Đối Tượng, Phạm Vi Và Nội Dung Nghiên Cứu Của Đề Tài

MỞ ĐẦU‌

1. Tính cấp thiết của đề tài

Astaxanthin (C40H52O4) là một loại carotenoid màu đỏ, trong tự nhiên được tìm thấy ở động vật, thực vật và vi sinh vật. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh astaxanthin có tác dụng vượt trội trong lĩnh vực chăm sóc, bảo vệ sức khỏe như chống oxy hóa, bảo vệ DNA, tăng cường miễn dịch, hỗ trợ điều trị tiểu đường, tim mạch, thần kinh...[1][2]. Hiện nay, sản phẩm bổ sung astaxanthin đã lưu hành phổ biến trên thị trường gồm viên nang, bột, kem bảo vệ da, gel... Ngoài ra, ngành chăn nuôi, thủy sản cũng tiêu thụ khối lượng lớn astaxanthin để tạo màu đỏ tự nhiên cho sản phẩm thịt, cá, tôm bằng cách bổ sung vào nguồn thức ăn. Do được sử dụng phổ biến, hiệu quả trên nhiều lĩnh vực nên nhu cầu astaxanthin trên thị trường rất lớn và ngày càng tăng. Điều này làm cho giá astaxanthin rất cao, với astaxanthin tự nhiên là 2500-7000 USD/kg, astaxanthin tổng hợp khoảng 1000 USD/kg, tổng nhu cầu trên thế giới đạt khoảng 280 tấn, trị giá 447 triệu USD năm 2014, ước tính đến năm 2020 đạt mức 1,1 tỉ USD [3][4][5].

Hai nguồn cung chính của astaxanthin gồm sản phẩm tổng hợp hoặc ly trích từ sinh vật, với nguồn tổng hợp chỉ giới hạn sử dụng để tạo màu tự nhiên cho thực phẩm, còn astaxanthin tự nhiên được dùng trong chăm sóc, bảo vệ sức khỏe. Loại có nguồn gốc tự nhiên chủ yếu đến từ ly trích tảo Haematococcus pluvialis, nấm men Xanthophyllomyces dendrorhous, hoặc vỏ tôm, cua... Trên thực vật, astaxanthin chỉ có ở một số cây có hoa thuộc chi Adonis như Adonis aestivalis [6]. Cánh hoa màu đỏ của các loài thuộc chi Adonis có sản lượng thấp nên khó khai thác để cung cấp astaxanthin. Nghiên cứu chuyển gen tạo astaxanthin vào các cây thực phẩm mà các sản phẩm của nó đã được sử dụng phổ biến trong thực tế là một hướng nghiên cứu nhiều tiềm năng. Điều này hứa hẹn cung cấp các sản phẩm có giá trị kinh tế và sử dụng cao. Nhiều nghiên cứu chuyển gen tạo astaxanthin, có nguồn gốc từ vi khuẩn, tảo..., vào các loại cây trồng khác nhau như ngô, gạo, táo đã được thực hiện [7][8]. Đậu tương vốn là cây trồng quan trọng với nhiều ưu điểm nổi bật ở giá trị dinh dưỡng của hạt đậu, khả năng thích nghi ở nhiều vùng trồng, giúp cải tạo đất, đồng thời các sản phẩm từ đậu tương rất đa dạng và phổ biến trong đời sống hàng

ngày như đậu hũ, chao, sữa, bột, dầu ăn... nên tiềm năng ứng dụng với giống đậu tương mới rất lớn. Tuy nhiên, nghiên cứu chuyển gen tạo astaxanthin trên đậu tương còn hạn chế. Ở Việt Nam, chưa ghi nhận được nghiên cứu chuyển gen tạo astaxanthin vào đậu tương. Do đó, nghiên cứu này đã được thực hiện nhằm chuyển các gen từ cây hoa Adonis aestivalis vào đậu tương giúp cây có khả năng sản xuất astaxanthin chuyên biệt ở hạt, từ đó tạo các sản phẩm có thể được ứng dụng.

2. Mục tiêu của đề tài

Tạo được dòng đậu tương biến đổi gen có khả năng tổng hợp astaxanthin ở hạt thông qua phương pháp chuyển gen sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 176 trang tài liệu này.

3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

3.1. Ý nghĩa khoa học

Đây là nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam chuyển gen tạo astaxanthin vào thực vật nói chung và cây đậu tương nói riêng. Giống đậu tương dùng để chuyển gen là các giống lai đã được thuần hóa và trồng phổ biến. Ngoài ra, trên thực vật, khả năng tạo astaxanthin chỉ có ở một số loài thuộc chi Adonis. Các gen đóng vai trò chính trong quá trình chuyển hóa tạo astaxanthin đã được xác định gồm gen cbfd (mã hóa enzyme carotenoid β-ring 4-dehydrogenase) và gen hbfd (mã hóa enzyme carotenoid 4-hydroxy-β-ring 4-dehydrogenase). Các gen này lần đầu tiên được sử dụng để chuyển vào một loài thực vật khác, có khả năng hoạt động hiệu quả giúp cây chuyển gen sản xuất astaxanthin, điều này làm cơ sở cho các nghiên cứu ứng dụng tiếp theo.

Nghiên cứu cũng cho thấy ảnh hưởng đáng kể của các phương pháp tạo vết thương mẫu khác nhau đến hiệu quả chuyển gen vào giống đậu tương MTĐ 176 thông qua vi khuẩn A. tumefaciens. Trong đó, các phương pháp tối ưu dùng kim châm, dao mổ kết hợp sóng siêu âm, thấm hút chân không đã được xác định, có thể được áp dụng để nâng cao hiệu quả chuyển gen vào các giống đậu tương khác.

3.2. Ý nghĩa thực tiễn

Cây đậu tương biến đổi gen có khả năng sản xuất astaxanthin chuyên biệt ở hạt có thể được sử dụng để sản xuất các sản phẩm từ hạt đậu có chứa astaxanthin

như thức ăn chăn nuôi, thủy sản hoặc bổ sung vào các sản phẩm thực phẩm cho người như bột ngũ cốc...

4. Đối tượng, phạm vi và nội dung nghiên cứu của đề tài

Nghiên cứu sử dụng một số giống đậu tương được trồng phổ biến ở Việt Nam. Các giống này được dùng để chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens giúp tạo được cây đậu tương có khả năng sản xuất astaxanthin. Cây đậu tương chuyển gen được phân tích sự hiện hiện gen biến nạp bằng PCR và Souhern blot, đồng thời đánh giá so sánh kiểu hình và khả năng sinh sản với cây đối chứng. Hạt đậu chuyển gen được phân tích xác định hàm lượng astaxanthin ở thế hệ T1.

Nội dung nghiên cứu chính của đề tài:

Nội dung 1: Xây dựng hệ thống tạo cây con hoàn chỉnh in vitro từ đốt lá mầm và một nửa hạt.

Nội dung 2: Khảo sát các điều kiện thích hợp để ứng dụng trong qui trình chuyển gen tạo astaxanthin vào đậu tương.

Nội dung 3: Chuyển gen tạo astaxanthin vào đậu tương gián tiếp thông qua vi khuẩn A. tumefaciens và kiểm tra, đánh giá các dòng đậu tương chuyển gen.

5. Những đóng góp mới của luận án

Các gen cbfd2 (mã hóa enzyme enzyme carotenoid β-ring 4-dehydrogenase) và gen hbfd1 (mã hóa enzyme carotenoid 4-hydroxy-β-ring 4-dehydrogenase) có nguồn gốc từ cây hoa Adonis aestivalis kết hợp với gen Zm-psy (mã hóa enzyme phytoen sythetase) có nguồn gốc từ ngô khi được chuyển vào đậu tương đã giúp tạo được cây phát triển bình thường, có khả năng sản suất astaxanthin.

Xây dựng được qui trình giúp nâng cao hiệu quả chuyển gen trên giống đậu tương MTĐ 176, qui trình này có thể được áp dụng để nâng cao hiệu quả chuyển gen trên các giống khác. Cụ thể cải tiến trong phương pháp tạo vết thương mẫu gồm: sử dụng kim châm đâm nhẹ 3 lần hoặc dùng dao mổ cắt nhẹ lên vùng đốt lá mầm 5 lần kết hợp xử lý sóng siêu âm 30 giây hoặc thấm hút chân không 60 giây.

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU‌

1.1. Chuyển hóa tạo carotenoid ở thực vật‌

Carotenoid là một loại sắc tố hữu cơ tự nhiên có nhiều trong thực vật, đóng vai trò quan trọng giúp bảo vệ, tăng cường sức khỏe như chống oxy hóa, ung thư, tăng cường sức khỏe tim mạch, là tiền chất của vitamin...[9][10]. Tuy nhiên, con người không thể tự tổng hợp carotenoid mà hấp thu qua thực phẩm. Nhiều nghiên cứu đã được thực hiện nhằm thay đổi chu trình chuyển hóa carotenoid ở thực vật để tăng cường các sản phẩm mong muốn, trong đó nổi bật là β-carotene [11][12][13]. Bên cạnh đó, astaxanthin, một carotenoid, nằm ở cuối chuỗi chuyển hóa của một số loài thực vật thuộc chi Adonis cũng đang thu hút nhiều quan tâm nghiên cứu do có giá trị thị trường rất cao, với công dụng vượt trội trong bảo vệ, tăng cường sức khỏe [14][15][16][17][18]. Sau đây là chu trình chuyển hóa tổng hợp carotenoid ở thực vật và một số cải biến chính đã được thực hiện.

1.1.1. Sinh tổng hợp và tích trữ carotenoid‌

Carotenoid được tổng hợp từ những tiền chất tạo bởi con đường chuyển hóa MEP (methylerythritol 4-phosphate pathway) diễn ra trong lạp thể. Glyceraldehyde- 3-phosphate và pyruvate là những cơ chất ban đầu để tổng hợp geranylgeranyl pyrophosphate (GGPP), tiền chất chung để tổng hợp các carotenoid và những hợp chất terpenoid khác (hình 1.1).

Bước đầu tiên trong con đường tổng hợp carotenoid là sự kết hợp hai phân tử GGPP tạo thành 15-cis-phytoene được xúc tác bởi enzyme phytoene synthase (PSY). Phytoene được chuyển thành lycopene bởi hai phản ứng khử bão hòa xúc tác bởi phytoene desaturase (PDS) và zeta-carotene desaturase (ZDS).

Lycopene là điểm phân nhánh của con đường tổng hợp do là cơ chất của hai enzyme cyclase cạnh tranh nhau, β lycopene cyclase (β-LCY) và ε lycopene cyclase (ε-LCY). α-carotene được tạo ra khi β-LCY và ε-LCY hoạt động kết hợp với nhau ở hai đầu của phân tử lycopene, trong khi β-carotene được tạo thành khi chỉ β-LCY hoạt động. α-carotene và β-carotene được hydroxyl hóa bởi ε-ring carotene hydroxylase và β-ring carotene hydroxylase để tạo lutein và zeaxanthin.

Lutein là sản phẩm cuối cùng của nhánh β, ε còn zeaxanthin được oxy hóa bởi zeaxanthin epoxidase (ZEP) trong hai bước để tạo violaxanthin thông qua antheraxanthin. Những phản ứng này có thể đảo ngược bởi violaxanthin deepoxidase (VDE), tạo thành vòng xanthophyll giúp thực vật thích nghi với stress ánh sánh cường độ cao. Violaxanthin được chuyển thành neoxanthin bởi neoxanthin synthase (NXS), carotenoid cuối cùng của nhánh β,β [19][20][21].

Hình 1.1. Sơ đồ con đường sinh tổng hợp carotenoid [19]

Tích trữ carotenoid: Carotenoid thường được tổng hợp trong hầu như tất cả các loại lạp thể của lá, rễ, hoa, trái, hạt bao gồm lục lạp, sắc lạp, bột lạp, dầu lạp… nhưng được tích lũy với lượng lớn trong lục lạp và sắc lạp. Trong lục lạp, hầu hết

các carotenoid được tích lũy ở dạng phức protein-chlorophill-chlorophyll trong các màng thylakoid. Carotenoid của hạt được giữ trong các ngăn elaioplasts (các lạp thể dự trữ lipid, vô sắc lạp), có cấu trúc đặc biệt để dự trữ số lượng lớn các carotenoid. Trong sắc lạp phần lớn các carotenoid có thể được dự trữ trong các màng, thể dầu hoặc dạng tinh thể trong stroma [22][23][24].

1.1.2. Thay đổi chuyển hóa sinh tổng hợp carotenoid‌

Những thay đổi được thực hiện trên một số gen mã hóa các enzyme quan trọng trong con đường sinh tổng hợp carotenoid, giúp tăng cường sự tích lũy hoặc thay đổi tỉ lệ các loại carotenoid được tạo thành. Sau đây là một số gen mã hóa các enzyme đã được sử dụng.

Phytoene synthase: Phytoene synthase (PSY) là enzyme xúc tác bước đầu tiên đóng vai trò quan trọng, quyết định đến quá trình sinh tổng hợp carotenoid, là phản ứng kết hợp hai phân tử GGPP tạo thành phytoene. Do đó sự biểu hiện của gen psy là yếu tố điều hòa quan trọng trong quá trình tích lũy carotenoid ở thực vật. Nhiều nghiên cứu cho thấy khi psy được tăng biểu hiện, có thể kết hợp với sự tăng biểu hiện của gen ở các bước sau như pds, β-lcy, đã giúp tăng đáng kể hàm lượng carotenoid trong các loại cây trồng như cà chua [25], cà rốt [26], canola [27], gạo Golden Rice [28], khoai tây vàng [29], khoai tây và ngô [30]. Carotenoid tổng của các loại cây trồng biến đổi gen có thể tăng 2 - 50 lần ở các loài khác nhau, với từ 1,6

- 3600 lần ở mức độ β-carotene và dẫn đến màu sắc thay đổi sang vàng hoặc cam.

Các nghiên cứu chuyển gen ghi nhận gen psy có nguồn gốc khác nhau (ngô, lúa gạo, arabidopsis, hoa thủy tiên,...) sẽ giúp tăng cường con đường tổng hợp carotenoid ở mức độ rất khác nhau. Paine và cộng sự (2005) nhận thấy gen psy có nguồn gốc từ ngô giúp tăng cường tổng hợp, tích lũy carotenoid cao hơn đáng kể so với psy từ các cây khác như Arabidopsis, cà chua, cà rốt, ớt, lúa [28]. Nhằm nâng cao hơn khả năng tích lũy carotenoid của gạo Golden Rice thế hệ đầu tiên, nhóm tác giả đã thay psy có nguồn gốc từ cây hoa thủy tiên bằng psy từ ngô, kết quả đã giúp tăng hàm lượng carotenoid ở gạo Golden Rice thế hệ 2 gấp 23 lần, tối đa đạt được là 37 µg/g, so với Golden Rice thế hệ đầu, ngoài ra thành phần β-carotene cũng chiếm chủ yếu với 84% trong carotenoid tổng. Các nghiên cứu tổng hợp astaxanthin trên lúa gạo và ngô cũng cho thấy gen psy từ ngô có khả năng giúp tăng cường con

đường tổng hợp carotenoid, từ đó giúp tăng sự tổng hợp astaxanthin [31] [8]. Như vậy, nhiều nghiên cứu đã cho thấy gen psy từ ngô có thể được sử dụng giúp tăng đáng kể khả năng tổng hợp carotenoid trong cây chuyển gen nên sẽ được sử dụng trong nghiên cứu này nhằm nâng cao con đường tổng hợp carotenoid trên cây đậu tương, qua đó giúp tăng cường sự tổng hợp astaxanthin.

Phytoene desaturase và isomerase: Sự tăng cường biểu hiện các gen liên quan đến bước chuyển hóa phytoene thành lycopene như PDS (phytoene desaturase, ZDS (ζ-carotene desaturase), CRTISO (carotenoid isomerase), Z-ISO (15-cis-ζ- carotene isomerase) cũng giúp nâng cao khả năng tổng hợp carotenoid ở thực vật [32][33].

Lycopene cyclase: Sự cạnh tranh hoạt động của β-LCY và ε-LCY xác định tỉ lệ lycopene được định hướng vào hai nhánh của con đường carotenoid để tổng hợp β-carotene hoặc α-carotene [34]. Lá của cây Arabidopsis đột biến bất hoạt gen mã hóa ε-LCY dẫn đến thiếu hụt lutein và tăng cường tổng hợp β-carotene, khoai tây bất hoạt gen ε-LCY ở thân cũng tăng hàm lượng β-carotene gấp 14 lần [35].

1.1.3. Tổng quan về astaxanthin‌

1.1.3.1. Đặc điểm hóa học

Danh pháp: 3,3′-dihydroxy-β, β-carotene-4,4′-dione Công thức phân tử: C40H52O4

Trọng lượng phân tử: 596,84 g/mol.

Cấu tạo phân tử:

Hình 1.2. Bột astaxanthin [36]

Astaxanthin là một carotenoid, màu đỏ (hình 1.2), cấu tạo bởi 40 phân tử cacbon, được liên kết bằng các nối đôi và đơn xen kẽ. Cấu tạo phân tử khác biệt của astaxanthin so với các loại ketocarotenoid khác là cấu trúc vòng ở hai đầu, ngoài nhóm keto (CO), còn có nhóm hydroxyl (OH). Điều này giúp tăng khả năng chống chống oxy hóa, tính phân cực, khả năng ester hóa và tính ổn định cho phân tử astaxanthin [37]. Astaxanthin có ba dạng đồng phân, phụ thuộc vào hướng không gian của nhóm OH ở vị trí cacbon số 3 và 3’: (3R, 3′R), (3R , 3′S), (3S, 3′S) [38].

1.1.3.2. Công dụng và giá trị của astaxanthin

Astaxanthin có tính chống oxy hóa, mạnh hơn cả vitamin C, E, các carotenoid khác như β carotene, lycopene, zeaxanthin… (hình 1.3) nên được dùng làm chất chống các gốc tự do có hại cho cơ thể [39]. Hơn nữa, phân tử astaxanthin có cả 2 đặc tính tan và không tan trong lipid, do đó có thể kết nối với màng tế bào cả bên trong và bên ngoài, giúp tăng hiệu quả chống oxy hóa so với các chất chỉ có một đặc tính (hình 1.4) [40][41][42].

Hình 1.3. So sánh khả năng chống gốc oxy tự do có hại cho cơ thể của một số chất chống oxy hóa [43]

Nhiều nghiên cứu cho thấy astaxanthin còn có tác dụng bảo vệ DNA, tăng cường hệ miễn dịch, giảm sự phát triển của khối u ung thư trên mô hình động vật, hiệu quả trong hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường, stress oxy hóa, viêm, tim mạch, một số vấn đề về các chức năng thần kinh… [1][2][44][45]. Với nhiều công dụng như trên, hiện nay, các dạng sản phẩm khác nhau của astaxanthin đã được bán trên thị trường như: thuốc viên, syro, dầu, gel, kem, sinh khối, bột… [40].