Aspergillus (Sukumaran & cs., 2005; Ariffin & cs., 2006; Ghani & cs., 2013). Do nhu cầu về sử dụng enzyme trong chăn nuôi cũng như các lĩnh vực công, nông nghiệp và thực phẩm ngày càng tăng nên việc nghiên cứu nhằm tăng cường, cải thiện chất lượng cũng như nâng cao sản lượng thông qua việc cải tiến chủng, tối ưu thành phần môi trường, điều kiện lên men hiệu quả và giảm chi phí sản xuất là rất cần thiết. Xuất phát từ những lý do trên, nghiên cứu này tiến hành phát triển chủng nấm sợi, tối ưu thành phần môi trường và điều kiện lên men để nâng cao hiệu quả sinh tổng hợp (α-amylase, glucoamylase, cellulase) ứng dụng trong chế biến thức ăn chăn nuôi.
1.2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI
1.2.1. Mục tiêu chung
Nâng cao hiệu quả sử dụng phụ phẩm trồng trọt và chế biến nông sản bằng ứng dụng chế phẩm sinh học.
1.2.2. Mục tiêu cụ thể
Chọn lọc được 1 chủng đột biến từ chủng nấm sợi Aspergillus niger A45.1 có khả năng sinh đa enzyme (α-amylase, glucoamylase và cellulase) với hoạt tính cao.
Tối ưu được điều kiện lên men xốp cho sản xuất đa enzyme (α-amylase, glucoamylase và cellulase) của chủng đột biến chọn lọc.
Đánh giá được hiệu quả của việc sử dụng thức ăn lên men tạo ra từ bã thải chế biến tinh bột được xử lý bằng đa enzyme (α-amylase, glucoamylase và cellulase) ở lợn thịt.
1.3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU
1.3.1. Đối tượng nghiên cứu
Chủng nấm sợi Aspergillus niger A45.1 được sàng lọc từ bộ giống của phòng Các chất chức năng Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Bã sắn tươi: được thu gom trực tiếp từ các cơ sở chế biến tinh bột thuộc xã Cát Quế, huyện Hoài Đức, Hà Nội.
Lợn lai F1 (Landrace x Yorkshire): 72 lợn cái và 72 lợn đực thiến giai đoạn 20 kg đến xuất chuồng.
1.3.2. Địa điểm nghiên cứu
Phòng Các chất chức năng sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
Phòng Thí nghiệm trung tâm, Khoa Chăn nuôi, Học Viện Nông nghiệp Việt Nam.
Phòng thí nghiệm bộ môn Di truyền giống, khoa Chăn nuôi, Học Viện Nông nghiệp Việt Nam.
Trung tâm Giống lợn chất lượng cao, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
1.3.3. Thời gian nghiên cứu
Thời gian nghiên cứu: tháng 6 năm 2015 - tháng 6 năm 2019
1.4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI
Đề tài đã cải tiến chủng dại Aspergillus niger A45.1 bằng đột biến ngẫu nhiên và chọn lọc được 1 chủng đột biến Aspergillus niger GA15 có khả năng sinh đa enzyme (α-amylase, glucoamylase và cellulase) với hoạt tính cao.
Chế biến được bã thải tinh bột sắn thành thức ăn giàu dinh dưỡng cho chăn nuôi lợn thịt bằng đường hóa và lên men đồng thời sử dụng chế phẩm chứa đa enzyme từ chủng đột biến và lợi khuẩn.
1.5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI
1.5.1. Ý nghĩa khoa học
Đề tài đã tạo ra được một chủng nấm sợi đột biến có khả năng sinh đa enzyme (α-amylase, glucoamylase và cellulase) với hoạt tính cao và tối ưu môi trường lên men xốp cho sản xuất đa enzyme.
Đề tài đã chế biến được bã thải tinh bột sắn thành thức ăn giàu dinh dưỡng cho gia súc bằng đường hóa và lên men đồng thời sử dụng chế phẩm đa enzyme và vi sinh vật probiotic.
Kết quả nghiên cứu góp phần cung cấp thêm tư liệu phục vụ cho giảng dạy và nghiên cứu về phát triển chủng bằng kỹ thuật đột biến, chế biến thức ăn chăn nuôi giàu dinh dưỡng từ bã thải tinh bột bằng đa enzyme và lợi khuẩn.
1.5.2. Ý nghĩa thực tiễn
Có thể cung cấp chủng giống đột biến cho sản xuất enzyme công nghiệp, giảm thiểu chi phí, đáp ứng nhu cầu sử dụng enzyme ngày càng tăng trong chăn nuôi cũng như các lĩnh vực công nghiệp.
Tận dụng được nguồn phụ phẩm rẻ tiền từ các cơ sở sản xuất tinh bột sắn thành nguồn nguyên liệu giàu dinh dưỡng làm thức ăn chăn nuôi, góp phần giảm chi phí về thức ăn trong chăn nuôi và ô nhiễm môi trường.
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. TỔNG QUÁT VỀ ENZYME AMYLASE VÀ CELLULASE
Enzyme là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein, có nguồn gốc từ sinh vật. Nó không chỉ tham gia xúc tác nhanh các phản ứng hóa học bên trong cơ thể mà còn có thể xúc tác cho các phản ứng bên ngoài tế bào.
Enzyme đã được nghiên cứu và ứng dụng trong nhiều lĩnh vực của các ngành công nghiệp, xử lý môi trường, công nghệ thực phẩm.... Ngày nay với xu hướng phát triển của công nghệ sinh học đã tạo ra nhiều ứng dụng mới của enzyme (Sharada & cs., 2013)
2.1.1. Enzyme amylase
Amylase là tên gọi của một nhóm enzym thủy phân, xúc tác phân giải các liên kết glucoside của polysaccharide với sự tham gia của nước. Cơ chất tác dụng của amylase là tinh bột và glycogen. Sản phẩm tạo thành của quá trình thủy phân là glucose, maltose và dextrin là các chất có phân tử lượng thấp.
Các loại amylase có nguồn gốc khác nhau thì thường khác nhau về tính chất, cơ chế tác dụng cũng như sản phẩm cuối cùng của sự thủy phân. Các amylase chủ yếu thủy phân tinh bột thường gặp là: α-amylase, β-amylase và γ-amylase, trong đó 2 nhóm quan trong nhất là α-amylase và γ-amylase (Singh & cs., 2011)
2.1.1.1. α-Amylase (EC 3.2.1.1)
-amylase là một metaloenzyme. Mỗi phân tử -amylase đều có chứa từ 1 đến 30 nguyên tử gam Ca/mol, Ca tham gia vào sự hình thành, ổn định cấu trúc bậc 3 và duy trì hoạt động của enzyme. Enzyme -amylase có khả năng phân cắt các liên kết α-1,4 glucoside trong mạch amylose và amylopectin của tinh bột hoặc glycogen một cách ngẫu nhiên không theo trật tự nào cả, nó không tấn công liên kết α-1,6 glucoside của amylopectin, sản phẩm thủy phân cuối cùng của -amylase là tạo ra maltotriose và maltose từ amylose, hoặc maltose, glucose và dextrin tới hạn phân nhánh từ amylopectin. α-amylase có khuynh hướng hoạt động nhanh hơn β-amylase vì nó có thể hoạt động bất cứ nơi nào trên cơ chất. Khả năng dextrin hóa cao của α-amylase là tính chất đặc trưng của nó. Vì vậy, người ta thường gọi loại amylase này là amylase dextrin hóa hay amylase dịch hóa. Trong cơ thể người, cả amylases nước bọt và tuyến tụy đều là α-amylase. -amylase cũng tìm thấy trong thực vật, nấm (Ascomycetes và Basidiomycetes) và vi khuẩn (Bacillus) (Singh & cs., 2011).
2.1.1.2. β-Amylase (EC 3.2.1.2)
β-amylase là một dạng khác của amylase được tổng hợp bởi vi khuẩn, nấm và thực vật. β-amylase xúc tác quá trình thủy phân liên kết β-1,4 glycosidic thứ hai, làm việc từ đầu không khử, tách hai đơn vị glucose (maltose) một lần. Trong quá trình chín quả, β-amylase phá vỡ tinh bột thành maltose, dẫn đến hương vị ngọt của trái chín. Cả -amylase và β-amylase đều có trong hạt; β- amylase có mặt ở dạng không hoạt động trước khi nảy mầm, trong khi α- amylase xuất hiện khi quá trình nảy mầm bắt đầu. Các mô động vật không chứa β-amylase (Singh & cs., 2011).
2.1.1.3. γ-Amylase hay glucoamylase (EC 3.2.1.3)
Đây là enzyme đường hóa quan trọng nhất trong hệ amylase. γ-amylase cắt các liên kết α-1,4 và α-1,6 glucoside bắt đầu từ đầu không khử trên mạch amilose và amilopectin tạo sản phẩm cuối cùng là glucose. γ-amylase có khả năng thủy phân hoàn toàn tinh bột, glucogen, dextrin và maltose thành glucose. Không giống như các dạng amylase khác, γ-amylase có hiệu quả nhất trong môi trường axit và có độ pH tối ưu là 3. Trong số các vi sinh vật có khả năng sinh γ-amylase đã được biết cho đến nay, chi Aspergillus là chi được biết đến nhiều nhất bởi khả năng sinh glucoamylase rất cao, đặc biệt là loài Aspergillus niger (Singh & cs., 2011).
2.1.2. Enzyme cellulase
Cellulase thủy phân cellulose, cắt liên kết 1,4 - β - glycosidic trong cellulose và các dẫn xuất oligosaccharide liên quan. Cellulase là một phức hệ enzyme bao gồm 3 loại chính là: C1 [(EC 3.2.1.9), (Exo- β-1-4, glucanase)], Cx [(EC 3.2.1.4), (Endo-β-1-4, glucanase, carboxymethyl cellulase, hay CMCase)] và Cb [(EC 3.2.1.21), (β- glucosidase)], chúng tham gia vào những phản ứng kế tiếp nhau để thủy phân cellulose tạo thành oligosaccharides và glucose (Hameed & cs., 2005; Sharada & cs., 2013).
Enzyme (exo- 1,4-β-D- glucanase) (EC 3.2.1.9): Có tác dụng cắt đứt liên kết hydro ở đầu không khử của chuỗi cellulose và liên tục loại bỏ các đơn vị glucose đơn, biến cellulose tự nhiên thành cellulose phản ứng (cellulose vô định hình).
Enzyme endo-1,4-β-D-glucanase ((EC3.2.1.4): Tấn công ngẫu nhiên vào các liên kết β-1-4 ở bên trong, thủy phân cellulose phản ứng thành cellobiose. Enzym này được chia thành hai loại là: Endocellulase hay Endoglucanase (EG) có tác dụng thủy phân liên kết β-1,4-glucoside tại các điểm bất kỳ trên mạch phân tử cellulose. Exocellulase hay exoglucanase (CBH) có khả năng phân giải chuỗi
trên thành disaccaride gọi là cellobiose từ đầu không khử. Bao gồm hai loại CBHI và CBHII.
β-glucosidase (EC 3.2.1.21): Thủy phân cellobiose thành glucose. Là nhóm enzym khá phức tạp, có khả năng hoạt động ở pH rất rộng từ 4,4 đến 8,4. Trọng lượng phân tử 50- 95 KD, có thể hoạt động ở nhiệt độ cao.
2.1.3. Nguồn thu nhận enzyme
Amylase, celullase cũng như các enzyme khác có thể được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau như dịch tiêu hóa động vật, hạt nẩy mầm và các vi sinh vật. Việc sản xuất, thu nhận enzyme từ động vật và thực vật rất phức tạp do nguồn thu nhận nguyên liệu khó khăn, hiệu suất thấp, giá thành cao. Ngày nay đa số các enzyme công nghiệp đều được thu nhận từ vi sinh vật do các ưu điểm của nó mang lại như sau: Vi sinh vật có chu kỳ sinh trưởng, phát triển ngắn, quá trình tổng hợp enzyme diễn ra rất nhanh, do đó rút ngắn thời gian thu nhận enzyme và làm giảm giá thành sản xuất. Hoạt tính enzyme từ vi sinh vật rất cao, chỉ cần sử dụng một lượng nhỏ enzyme có thể chuyển hóa một lượng cơ chất lớn. Hệ enzyme của vi sinh vật rất phong phú, có khả năng tổng hợp nhiều loại enzyme khác nhau, trong đó một số enzyme động vật và thực vật không tổng hợp được. Vi sinh vật không đòi hỏi nghiêm ngặt về mặt dinh dưỡng, có thể sinh trưởng trên nhiều nguồn cơ chất đơn giản, rẻ tiền do đó có thể tận dùng các nguồn phế thải nông nghiệp làm nguồn cơ chất để sản xuất enzyme làm giảm giá thành sản xuất. Vi sinh vật chịu ảnh hưởng lớn của thành phần môi trường dinh dưỡng và các tác nhân lý hóa của môi trường. Do đó, người ta có thể thay đổi thành phần dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy hoặc các tác nhân lý hóa của môi trường, nhằm tạo ra các chủng vi sinh vật sản xuất ra enzyme với hàm lượng lớn và có hoạt tính xúc tác cao. Có thể cải tiến và phát triển chủng để tạo ra các chủng đột biến sản xuất enzyme cao sản bằng nhiều phương pháp. Dễ dàng sản xuất hàng loạt trên quy mô công nghiệp (Singh & cs., 2011; Ciloci & cs., 2012).
Các loại vi sinh vật được sử dụng rộng rãi và phổ biến cho việc thu nhận và sản xuất các enzyme công nghiệp bao gồm: vi khuẩn, nấm sợi và nấm men. Một số enzyme công nghiệp phổ biến được sản xuất bởi các vi sinh vật như bảng 2.1.
Bảng 2.1. Một số enzyme công nghiệp và nguồn vi sinh vật sản xuất enzyme
Enzyme | Vi sinh vật | |
Protease | Bacillus subtilis | |
Vi khuẩn | Amylase | Bacillus subtilis |
Pencilinase | Bacillus subtilis | |
Nấm men | Lactase | Saccharomyces flagilis |
Invertase | Saccharomyces cerevisiae | |
Protease | Aspergillus niger | |
Amylase | Aspergillus oryzae | |
Cellulase | Aspergillus niger | |
Nấm sợi | Pectinase | Aspergillus niger |
Catalase | Aspergillus niger | |
Glucose oxidase | Penicillium notatum | |
Glucosidases | Aspergillus flavus |
Có thể bạn quan tâm!
-
Nghiên cứu phát triển chủng nấm sợi và tối ưu điều kiện lên men sản xuất đa enzyme α-amylase, glucoamylase, cellulase ứng dụng trong chế biến thức ăn chăn nuôi - 1 -
Nghiên cứu phát triển chủng nấm sợi và tối ưu điều kiện lên men sản xuất đa enzyme α-amylase, glucoamylase, cellulase ứng dụng trong chế biến thức ăn chăn nuôi - 2 -
Cải Tiến Chủng Vi Sinh Vật Và Lên Men Sản Xuất Enzyme -
Thành Tựu Về Cải Tiến Chủng Và Tối Ưu Môi Trường Lên Men Sản Xuất Amylase Và Cellulase -
Đặc Tính Và Vai Trò Của Các Vi Sinh Vật Sử Dụng Trong Lên Men Thức Ăn Chăn Nuôi
Xem toàn bộ 197 trang tài liệu này.
Nguồn: Vittaladevaram & cs. (2017)
2.1.4. Tổng quan về nấm sợi Aspergillus niger
2.1.4.1. Đặc điểm sinh thái và phân loại của Asperillus niger
Chi Aspergillus được chia thành các nhóm theo màu sắc của bào tử. Aspergilli có bào tử từ nâu đến đen được xếp vào nhóm Aspergillus niger (A. niger). Mặc dù các loài trong nhóm này khác nhau đáng kể, chỉ có một vài khác biệt rõ ràng để phân loại các loài riêng biệt (Schuster & cs., 2002). Nhóm Aspergillus niger (Aspergilli đen) bao gồm 18 loài, trong đó A. niger, A. tubingensis, A. brasiliensis, A. acidus, A. carbonarius, và A. ibericus là phổ biến nhất, các loài còn lại rất hiếm và được tìm thấy chủ yếu ở các vùng nhiệt đới (Nielsen & cs., 2009). Nhiều loài của Aspergilli đã được phân lập từ khắp nơi trên thế giới. A. niger là một loại nấm sợi sinh trưởng hiếu khí trên cơ chất hữu cơ. Trong tự nhiên, nó được tìm thấy trong đất, chất độn chuồng và thực vật đang phân hủy. A. niger có thể phát triển trong khoảng nhiệt độ rộng từ 6-47°C, nhiệt độ tối ưu tương đối cao ở 35-37°C. Hoạt độ nước giới hạn cho sự phát triển là 0,88, tương đối cao so với các loài Aspergillus khác. A. niger có thể phát triển trong phạm vi pH cực kỳ rộng: 1,4-9,8. Với những đặc điểm đó và khả năng sinh và phát tán bào tử trong không khí, làm cho chúng có khả năng xuất hiện nhiều và phổ biến với tần suất cao ở khắp mọi nơi, đặc biệt là ở những ấm ấp và ẩm ướt (Schuster & cs., 2002).
2.1.4.2. Ứng dụng của Asperillus niger
A.niger có khả năng trao đổi chất mạnh, vì vậy nó được coi là một trong những sinh vật quan trọng được sử dụng trong công nghệ lên men. Từ năm 1923, A.niger đã được khai thác thương mại cho sản xuất axit citric, hầu hết sử dụng trong thực phẩm, mỹ phẩm và dược phẩm. Ngoài việc sản sinh ra axit citric, A.niger còn là nguồn phong phú các enzyme. Pectinase, protease và amyloglucosidase là những enzyme đầu tiên được khai thác bằng nuôi cấy bề mặt. Để sản xuất nhiều sản phẩm, tinh bột - một trong những nguồn cacbon dồi dào nhất phải được thủy phân thành glucose, maltose và các dextrin phân tử lượng thấp. Amyglucosidase còn được gọi là glucosamylase có khả năng xúc tác, cắt các đơn vị glucose từ đầu không khử của tinh bột. Các ngành công nghiệp sản xuất siro và rượu sử dụng chính các amyglucosidase do A.niger sản xuất. Pectin là một heteropolysaccharide, là thành phần chính trong rau củ và trái cây. Một số enzyme được sản xuất bởi A.niger như pectin esterases, endo và exo-polygalacturonidases và pectin có khả năng phân hủy pectin; chúng được sử dụng trong sản xuất rượu vang, nước trái cây để làm giảm độ nhớt của trái cây trước khi chế biến và cải thiện độ trong của sản phẩm (Schuster & cs., 2002).
Các chuyên gia của FAO/WHO đã công nhận các chế phẩm enzyme từ A.niger gồm chính các sinh vật (FAO/WHO 1972, 1978, 1981, 1987, 1990). FDA Hoa Kỳ đã chấp nhận nhiều enzyme sử dụng cho thực phẩm: vào đầu những năm 1960 FDA đã thừa nhận rằng α-amylase, cellulase, amyloglucosidase, catalase, glucose oxidase, lipase và pectinase từ A. niger có thể được coi là an toàn (GRAS
- generally regarded as safe), với điều kiện các chủng không gây bệnh, không độc, hoạt động tốt trong điều kiện sản xuất. Tiếp sau đó, một loạt các enzyme từ A.niger được công nhận là an toàn và sử dụng cho các lĩnh vực thực phẩm, công nghiệp, dược phẩm như: Carbohydrase, cellulase từ A. niger (Schuster & cs., 2002).
Với sự phát triển của công nghệ sinh học, việc sản xuất enzyme của A.niger được cải thiện rõ rệt. Sản xuất phytase tăng 1000 lần nhờ công nghệ tái tổ hợp và nhiều sản phẩm enzyme có sẵn trên thị trường từ các chủng A. niger tái tổ hợp như α-amylase, arabinofuranosidase, catalase, chymosin, glucoamylase, glucose oxidase, pectin esterase, phospholipase A2, phytase và xylanase (Pariza & Johnson, 2001).
Ngày nay trong sản xuất amylase và cellulase thương mại, người ta chủ yếu
thu nhận nguồn enzyme này nấm sợi với các loài thuộc chi Trichoderma, Humicola, Penicillium, Aspergillus (Sukumaran & cs., 2005; Ariffin & cs., 2006; Ghani & cs., 2013). Nhiều loài nấm sợi có khả năng sản sinh các loại enzyme như α-amylase, glucoamylase và cellulase ở các điều kiện và công nghệ lên men khác nhau. Các loài thường được sử dụng là Aspergillus niger, Rhizopus oryzae, Aspergillus awamori và Aspergillus oryzae (Ciloci & cs., 2012; Imran & cs., 2012; Ho & Ho, 2015).
Công nghệ enzyme nhằm mục đích sản xuất các enzyme bởi các chủng vi khuẩn và nấm khác nhau bằng phương pháp lên men lỏng và rắn. Trong những năm gần đây, việc sản xuất enzyme cellulase, α-amylase và glucoamylase bằng lên men rắn đang được quan tâm vì chi phí thấp, hiệu suất cao và có triển vọng trong việc sử dụng nhiều loại phụ phẩm công - nông nghiệp làm cơ chất (Park & cs., 2002). Các phụ phẩm nông nghiệp khác nhau như cám lúa mì, cám gạo, vỏ trấu, bã mía, cám yến mạch, bột hạt bông có thể dùng được cho việc chuyển hóa chúng thành các sản phẩm có giá trị kinh tế bởi đa enzyme từ nấm sợi (Parbat & Singhal, 2011).
Phức hợp cellulase của Aspergillus niger đã được nghiên cứu đầy đủ nhất. Nó có thể chuyển đổi cellulose tự nhiên cũng như cellulose tổng hợp thành glucose (Devi & Kumar, 2017). Devi & Kumar (2017) đã tối ưu điều kiện môi trường, thu nhận và tinh sạch được cellulase của A.niger bằng lên men trên mùn cưa và bã thải giấy và cho rằng các chủng A.niger có khả năng phân hủy các bã thải lignocellulosic sinh học. A.niger tạo ra cellulase hoạt tính cao khi nuôi trong môi trường lỏng bằng cả phương pháp lên men bề mặt và lên men chìm, gần đây là bằng lên men bề mặt rắn (Ikram-Ul-Haq & cs., 2005).
Nhiều nghiên cứu trong nước cũng cho biết các chủng nấm sợi Aspergillus có khả năng sinh ra nhiều loại enzyme và được ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực công nghiệp khác nhau. Nhóm enzym amylase (α-amylase, glucoamylase) được tạo ra bởi Aspergillus oryzae và Aspergillus niger được ứng dụng trong làm bánh mì, ủ bia rượu và bánh kẹo. Enzym cellulase, β-glucanase được tiết ra bởi Aspergillus niger ứng dụng để thúc đẩy sự tiêu hoá của thực phẩm có sợi, sự tinh lọc nước trái cây và bia. Glucose oxidase được tạo ra bởi Aspergillus niger đã có nhiều ứng dụng trong thực phẩm và y học (Hoàng Kim Anh, 2012). Dương Thị Hương & Nguyễn Hiền Trang (2018) đã tạo ra chế phẩm hỗn hợp Aspergillus oryzae KZ3 và Aspergillus awamori HK1 có khả năng sinh protease cao trên môi trường bán rắn. Đỗ Thị Hiền & Huỳnh Phan Phương Trang (2019) đã tạo ra chế phẩm pectinase dạng bột từ Aspergillus niger bằng phương pháp sấy phun. Đặng