theo kiểu đơn yếu tố, hoàn toàn ngẫu nhiên. Mẫu được nuôi cấy trên dàn sáng (18 giờ chiếu sáng/ngày) với cường độ

Có thể bạn quan tâm!

• Nghiên Cứu Phát Sinh Hình Thái Ở Đậu Tương Nghiên Cứu Phát Sinh Hình Thái Chồi Và Rễ‌
• Chuyển Gen Vào Đậu Tương Bằng Phương Pháp Bắn Gen
• Kim Châm Để Tạo Vết Thương Cho Mẫu Chuyển Gen‌
• Đánh Giá Các Giai Đoạn Sinh Trưởng Cây Chuyển Gen Trong Điều Kiện Ex Vitro‌
• Sự Hình Thành Chồi Của Đốt Lá Mầm Giống Mtđ 176 Ở Các Nồng Độ Ba Khác Nhau Sau 3 Tuần Nuôi Cấy.
• Sự Tái Sinh Của Đốt Lá Mầm Giống Mtđ 176 Trên Môi Trường Có Ppt.

Xem toàn bộ 176 trang tài liệu này.

2.000 - 3.000 lux, nhiệt độ 25±2oC. Ghi nhận kết quả sau 3 tuần.

Chỉ tiêu theo dõi: tỉ lệ chồi sống, phát triển, hình thái chồi.

2.2.7. Ảnh hưởng của việc tạo vết thương bằng kim châm lên khả năng tái sinh của đốt lá mầm‌

Thí nghiệm được thực hiện nhằm xác định cách thức tạo vết thương bằng kim châm thích hợp để vi khuẩn A. tumefaciens xâm nhiễm, chuyển gen, đồng thời không ảnh hưởng đến khả năng tái sinh của mẫu. Thu nhận đốt lá mầm từ cây nảy mầm 5 ngày tuổi theo phương pháp của Hinchee và cộng sự (1988), Olhoft và cộng sự (2003) [121][126]. Để tạo vết thương, kim châm được sử dụng để đâm nhẹ (sâu khoảng 1 mm) lên vùng mô phân sinh. Thí nghiệm gồm 6 nghiệm thức, trong đó nghiệm thức đối chứng không sử dụng kim châm. Số lần châm từ 1 đến 5 tương ứng với các nghiệm thức còn lại. Mỗi nghiệm thức gồm 10 mẫu, lặp lại 3 lần. Thí

nghiệm được bố trí theo kiểu đơn yếu tố, hoàn toàn ngẫu nhiên. Mẫu được nuôi cấy trên kệ sáng (18 giờ chiếu sáng/ngày) với cường độ 2.000 - 3.000 lux, nhiệt độ 25±2oC. Ghi nhận kết quả sau 3 tuần.

Chỉ tiêu theo dõi: tỉ lệ mẫu tái sinh chồi.

2.2.8. Ảnh hưởng của việc tạo vết thương bằng dao mổ kết hợp sóng siêu âm lên hiệu quả chuyển gen gus vào đậu tương‌

Nghiên cứu chuyển gen vào đốt lá mầm đậu tương dựa theo phương pháp mô tả bởi Olhoft và cộng sự (2003) [126]. Trong đó, mẫu đốt lá mầm được tạo vết thương bằng dao mổ kết hợp với xử lý sóng siêu âm nhằm tăng khả năng xâm nhiễm của vi khuẩn, qua đó giúp nâng cao hiệu quả chuyển gen.

Tạo vết thương vùng đốt lá mầm: Đốt lá mầm, từ cây nảy mầm 5 ngày tuổi của giống MTĐ 176, được tạo vết thương lên vùng mô phân sinh nách bằng cách dùng dao mổ 15 cắt nhẹ 5 lần theo phương vuông góc với trụ dưới lá mầm. Sau đó tiến hành xử l với sóng siêu âm trước khi xâm nhiễm với vi khuẩn, thời gian xử l siêu âm lần lượt là: 0, 15, 30, 45, 60 giây.

Chuẩn bị vi khuẩn cho thí nghiệm chuyển gen: vi khuẩn A. tumefaciens mang plasmid pCAMBIA3301 được nuôi cấy lắc qua đêm trong bình tam giác 250 ml chứa 50 ml môi trường Luria Bertani (LB) lỏng bổ sung kháng sinh kanamycin và rifamycin nồng độ 50 mg/l ở 28oC, 220 vòng/phút (OD620nm = 0,8 – 1,0). Sau đó ly

tâm thu phần lắng vi khuẩn ở 4000 vòng/phút, 10 phút, 22oC. Hòa vi khuẩn trong 50

ml môi trường lây nhiễm IF, bổ sung acetosyringone 100 µM, lắc nhẹ khoảng 1 giờ trước khi sử dụng xâm nhiễm mẫu.

Gây nhiễm mô thực vật với vi khuẩn: mẫu thực vật sau khi tạo vết thương được ngâm vào dung dịch vi khuẩn đã pha loãng trong 30 phút, sau đó thấm bớt dịch vi khuẩn trên mô bằng giấy lọc vô trùng và cấy chuyển sang môi trường đồng nuôi cấy với mặt trong của lá mầm tiếp xúc với môi trường, ở nhiệt độ khoảng 24oC trong tối, thời gian 5 ngày. Trên bề mặt môi trường đặt một lớp giấy thấm để hạn chế sự phát triển của vi khuẩn.

Tái sinh chọn lọc chồi chuyển gen: Sau thời gian đồng nuôi cấy, mẫu được rửa loại bỏ vi khuẩn bám bên ngoài với môi trường SI lỏng bổ sung 500 mg/l cefotaxime. Một nửa số mẫu sau khi được rửa sạch vi khuẩn sẽ được nhuộm GUS

55

để kiểm tra biểu hiện GUS tạm thời. Một nửa số mẫu còn lại của mỗi nghiệm thức được cấy lên môi trường tái sinh SI bổ sung kháng sinh cefotaxime 500 mg/l và nồng độ chất chọn lọc PPT tối ưu từ các khảo sát trên. Cấy chuyền mẫu sang môi trường mới 2 tuần/lần. Chồi hình thành sau 1 tháng trên môi trường SI được nhuộm GUS để kiểm tra hiệu quả chuyển gen.

Nhuộm GUS mẫu chuyển gen: cho mẫu cần nhuộm GUS vào ống falcon 50 ml, thêm aceton 90% lạnh vào ngập mẫu. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 20 phút. Rửa mẫu bằng nước lạnh. Thêm dung dịch nhuộm GUS vào ngập mẫu. Bọc kín và ủ qua đêm ở 37oC. Sau đó, bỏ hết dung dịch nhuộm GUS và thay bằng cồn 96% ủ ở 65oC đến khi mất màu diệp lục. Kiểm tra mẫu nhuộm GUS và ghi nhận bằng hình ảnh.

Mỗi nghiệm thức gồm 40 mẫu, lặp lại 3 lần. Thí nghiệm được bố trí theo kiểu đơn yếu tố, hoàn toàn ngẫu nhiên.

2.2.9. Ảnh hưởng của việc tạo vết thương bằng dao mổ kết hợp thấm hút chân không lên hiệu quả chuyển gen gus vào đậu tương‌

Thí nghiệm nhằm xác định thời gian tối ưu xử l mẫu đốt lá mầm trong môi trường áp suất âm để tăng khả năng chuyển gen.

Phương pháp thực hiện: quá trình chuyển gen, chọn lọc chồi và nhuộm GUS được thực hiện như thí nghiệm trên. Tuy nhiên mẫu đốt lá mầm sau khi chuẩn bị từ cây nảy mầm, được ngâm trong dung dịch vi khuẩn A. tumefaciens và đưa vào môi trường chân không ở -20 in Hg với các thời gian khác nhau: 0s, 15s, 30s, 45s, 60s thay vì sử dụng sóng siêu âm. Thấm hút chân không được tạo ra bằng cách chuyển mẫu ngâm trong dung dịch vi khuẩn vào buồng hút chân không của máy bắn gen, thực hiện hút chân không đến áp lực - 20 in Hg, sau đó duy trì áp lực này với các khoảng thời gian như trên.

Mỗi nghiệm thức gồm 40 mẫu, lặp lại 3 lần. Thí nghiệm được bố trí theo kiểu đơn yếu tố, hoàn toàn ngẫu nhiên.

Nội dung 3: Chuyển gen tạo astaxanthin vào đậu tương gián tiếp thông qua vi khuẩn A. tumefaciens và kiểm tra, đánh giá các dòng đậu tương chuyển gen.‌

2.2.10. Tạo dòng Agrobacterium tumefaciens EHA 105 chứa plasmid pITB-AST‌

Plasmid pITB-AST được tách chiết từ chủng vi khuẩn E. coli DH5α bằng bộ Kit Spin Miniprep (QIAGEN) và biến nạp vào Agrobacterium tumefaciens bằng

phương pháp Calci nhiệt. Kiểm tra plasmid bằng phương pháp cắt giới hạn plasmid và PCR.

Biến nạp plasmid vào vi khuẩn bằng phương pháp Calci nhiệt [156]

Plasmid được biến nạp vào tế bào A. tumefaciens khả nạp thông qua xử lý sốc nhiệt kết hợp CaCl2. CaCl2 thúc đẩy sự kết hợp giữa DNA plasmid và màng tế bào. Sự thay đổi nhanh nhiệt độ sẽ tạo ra các lỗ thủng trên màng cho phép DNA plasmid xâm nhập vào bên trong tế bào.

Chuẩn bị tế bào vi khuẩn khả nạp

Một khuẩn lạc vi khuẩn riêng lẻ được cấy vào trong 20 ml môi trường LB và ủ qua đêm (12 - 16 giờ) ở 28oC, lắc 220 vòng/phút. Sau đó, pha loãng dịch nuôi cấy ở trên theo tỉ lệ 1:20 trong dung dịch LB (1 ml cho 20 ml) và tiếp tục ủ lắc ở điều kiện như trên khoảng 3 - 4 giờ cho đến khi OD600nm của dịch vi khuẩn bằng 1. Dịch vi khuẩn được ly tâm ở 3000 vòng/phút trong 10 phút để làm lắng tế bào vi khuẩn, đổ bỏ phần dịch môi trường và hòa nhẹ nhàng vào phần cặn vi khuẩn dung dịch 0,1M CaCl2 lạnh. Ủ lạnh dịch huyền phù vi khuẩn ít nhất trong 30 phút rồi phân ra 200 l vào mỗi ống Eppendorf 1,5 ml đã được ủ lạnh trước.

Biến nạp plasmid vào vi khuẩn, chọn lọc khuẩn lạc biến nạp

Khoảng 0,1 - 0,5 g plasmid được cho vào ống chứa 200 l dịch tế bào khả nạp, ủ trong nitrogen lỏng khoảng 90 giây. Sau đó, chuyển nhanh ống sang nhiệt độ 37oC trong 5 phút, đặt lại trong đá khoảng 2 phút. Tiếp theo, cho vào ống 1 ml môi trường LB không có kháng sinh. Nuôi lắc ở 37oC trong 2 giờ rồi ly tâm ở 3000 v/p trong 1 phút và loại bỏ phần lớn dịch nổi bên trên (chỉ chừa lại một ít dịch). Hòa tan nhẹ vi khuẩn vào phần dịch còn lại và trải dịch vi khuẩn trên môi trường LB rắn bổ sung 50 mg/l kanamycin và 50 mg/l rifampicin, ủ qua đêm ở 28 oC.

Kết quả biến nạp thể hiện qua các khuẩn lạc có khả năng kháng kháng sinh mọc được trên đĩa môi trường sau hai ngày nuôi cấy. Chọn những khuẩn lạc màu trắng, to và tách rời trên môi trường xem như là các dòng vi khuẩn giả định biến nạp để kiểm tra.

Các dòng vi khuẩn này được cấy vào môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh chọn lọc và nuôi cấy lắc qua đêm. Plasmid được ly trích từ sinh khối bằng bộ kit QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN).

Kiểm tra sự hiện diện của plasmid bằng phương pháp cắt bằng enzyme giới hạn và PCR

Phương pháp cắt giới hạn

Plasmid, sau khi ly trích, được cắt bằng enzyme giới hạn EcoRI (cho một băng cắt kích thước 15,5 kb); EcoRI và HindIII (cho hai băng cắt kích thước 13,8 kb và 1,7 kb). Sản phẩm cắt được điện di và so sánh kích thước dựa trên sơ đồ thiết kế để nhận dạng plasmid pITB-AST.

Hỗn hợp phản ứng enzyme giới hạn gồm các thành phần: DNA plasmid (15

l), buffer (2 l), hai enzyme EcoRI và HindIII (2 l/ enzyme), BSA (1 l). Tổng thể tích: 20 l. Hỗn hợp được ủ ở 2 - 3 giờ ở 37 oC, sau đó điện di cùng với thang chuẩn -HindIII trên bản gel 1% agarose trong dung dịch TAE.

Phương pháp PCR

Thành phần phản ứng và qui trình thực hiện được trình bày trong mục 2.2.12 để kiểm tra sự hiện diện của các gen trên plasmid pITB-AST.

2.2.11. Chuyển gen tạo astaxanthin vào đậu tương‌

2.2.11.1. Chuyển gen vào đốt lá mầm dùng kim châm và dao mổ tạo vết thương Tạo vết thương vùng đốt lá mầm: Đốt lá mầm được tạo vết thương với hai

phương pháp là dùng dao mổ hoặc kim châm. Phương pháp dùng dao mổ: sử dụng dao 15 cắt nhẹ 7 lần lên vùng mô phân sinh nách, với phương vuông góc với trụ mầm [121][126]. Phương pháp dùng kim châm: dùng kim châm đâm nhẹ với số lần châm tối ưu nhận được từ khảo sát trên.

Chuẩn bị vi khuẩn A. tumefaciens mang plasmid pITB-AST cho thí nghiệm chuyển gen: thực hiện như mô tả ở mục 2.2.8.

Tái sinh chọn lọc cây chuyển gen: Sau quá trình đồng nuôi cấy, mẫu được loại bỏ vi khuẩn bằng dung dịch rửa bổ sung 500 mg/l cefotaxime. Tiếp theo, chọn lọc chồi chuyển gen trong 4 tuần bằng cách cấy lên môi trường tái sinh chồi SI bổ sung cefotaxime 500 mg/l và nồng độ chất chọn lọc PPT tối ưu từ các khảo sát trên. Chồi hình thành được phát triển chiều cao thân trên môi trường SE. Khi chồi cao khoảng 3 cm, chuyển sang môi trường tạo rễ, hình thành cây hoàn chỉnh với nồng độ IBA tối ưu. Mẫu được cấy chuyền sang môi trường mới sau mỗi 2 tuần.

2.2.11.2. Chuyển gen vào đốt lá mầm, một nửa hạt dùng dao mổ, sóng siêu âm và

thấm hút chân không tạo vết thương

Nghiên cứu chuyển gen vào đậu tương sử dụng 2 loại mẫu đốt lá mầm và một nửa hạt. Mẫu đốt lá mầm được tạo vết thương bằng nhiều cách: dùng dao mổ cắt nhẹ, xử lý sóng siêu âm hoặc thấm chân không với điều kiện tối ưu nhận được ở mục 2.2.8 và 2.2.9. Mẫu một nửa hạt được chuẩn bị theo phương pháp của Paz và cộng sự (2006). Cụ thể việc chuẩn bị và xử lý mẫu được thực hiện như sau:

Hạt khử trùng được gieo nảy mầm trên môi trường MS-vitamin B5 trong 5 ngày. Thu nhận vùng đốt lá mầm từ cây nảy mầm bằng cách loại bỏ phần rễ, giữ lại đoạn trụ dưới lá mầm dài khoảng 5 mm. Dùng dao mổ vô trùng chẻ dọc từ đốt đến hết đoạn trụ dưới lá mầm để tách rời hai lá mầm. Sau đó loại bỏ chồi đỉnh và chồi bên. Để tạo vết thương lên vùng mô phân sinh nách, sử dụng các cách thức khác nhau: dùng dao mổ 15 cắt nhẹ 5 lần theo phương vuông góc với trụ dưới lá mầm; kết hợp dùng dao mổ với xử lý sóng siêu âm; kết hợp dùng dao mổ với xử lý thấm chân không. Mẫu sau khi tạo vết thương được xâm nhiễm với vi khuẩn.

Chuẩn bị mẫu một nửa hạt theo qui cách của Paz và cộng sự (2006) [111]: Ngâm hạt đậu trong nước cất vô trùng khoảng 20 giờ. Sau đó tách đôi hai lá mầm dọc theo phần rốn hạt (hilum). Tiếp theo, loại bỏ trục phôi.

Các giai đoạn chuẩn bị vi khuẩn cho thí nghiệm chuyển gen, gây nhiễm mô thực vật với vi khuẩn, tái sinh chọn lọc cây chuyển gen được thực hiện như mô tả ở mục trên.

2.2.12. Kiểm tra cây chuyển gen bằng PCR‌

DNA tổng số được tách từ các dòng đậu tương bằng bộ kit The DNeasy Plant Kit – QIAGEN hoặc theo phương pháp của Dellaporta và cộng sự (1983) [155]. DNA này là nguyên liệu để thực hiện các kiểm tra cây chuyển gen bằng PCR và Southern blot.

Qui trình tách chiết theo Dellaporta, 1983: Khoảng 200 mg mẫu lá được làm đông trong nitơ lỏng, rồi dùng chày nghiền mẫu thành bột mịn trong cối. Sau đó, bột lá được chuyển sang eppendorf 1,5 ml, cho thêm vào 500 µl dịch ly trích, 80µl SDS 10%, trộn đều hỗn hợp. Eppendorf được ủ ở 65oC trong 10 phút. Thêm 600 µl Potassium acetate 5M và trộn đều hỗn hợp, ủ ở 0oC trong ít nhất 20 phút. Dung dịch được ly tâm 14.000 vòng/phút trong 20 phút. Hút dịch nổi vào 1 eppendorf mới,

thêm vào 1 ml isopropanol lạnh. Trộn đều hỗn hợp và ủ ở -20oC trong 30 phút. Tiếp theo, ly tâm dung dịch 13.000 vòng/phút trong 10 phút, rồi loại bỏ dịch nổi, làm khô phần lắng. Hòa tan mẫu trong 0,7 ml Tris 50mM, EDTA 10mM, pH 8, ly tâm hỗn hợp 13.000 vòng/phút trong 10 phút. Chuyển phần dịch nổi sang eppendorf mới, thêm Phenol/isoamyl alcohol (1:1) bằng với thể tích dịch nổi thu được, trộn đều và ly tâm hỗn hợp 13.000 vòng/phút trong 10 phút. Chuyển phần dịch nổi sang eppendorf mới, thêm Sodium acetate 3M bằng 1/10 thể tích dịch nổi thu được và 500 µl isopropanol. Trộn đều, sau đó ly tâm hỗn hợp 13.000 vòng/phút trong 10 phút. Rửa mẫu với 1 ml ethanol 80% lạnh. Làm khô mẫu và hòa tan lại trong 100 µl Tris

10mM, EDTA 1mM, pH 8. Cuối cùng, thêm 2µl RNAse ủ ở 37 oC trong 30 phút để

loại bỏ RNA trong mẫu. DNA thu được có thể sử dụng ngay hay bảo quản ở - 20 oC.

Kiểm tra sự hiện diện của các gen biến nạp trong bộ gen cây bằng phương pháp PCR với các cặp mồi đặc hiệu.

Thành phần của phản ứng PCR gồm có 5 l buffer PCR 5X, 0,5 l dNTP 10 mM, 0,25 l taq polymerase 5 U/µl, 2 l mồi xuôi 1 M, 2 l mồi ngược 1 M, 1 l DNA plasmid, thêm nước cất đủ thể tích 25 µl.

Mồi và các chương trình nhiệt đối với các gen mục tiêu

Các cặp mồi sử dụng để khuếch đại đoạn các đoạn gen chuyên biệt cbfd2, hbfd1, Zm-psy được thiết kế bằng phần mềm Primer3, cặp mồi gen bar tham khảo theo Maqbool và cộng sự 2009 [157].

- Gen cbfd2:

+ Mồi xuôi (p1): 5’ -GAT AGC GAA CAC GTC GTT GA - 3’

+ Mồi ngược (p2): 5’ - AGC CTC CTT GCC TTC TTT TC - 3’

+ Kích thước đoạn khuếch đại tương ứng 500 bp.

+ Chương trình nhiệt phản ứng PCR: 94oC/4 phút [94oC/90 giây, 60oC/90 giây, 72oC/ 2 phút], 72oC/5 phút. Số chu kỳ: 35.

- Gen hbfd1:

+ Mồi xuôi (p3): 5’ - CTT TCC CAC ACC TTT TCC AA - 3’

+ Mồi ngược (p4): 5’ -GCA AGC AGA GAA GTG CAC AG - 3’

+ Kích thước đoạn khuếch đại tương ứng 400 bp.

60

+ Chương trình nhiệt phản ứng PCR: 94 oC/4 phút [94oC/90 giây, 60oC/90 giây, 72oC/ 2 phút], 72oC/5 phút. Số chu kỳ: 35.

- Gen bar:

+ Mồi xuôi (p5): 5’- ATG AGC CCA GAA CGA CG -3’

+ Mồi ngược (p6): 5’- TCA GAT CTC GGT GAC GG -3’.

+ Kích thước đoạn DNA được khuếch đại là 500 bp.

+ Chương trình nhiệt phản ứng PCR: 94oC/5 phút [94oC/1 phút, 62oC/1 phút, 72oC/1 phút 30 giây],72oC/5 phút. Số chu kỳ: 35.

- Gen Zm-psy:

+ Mồi xuôi (p7): 5'-TTG GAT GCT GCT CTT TCA GA-3'

+ Mồi ngược(p8): 5'-CCT CTT TCA GCT TCC TCG AA-3'

+ Kích thước đoạn DNA được khuếch đại là 446 bp.

+ Chương trình nhiệt phản ứng PCR: 94oC/5 phút [94oC/1 phút, 58oC/1 phút, 72oC/1 phút 30 giây],72oC/5 phút. Số chu kỳ: 35.

Sản phẩm PCR bảo quản ở 4oC cho đến khi dùng. Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% với thang chuẩn 1kb Promega. Xem kết quả, chụp hình gel bằng máy Gel Documentation – Biorad.

2.2.13. Kiểm tra cây chuyển gen bằng Southern blot‌

Dùng phương pháp tạo mẫu dò và phát hiện bằng CDP-Star của Amersham (GE Healthcare - RPN 3682) để phân tích các dòng cây đậu tương chuyển gen. Quá trình thực hiện như sau:

Chuẩn bị mẫu và chạy điện di: Cho 10 µg DNA của mỗi dòng chuyển nạp gen, đối chứng âm (cây không được chuyển nạp gen), đối chứng dương (plasmid pITB-AST) ủ với enzyme giới hạn HindIII hoặc HindIII và EcoRI ở 37oC trong 4-5 giờ (Trong phản ứng 50 µl: 5 đơn vị Enzyme cho 1µg DNA, buffer có nồng độ cuối là 2X, thêm nước vừa đủ 50 µl). Điện di mẫu DNA sau khi cắt bởi enzym trên gel 1% agarose (A9539 Sigma), ở 25 vol qua đêm cùng với thang chuẩn Lambda DNA/HindIII. Chụp ảnh bản gel bằng máy chụp Gel-Documentation.

Chuyển DNA từ gel lên màng: bản gel được đặt vào hộp đựng 300ml dung dịch lọc trong, lắc nhẹ trong 10 phút, rồi bỏ dung dịch, tráng bằng nước cất. Sau đó, gel được ngâm trong dung dịch biến tính, lắc nhẹ 15 phút trong khi ngâm gel, lặp lại

Xem tất cả 176 trang.