Nghiên cứu tạo cây đậu tương Glycine max L. biến đổi gen có khả năng tổng hợp astaxanthin chuyên biệt ở hạt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-----------------------------

HOÀNG VĂN DƯƠNG

NGHIÊN CỨU TẠO CÂY ĐẬU TƯƠNG (Glycine max L.) BIẾN ĐỔI GEN CÓ KHẢ NĂNG TỔNG HỢP ASTAXANTHIN CHUYÊN BIỆT Ở HẠT

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 176 trang tài liệu này.

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TP. HỒ CHÍ MINH - 2022

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-----------------------------

HOÀNG VĂN DƯƠNG

NGHIÊN CỨU TẠO CÂY ĐẬU TƯƠNG (Glycine max L.) BIẾN ĐỔI GEN CÓ KHẢ NĂNG TỔNG HỢP ASTAXANTHIN CHUYÊN BIỆT Ở HẠT

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 9 42 02 01

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1. TS. Nguyễn Hữu Hổ

2. TS. Phan Tường Lộc

TP. HỒ CHÍ MINH - 2022

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Nguyễn Hữu Hổ và TS. Phan Tường Lộc. Nội dung nghiên cứu và các kết quả trong đề tài này hoàn toàn trung thực. Toàn bộ số liệu và kết quả nghiên cứu chưa từng được sử dụng để công bố trong các công trình nghiên cứu để nhận học vị, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều được trích dẫn nguồn gốc rõ ràng. Một phần trong kết quả nghiên cứu của đề tài này đã được công bố trên tạp chí khoa học chuyên ngành trong nước. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về sự cam đoan này.‌

Hoàng Văn Dương

LỜI CẢM ƠN‌

Để hoàn thành Luận Án này, tôi đã nhận được rất nhiều sự động viên, giúp đỡ từ Thầy Cô, Gia Đình và Bạn Bè.

Xin bày tỏ và gửi lòng biết ơn chân thành, sâu sắc đến:

- Thầy - TS. Nguyễn Hữu Hổ đã tận tình hướng dẫn, động viên và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm luận án.

- TS. Phan Tường Lộc - Anh vừa là người Thầy luôn theo sát, tận tình chỉ bảo, hướng dẫn, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm luận án.

- Thầy Lê Tấn Đức đã luôn bên cạnh ủng hộ, động viên, giúp đỡ tôi hoàn thành luận án.

- Các quý Thầy Cô ở Học Viện Khoa Học Công Nghệ đã truyền đạt kiến thức, giúp đỡ tôi hoàn thành luận án.

- Ban Lãnh đạo Viện Sinh học Nhiệt đới đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi thực hiện đề tài này.

- Các bạn đồng nghiệp phòng Công Nghệ Gen và các bạn sinh viên đã giúp đỡ tôi trong thời gian qua.

- Đặc biệt, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến Gia Đình đã luôn sát cánh, ủng hộ, giúp đỡ tôi trong những năm học vừa qua cũng như trên mỗi bước đường trưởng thành trong cuộc sống.

Hoàng Văn Dương

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC CÁC BẢNG vii

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ viii

TÓM TẮT 1

MỞ ĐẦU 5

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 8

1.1. Chuyển hóa tạo carotenoid ở thực vật 8

1.1.1. Sinh tổng hợp và tích trữ carotenoid 8

1.1.2. Thay đổi chuyển hóa sinh tổng hợp carotenoid 10

1.1.3. Tổng quan về astaxanthin 11

1.2. Biến đổi gen thực vật 19

1.2.1. Chuyển gen vào thực vật sử dụng Agrobacterium tumefaciens 19

1.2.2. Sử dụng promoter trong công nghệ chuyển gen thực vật 22

1.2.3. Sự di truyền của gen biến nạp trong cây chuyển gen 26

1.3. Nghiên cứu phát sinh hình thái và biến đổi gen đậu tương 27

1.3.1. Giới thiệu chung về cây đậu tương 27

1.3.2. Nghiên cứu phát sinh hình thái ở đậu tương 29

1.3.3. Nghiên cứu biến đổi gen đậu tương 35

1.4. Cách tiếp cận của đề tài 43

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 46

2.1. Vật liệu 46

2.1.1. Giống đậu tương 46

2.1.2. Chủng vi khuẩn, plasmid 46

2.1.3. Kim châm để tạo vết thương cho mẫu chuyển gen 47

2.1.4. Môi trường nuôi cấy mô 47

2.1.5. Hóa chất trong các thí nghiệm khác 48

2.1.6. Thiết bị sử dụng 49

2.2. Nội dung và Phương pháp 50

Nội dung 1: Xây dựng hệ thống tạo cây con hoàn chỉnh in vitro từ đốt lá mầm và

một nửa hạt. 50

2.2.1. Tuyển chọn giống đậu tương 50

2.2.2. Khử trùng hạt 50

2.2.3. Ảnh hưởng của BA lên sự tái sinh chồi của đốt lá mầm và một nửa hạt 51

2.2.4. Ảnh hưởng của IBA lên sự tạo rễ của chồi in vitro 52

Nội dung 2: Khảo sát các điều kiện thích hợp để ứng dụng trong qui trình chuyển

gen tạo astaxanthin vào đậu tương 53

2.2.5. Ảnh hưởng của PPT lên khả năng tái sinh của đốt lá mầm và một nửa hạt 53

2.2.6. Ảnh hưởng của PPT lên sự sinh trưởng của chồi in vitro 53

2.2.7. Ảnh hưởng của việc tạo vết thương bằng kim châm lên khả năng tái sinh

của đốt lá mầm 53

2.2.8. Ảnh hưởng của việc tạo vết thương bằng dao mổ kết hợp sóng siêu âm lên

hiệu quả chuyển gen gus vào đậu tương 54

2.2.9. Ảnh hưởng của việc tạo vết thương bằng dao mổ kết hợp thấm hút chân không lên hiệu quả chuyển gen gus vào đậu tương 55

Nội dung 3: Chuyển gen tạo astaxanthin vào đậu tương gián tiếp thông qua vi khuẩn A. tumefaciens và kiểm tra, đánh giá các dòng đậu tương chuyển gen. 55

2.2.10. Tạo dòng Agrobacterium tumefaciens EHA 105 chứa plasmid pITB-AST 55

2.2.11. Chuyển gen tạo astaxanthin vào đậu tương 57

2.2.12. Kiểm tra cây chuyển gen bằng PCR 58

2.2.13. Kiểm tra cây chuyển gen bằng Southern blot 60

2.2.14. Phân tích hàm lượng astaxanthin trong hạt 62

2.2.15. Đánh giá các giai đoạn sinh trưởng cây chuyển gen trong điều kiện ex vitro 62

2.2.16. Xử lý thống kê 63

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 64

Nội dung 1: Xây dựng hệ thống tạo cây con hoàn chỉnh in vitro từ đốt lá mầm và

một nửa hạt. 64

3.1. Tuyển chọn các giống đậu tương 64

3.2. Hiệu quả của các phương pháp khử trùng hạt đậu tương 66

3.3. Ảnh hưởng của BA lên sự tái sinh của đốt lá mầm và một nửa hạt 67

3.4. Ảnh hưởng của IBA lên sự tạo rễ của chồi in vitro 73

Nội dung 2: Khảo sát các điều kiện thích hợp để ứng dụng trong qui trình chuyển

gen tạo astaxanthin vào đậu tương 75

3.5. Ảnh hưởng của PPT lên khả năng tái sinh của đốt lá mầm và một nửa hạt 75

3.6. Ảnh hưởng của PPT lên sự sinh trưởng của chồi in vitro 78

3.7. Ảnh hưởng việc tạo vết thương bằng kim châm lên khả năng tái sinh của đốt

lá mầm 79

3.8. Ảnh hưởng của việc tạo vết thương bằng dao mổ kết hợp sóng siêu âm lên

hiệu quả chuyển gen gus vào đậu tương (giống MTĐ 176) 80

3.9. Ảnh hưởng của việc tạo vết thương bằng dao mổ kết hợp thấm hút chân không lên hiệu quả chuyển gen gus vào đậu tương 83

Nội dung 3: Chuyển gen tạo astaxanthin vào đậu tương gián tiếp thông qua vi khuẩn A. tumefaciens và kiểm tra, đánh giá các dòng đậu tương chuyển gen. 85

3.10. Tạo dòng Agrobacterium tumefaciens EHA 105 chứa plasmid pITB-AST 85

3.11. Chuyển gen tạo cây đậu tương có khả năng sản xuất astaxanthin chuyên biệt

ở hạt 87

3.11.1. Chuyển gen bằng vi khuẩn A. tumefaciens sử dụng kim châm tạo vết thương mẫu 87

3.11.2. Chuyển gen bằng vi khuẩn A. tumefaciens sử dụng dao mổ kết hợp sóng

siêu âm, thấm chân không tạo vết thương mẫu 93

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 111

DANH MỤC CÔNG TRÌNH 113

TÀI LIỆU THAM KHẢO 114

PHỤ LỤC 1

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT‌

2,4-D 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid BA Benzyl Adenine

CBFD Carotenoid β-ring 4-dehydrogenase GGPP Geranylgeranyl Pyrophosphate

H Hour

HBFD Carotenoid 4-hydroxy-β-ring 4-dehydrogenase HPLC High-performance liquid chromatography IAA Indole-3-acetic acid

IBA Indole-3-butyric acid

KT Kinetin

NAA α-naphthylacetic acid

NXS Neoxanthin synthase

PCR Polymerase Chain Reaction

PDS Phytoene desaturase

PPT Phosphinothricin

PSY Phytoene synthase

QC1 Qui cách 1

QC2 Qui cách 2

S Second

SAAT Sonication-assisted Agrobacterium-mediated transformation TDZ Thidiazuron

VDE Violaxanthin deepoxidase

ZDS Zeta-carotene desaturase

ZEP Zeaxanthin epoxidase

β-LCY β Lycopene cyclase

ε-LCY ε Lycopene cyclase