Chất Liệu Và Đối Tượng Nghiên Cứu

cho phép xác định các tế bào apoptosis sớm (Annexin V dương tính, PI hoặc 7-AAD âm tính), và những tế bào trong giai đoạn sau của quá trình apoptosis hoặc đã chết (Annexin V dương tính, PI hoặc 7-AAD dương tính) [108].

Thay đổi ty thể: Thay đổi điện thế màng ty thể

Ty thể đóng một vai trò quan trọng trong quá trình apoptosis bằng cách giải phóng cytochrome C và các protein khác cần thiết để kích hoạt pro-caspase-9 và thực hiện quá trình apoptosis. Một trong những dấu hiệu sớm nhất của quá trình apoptosis qua trung gian ty thể là sự thay đổi điện thế màng ty thể. Sự khử cực này được theo sau bởi sự gia tăng tính thấm màng ty thể và sau đó giải phóng các protein liên màng hòa tan khác nhau vào tế bào chất, như cytochrome C, AIF, Smac/DIABLO và nhiều pro-caspases khác nhau [109]. Bộ BD™ MitoScreen Kit (chứa JC-1) dựa trên huỳnh quang để phát hiện và đo lường các tế bào trong giai đoạn đầu của quá trình apoptosis. Thuốc nhuộm cation ưa béo thấm qua màng JC-1 được sử dụng làm đầu dò điện thế màng Dym. Thuốc nhuộm này có thể tồn tại ở hai trạng thái khác nhau: tập hợp hoặc đơn phân, và mỗi trạng thái được đặc trưng với một phổ phát xạ khác nhau. Các ty thể bình thường, khỏe mạnh hấp thụ thuốc nhuộm, dẫn đến hình thành các tập hợp dẫn đến phát huỳnh quang màu đỏ cao được đo bằng FL2. Sự chuyển đổi của ty thể từ phân cực sang khử cực (do quá trình apoptosis hoặc các sự kiện sinh lý khác) dẫn đến rò rỉ chất nhuộm màu ra khỏi ty thể vào tế bào chất, dẫn đến giảm huỳnh quang màu đỏ. JC-1 không tích lũy trong ty thể với khử cực Dym và tồn tại trong tế bào chất dưới dạng đơn phân dẫn đến phát huỳnh quang màu đỏ thấp.

Hoạt hoá capases

Một trong những đặc điểm sớm của quá trình apoptosis là sự kích hoạt một loạt các protease tế bào, các caspase, phân cắt nhiều cơ chất protein, dẫn đến mất cấu trúc và chức năng tế bào, và cuối cùng dẫn đến chết tế bào. Đặc biệt, các caspase -3, -8 và -9 có liên quan đến quá trình apoptosis: caspase-9 trong con

đường ty thể, caspase-8 trong con đường Fas/CD95, và caspase-3. Hoạt hoá Caspase-3 là dấu hiệu các tế bào đang trải qua quá trình apoptosis, caspase-3 là một protease quan trọng được kích hoạt trong giai đoạn đầu của quá trình apoptosis [110]. BD Bioscineces cung cấp kháng thể phát hiện Caspase-3 hoạt hoá hoặc sử dụng BD™ CBA’s (cytometric bead arraya) để phân tích đa thông số trong con đường apoptosis (Human Apoptosis Kit (Cleaved PARP, Bcl-2, Active Caspase-3), Cat.No. 557816).

Phân mảnh DNA

Một trong những bước sau của quá trình apoptosis là phân mảnh DNA, là kết quả của việc kích hoạt các endonuclease trong apoptosis. Những nuclease này làm suy giảm cấu trúc nhiễm sắc bậc cao thành các đoạn có kích thước ~ 300 kb và sau đó thành các đoạn DNA nhỏ hơn khoảng 50 bp. Một phương pháp thường được sử dụng để phát hiện DNA phân mảnh sử dụng phản ứng được xúc tác bởi exogenous terminal transferase, TdT, thường được gọi là “End-labeling” hoặc “TUNEL” (terminal deoxynucleotidyltransferase dUTP nick end labeling). APO-BrdU và Apo-Direct kit phát hiện sự phân mảnh DNA trong các tế bào bám dính và trong các tế bào phát triển ở trạng thái huyền phù bằng cách sử dụng phép đo dòng chảy kết hợp với phân tích chu kỳ tế bào [111].

1.3.2. Các mô hình nghiên cứu in vivo

Thực tế cho thấy có những hợp chất có tác dụng, biểu hiện hoạt tính khi thửnghiệm in vitro nhưng chưa chắc đã có kết quả mong muốn khi áp dụng lên cơ thể động vật thí nghiệm. Vì vậy, thử nghiệm in vivo vẫn được coi là bước thử nghiệm cần thiết để đánh giá tác dụng của chế phẩm nghiên cứu sau khi đã tiến hành thử nghiệm in vitro cho các kết quả khả quan. Trong lĩnh vực nghiên cứu ung thư thực nghiệm, mô hình nghiên cứu in vivo là mô hình nghiên cứu bắt buộc để có thể đưa ra các số liệu khoa học tin cậy về một chất có thực sự tác động và biểu hiện hoạt tính chống lại ung thư hay không, trước khi tiến hành thử nghiệm trên người

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 222 trang tài liệu này.

[112], [113]. Các mô hình nghiên cứu gây khối u trên động vật (in vivo) cho được chia ra làm các nhóm như sau:

* Nhóm 1: Khối u phát triển tự nhiên trên một số loài động vật (cả loài gặm nhấm và không gặm nhấm); do tỷ lệ bắt gặp thấp (khoảng 1%), khối u phát triển tự nhiên trên động vật rất khó ứng dụng trong việc đánh giá hiệu quả của các tác nhân điều trị/dự phòng.

* Nhóm 2: Khối u phát triển do các tác nhân ngoại sinh: hai tác nhân ngoại sinh quan trọng gây ra khối u là chế độ ăn và hóa chất. Chẳng hạn “Chế độ ăn phương Tây” (“Western diet”) với đặc điểm là tăng chất béo, giảm calci và vitamin D, cho chuột ăn trong thời gian trên 12 tuần làm tăng sinh các tuyến nhú đại tràng (colonic crypts) ở chuột cống và chuột nhắt. Hóa chất gây khối u được tiến hành trên nhiều mô hình. Hợp chất 1,2-dimethylhydrazine (DMH) và chất chuyển hóa của nó, azoxymethane (AOM), là hai chất gây ung thư được sử dụng phổ biến nhất để gây ung thư đại trực tràng ở chuột cống và chuột nhắt. N-methyl-N-nitro-N- nitrosoguanidine và N-methyl-N-nitrosourea: (viết tắt là MNU và NMU) là những chất gây ung thư tác động trực tiếp được dùng cho cả chuột cống và chuột nhắt để gây ra các khối u ở nhiều cơ quan. Khi dùng đường uống, ung thư phát triển ở dạ dày, ruột non, đại tràng, thận, da, phổi và tuyến ức. Khi tiêm MNU gây ung thư tuyến tiền liệt và ung thư vú. Ở thời điểm 14 ngày tuổi, các chuột nhắt trắng đực được gây ung thư biểu mô gan bằng cách tiêm phúc mạc một liều diethylnitrosamine (DEN) 35mg/kg, pha trong dung dịch đệmnước muối sinh lý phosphat vô khuẩn (sterile phosphate buffered saline - PBS). Mặc dù các phương pháp gây u bằng hóa chất có những ưu điểm nhất định, nhưng thực tế nghiên cứu cho thấy mô hình này vẫn còn bộc lộ một số nhược điểm. Phương pháp gây u sử dụng hóa chất thường phải tiêu tốn nhiều thời gian, công sức vì phải sau một thời gian dài từ lúc cho chuột uống hóa chất (có thể lên tới 8-12 tháng) mới tạo thành khối u, hóa chất thường không tạo ra một khối u đơn thuần mà lại có thể gây ra

nhiều khối u ở phổi và ở nhiều cơ quan khác nên rất khó đánh giá khi chỉ muốn nghiên cứu về một loại u cụ thể, tỷ lệ chuột chết cao nhất là khi sử dụng liều cao vì các hóa chất gây u đều rất độc… Quá trình cho động vật sử dụng các chất gây ung thư kéo theo sự nguy hại cho người tiến hành thí nghiệm, chất thải độc hại ra môi trường hoặc xử lý rác thải rất tốn kém.

* Nhóm 3: Các mô hình gây khối u do sự biến đổi gen ở chuột theo các cách khác nhau.

- Mô hình gây đột biến dòng tế bào mầm gây ra bởi các chất gây đột biến, các đột biến trong tế bào được truyền sang con cái. Ví dụ chuột nhắt ApcMin được tạo ra từ đột biến ở chuột C57Bl/6J do ethylnitrosurea (ENU). Vì sự giống nhau về mặt bệnh học và phân tử của mô hình ApcMin với bệnh lý đa polyp tuyến gia đình (familial adenomatous polyposis –FAP), một bệnh lý mà nếu không điều trị sẽ 100% tiến triển thành ung thư đại trực tràng.

- Chuột nhắt biến đổi di truyền cung cấp khả năng tổng hợp lại chính xác các phân tử liên quan đến căn nguyên bệnh ở người, giúp các nhà nghiên cứu lựa chọn các chuột biến đổi gen kiểm soát được loại hình, thời gian, vị trí biến đổi gen phù hợp tạo ra mô hình ung thư theo mục đích nghiên cứu.

Các chuột ung thư do biến đổi gen mặc dù có nhiều ưu điểm, nhưng việc tạo ra khối u trên chuột biến đổi gen là một kỹ thuật khó, chi phí cao và đòi hỏi sự quản lý nghiêm ngặt. Chính vì vậy, các mô hình gây khối u do sự biến đổi gen ở chuột hiện nay vẫn chưa được thực hiện tại Việt Nam.

* Nhóm 4: Các mô hình gây khối u theo cách cấy ghép khối tế bào ung thư vào chuột. Có các hình thức cấy ghép u sau:

- Mô hình ghép dị loài: Mô hình này sử dụng chuột thiếu hụt miễn dịch để cấy ghép tế bào ung thư người trên cơ thể động vật. Đây được xem là một bước đột phá trong nghiên cứu ung thư. Trên các mô hình này, các khối ung thư tạo ra trên chuột mang các đặc tính cơ bản giống khối ung thư trên người, nên nó tiệm cận gần

hơn trong việc đánh giá tác dụng điều trị của các thuốc mới dự định áp dụng điều trị ung thư trên người. Về cơ bản, hầu hết các loại ung thư người đều có thể được ghép tạo khối u trên chuột thiếu hụt miễn dịch [112], [113].

Bắt đầu được tạo ra từ năm 1966 bởi Flanagan, chuột Balb/c nude có biểu hiện bên ngoài khác biệt là không có lông, suy giảm hoặc mất chức năng tuyến ức dẫn đến sự suy giảm hệ miễn dịch nghiêm trọng, các tế bào lympho T nguồn gốc tuyến ức thiếu hụt còn gây ảnh hưởng tới khả năng hoạt động của các tế bào lympho B và tế bào gốc tủy xương [114]. Chính vì vậy, các đáp ứng liên quan đến đáp ứng của hệ miễn dịch bị ảnh hưởng bao gồm:

+ Hình thành kháng thể liên quan đến tế bào lympho T: CD4+ helper.

+ Đáp ứng qua miễn dịch trung gian tế bào cần sự có mặt của lympho T: CD4+ và/hoặc CD8+ (đáp ứng quá mẫn muộn, tiêu diệt virus hoặc phản ứng thải ghép).

Như vậy, với mô hình ghép dị loài, đánh giá tác dụng của các chế phẩm nghiên cứu thông qua tác động tới hệ miễn dịch bị hạn chế. Nhiều dược liệu, bài thuốc cũng như các chế phẩm sinh học có tác dụng trên hệ thống miễn dịch, cần được đánh giá tác dụng kháng u của chế phẩm thông qua hàng loạt các cơ chế miễn dịch. Để đánh giá tác dụng của các chế phẩm như vậy, cần tiến hành nghiên cứu trên mô hình động vật mang u có hệ thống miễn dịch đầy đủ.

Cấy chuyển các dòng tế bào ung thư động vật (mô hình ghép đồng loài): Các dòng tế bào ung thư thực nghiệm đã có từ khá lâu. Các nhà khoa học nhận thấy tế bào ung thư dù ở trong cơ thể động vật hay nuôi cấy trong ống nghiệm vẫn giữ được đặc tính mô bệnh học của nó và khi cấy chuyển những tế bào này vào cá thểcùng loài thì tạo nên khối u mới có đặc tính của khối u nguyên phát [112]. Hiện nay, hai dòng tế bào sarcoma TG180 và Lewis Lung Carcinoma được sử dụng nhiều trong các mô hình ung thư thực nghiệm. Với mô hình này, tế bào ung thư được cấy chuyển lên chuột bình thường không bị các tác nhân biến đổi gen hay hóa chất làm suy giảm hệ thống miễn dịch. Cũng do hệ thống miễn dịch của chuột còn

tốt, vấn đề nuôi dưỡng, chăm sóc chuột cũng thuận tiện hơn nhiều so với các chuột suy giảm miễn dịch. Tế bào ung thư cấy ghép là tế bào đồng loài nên hầu như tránh được việc thải loại ghép, tỷ lệ cấy ghép thành công đạt mức cao. Chuột sau khi phát triển khối u, yếu tố chính ảnh hưởng đến miễn dịch ở chuột là khối u chứ không phải các yếu tố khác. Chính vì thế khi nghiên cứu chế phẩm trên mô hình này cho phép đánh giá tác dụng của chế phẩm trên hệ miễn dịch của chuột mang u và mối liên hệ giữa tác dụng trên hệ miễn dịch với tác dụng kháng u của chế phẩm.

Nhìn chung, có rất nhiều mô hình giúp nhà nghiên cứu có được những hiểu biết có giá trị về ung thư ở người và đánh giá tác dụng kháng ung thư của các chế phẩm nghiên cứu. Tuy nhiên, không có một mô hình đơn lẻ nào có được đầy đủ các khía cạnh của bệnh lý trên người, do đó các nhà nghiên cứu phải lựa chọn cẩn thận mô hình phù hợp nhất cho mục tiêu nghiên cứu của mình.

Trong các mô hình nghiên cứu in vivo, các chỉ tiêu như tỷ số phát triển u (GR%), tỷ số thoái lui u (IR%), thời gian sống thêm (ILS) cũng như sự ảnh hưởng của chế phẩm tới tình trạng sức khỏe chung của động vật thí nghiệm (sự tăng trọng, chỉ tiêu sinh lý máu, sự biến đổi các cơ quan nội tạng, miễn dịch…) sẽ được khảo sát. Mô hình in vivo có ưu điểm nổi bật là đánh giá được chính xác tác động của thuốc lên khối u cũng như lên cơ thể do sự tương tác của cả 3 yếu tố: khối u, thuốc và hệ miễn dịch của động vật thí nghiệm, đồng thời có thể đánh giá được tác động chống oxy hóa của thuốc nghiên cứu trên cơ thể động vật mang u...

CHƯƠNG 2

CHẤT LIỆU, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. CHẤT LIỆU VÀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

2.1.1. Chất liệu nghiên cứu

* Mẫu dược liệu nghiên cứu

Mẫu dược liệu nghiên cứu là rễ củ 4 năm của cây Tam thất (Panax notoginseng (Burk.) F.H.) được trồng tại Simacai, Lào Cai. Mẫu nghiên cứu đã được PGS. TS. Phạm Thanh Huyền, Khoa Tài nguyên dược liệu - Viện Dược liệu thẩm định tên khoa học. Mẫu tiêu bản số HTV2-072015 được lưu tại Khoa Hóa thực vật - Viện Dược liệu (Phụ lục 2).

Các mẫu Tam thất hấp được chuẩn bị như sau:

Mẫu tươi: rễ củ Tam thất tươi được thái lát, chia thành các phần nhỏ được bọc bằng gạc, mỗi phần khoảng 150g. Tiến hành hấp ở nhiệt độ 100°C (hoặc 120°C) trong nồi hấp. Sau mỗi 4 giờ, lấy 01 phần đựng dược liệu ra, sấy khô ở nhiệt độ 45°C, bảo quản trong túi nilon kín, phục vụ quá trình nghiên cứu.

Mẫu khô: rễ củ Tam thất tươi được thái lát, sấy khô ở 45°C đến độ ẩm  10%, thu được mẫu Tam thất khô. Mẫu khô được xay thành bột, chia thành các phần nhỏ, mỗi phần khoảng 30g. Tiến hành hấp ở nhiệt độ 100°C (hoặc 120°C) trong nồi hấp. Sau mỗi 4 giờ, lấy 01 phần đựng dược liệu ra, sấy khô ở nhiệt độ 45°C, bảo quản trong túi nilon kín, phục vụ quá trình nghiên cứu.

Hình 2.1: Mẫu Tam thất khô, hấp ở 100ºC

Hình 2.2: Mẫu Tam thất khô, hấp ở 120ºC

Hình 2.3: Mẫu Tam thất tươi, hấp ở 100ºC