Cải Tiến Chủng Vi Sinh Vật Và Lên Men Sản Xuất Enzyme

Minh Nhật & Bùi Viết Cường (2012) nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme glucose oxidase từ Aspergillus niger ở dạng đông khô có hoạt độ riêng 7000 UI/g.

2.2. CẢI TIẾN CHỦNG VI SINH VẬT VÀ LÊN MEN SẢN XUẤT ENZYME

2.2.1. Sự cần thiết phải cải tiến các chủng vi sinh vật

Trong những thập kỷ gần đây với sự tăng lên theo cấp số nhân về ứng dụng của enzyme trong nhiều lĩnh vực khác nhau đã đặt ra yêu cầu cấp thiết là phải mở rộng và tăng cường cả việc cải tiến chất lượng và nâng cao về số lượng thông qua việc cải tiến chủng, tối ưu môi trường, và tìm kiếm quá trình lên men hiệu quả để tăng sản lượng enzyme.

Tăng sản lượng enzyme có thể đạt được bằng tối ưu môi trường nuôi cấy và điều kiện sinh trưởng nhưng cách tiếp cận này bị giới hạn trong khả năng tổng hợp sản phẩm của cơ thể. Việc cải tiến chủng được thực hiện để giảm giá thành bằng cách tăng năng suất hay giảm chi phí sản xuất vì vậy nó có vai trò quan trọng trong công nghiệp lên men. Cải thiện chủng là quá trình cải tiến và thao tác trên các chủng vi sinh vật để tăng cường khả năng trao đổi chất cho các ứng dụng của công nghệ sinh học (Gonzalez & cs., 2003). Do hệ thống kiểm soát vốn có của mình, các vi sinh vật thường sản sinh ra các chất trao đổi thương mại ở nồng độ rất thấp chỉ đủ có lợi cho chúng, do đó việc tăng cường sản xuất các chất trao đổi hiếm khi xảy ra và mặc dù năng suất có thể tăng lên bởi việc tối ưu hóa điều kiện môi trường, tuy nhiên năng suất cuối cùng vẫn được kiểm soát bởi bộ gen (genome) của sinh vật (Pathak & cs., 2015). Việc cải tiến chủng chủ yếu tập trung vào sự gia tăng hiệu suất của quá trình lên men, giảm chi phí và tăng các lợi ích kinh tế và cũng có thể có thêm một số đặc tính mong muốn khác (Prabakaran & cs., 2009; Singh & cs., 2011).

Nghiên cứu về biến đổi gen trong những năm qua đã đóng góp lớn để hiểu cơ chế ổn định và hoạt động cho cải tiến của enzyme công nghiệp. Hầu hết các chủng dại mà có tiềm năng sử dụng trong quá trình lên men công nghiệp bắt buộc phải cải tiến để việc lên men đạt hiệu quả kinh tế cao (Mishra & cs., 2014).

2.2.2. Phương pháp cải tiến chủng vi sinh vật để tăng sản xuất enzyme

Việc tăng cường sản xuất các sản phẩm của vi sinh vật có thể đạt được thông qua gây đột biến, chọn lọc/sàng lọc và ứng dụng của kỹ thuật tái tổ hợp ADN. Cải tiến các chủng vi sinh vật quan trọng cho công nghiệp được thực hiện bằng nhiều phương pháp khác nhau như đột biến, dung hợp tế bào trần, công nghệ tái tổ hợp

ADN và tạo dòng gene. Gây đột biến ngẫu nhiên và dung hợp tế bào trần là đơn giản hơn và được sử dụng phổ biến như là công cụ của kỹ thuật protein để đạt được các chủng với hiệu suất sinh tổng hợp enzyme cao hoặc các đặc tính mong muốn (Singh & cs., 2011; Pathak & cs., 2015).

Đột biến là một công cụ thường được sử dụng để cải tiến chủng. Đây là phương pháp có hiệu quả trong cải tiến các vi sinh vật công nghiệp và phải được tiến hành lặp lại bởi các tác nhân đột biến, lựa chọn và sàng lọc những cá thể sống sót thích hợp. Đột biến đã được nhiều nhà khoa học sử dụng như một công cụ của kỹ thuật protein để đạt được những chủng có hiệu suất enzyme cao hoặc những đặc tính mong muốn. Sàng lọc đột biến hoặc các chủng sản xuất enzyme cao sản là rất quan trọng trong việc cải thiện hiệu suất và tính kinh tế trong quá trình sản xuất công nghiệp (Zhao & cs., 2014). Đột biến xảy ra có thể là tự phát (đột biến tự nhiên) hoặc sau khi gây nhiễm (đột biến nhân tạo, đột biến cảm ứng) với các nhân tố đột biến.

a. Đột biến tự nhiên

Tỷ lệ của đột biến tự nhiên thường thấp nhưng có thể tăng lên do sử dụng các tác nhân đột biến. Tỷ lệ đột biến tự nhiên phụ thuộc vào điều kiện sinh trưởng của sinh vật và tần số đột biến (tỷ lệ đột biến trong quần thể) có thể tăng đáng kể bằng cách sử dụng các tác nhân đột biến.

b. Đột biến nhân tạo

Các tác nhân làm tăng tần số đột biến cao hơn mức tự nhiên được gọi là các tác nhân gây đột biến, gồm các tác nhân vật lý và hóa học. Các đột biến loại này được gọi là đột biến nhân tạo hay đột biến cảm ứng. Đối với các vi sinh vật, các tác nhân gây đột biến chủ yếu là tia tử ngoại và một số hóa chất.

Các tác nhân vật lí như phóng xạ, tia X, tia tử ngoại. Nhiều hóa chất là tác nhân gây đột biến như các đồng đẳng của các bazơ nitric, HNO2 (nitro axit), các chất alkyl hóa mạch...

Nhân tố gây đột biến vật lý

Nhân tố gây đột biến vật lý bao gồm tia UV, tia gamma, tia X. Trong số đó tia UV được sử dụng rộng rãi nhất trong công nghiệp vì nó rất hiệu quả và không đòi hỏi máy móc hay các thiết bị phức tạp (Pathak & cs., 2015).

Bảng 2.2. Các tác nhân gây đột biến để phát triển chủng

Tác nhân đột biến

Đột biến phát sinh	Tác động đến ADN	Hiệu ứng
Bức xạ Bức xạ ion hóa
1. Tia X, tia gamma	Phá hủy mạch đơn hoặc mạch kép của ADN	Mất, thay đổi cấu trúc	Cao
Bước sóng ngắn
2. Tia tử ngoại (UV)	Hình thành Pyridimine dimer và liên kết ngang trong phân tử ADN	Chuyển, mất, lặp, thay thế từ GC -> AT	Trung bình
Hóa học
Base analogs
3. 5-Chlorouracil, 5-Bromouracil	Kết cặp nhầm	Chuyển AT->GC, GC->AT	Thấp
4. 2-Aminopurine deaminating agents	Lỗi trong sao chép ADN		Thấp
5.Hydroxylamine (NH2OH)	Đề amin cytosine	Chuyển GC -> AT	Thấp
6. Nitrous acid (HNO2)	Đề amin của A, C và G	Bi-directional traslation, mất, chuyển AT ->GC và/hoặc GC- >AT	Trung bình
Yếu tố alky hóa
7. N-methyl-N’-nitro N-Nitrosoguanidine (NTG)	Methyl hóa, pH cao	Chuyển GC -> AT	Cao
8.Ethyl methaneusulfonate	Alkyl hóa C và A	Chuyển GC -> AT	Cao
9. Mustards di-(2- chloroethyl)-sulfide	Alkyl hóa C và A	Chuyển GC -> AT	Cao
Nhân tố xen vào
10. Ethidium bromide, acridinedyes	Xen vào giữa 2 cặp bp	Dịch khung	Thấp
Nhân tố sinh học
11. Phage, plasmid, ADN transposing	Thay thế, phá hủy các bazo	Mất, thêm, thay thế	Thấp

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 197 trang tài liệu này.

Nguồn: Pathak & cs. (2015)

Tia UV có độ dài bước sóng 200-300nm, ADN có khả năng hấp thu cực đại bước sóng 254nm, đây chính là bước sóng làm tăng tần số đột biến ở vi sinh vật. Tia UV kích thích các electron trong phân tử dẫn đến sự hình thành của liên kết giữa các phân tử pyrimidine lân cận, kết quả là tạo ra các các dimer (thymine-thymine, thymine-cytosine và cytosine-cytosine) hoặc giữa các pyrimidine của các chuỗi bổ sung đẫn đến sự hình thành các crosslink. Tia UV chủ yếu gây ra các đột biến chuyển, mất, lặp, thay thế các bazơ nitơ (Pathak & cs., 2015). Tia UV được biết đến là thường gây hại, nhưng chúng có khả năng tạo ra các đột biến để cải thiện hiệu suất do thích ứng tốt hơn với môi trường sống (Pathak & cs., 2015). Agrawal & cs. (1999) đã chỉ ra rằng tia UV là một tác nhân đột biến mạnh. Hầu hết việc sản xuất các enzyme công nghiệp đều được tăng lên chủ yếu do phương pháp xử lý UV.

Nhân tố gây đột biến hóa học

Có nhiều hóa chất có khả năng gây ra biến dị di truyền, đến nay tìm ra những hóa chất cho hiệu quả đột biến cao hơn cả phóng xạ. Các tác nhân gây đột biến hóa học có thể kể đến gồm: Các chất ức chế tổng hợp nitơ bazơ trong cấu trúc ADN như coffein, ethyl uretan...; Các chất đồng đẳng với nitơ bazơ như coffein, 5-bromuracil, các chất gần giống với nitơ bazơ, nên nó làm ADN gắn nhầm khi tổng hợp; Các chất alkyl hóa làm đứt mạch ADN như etyl metan sunlfonat (EMS), metyl metaulfonat (MMS), etylen imine (EI), nitrosoguanidin (NG),...; Các chất khác như nhóm oxy hóa, khử. Ngược với sai hỏng sao chép, các tác nhân gây đột biến như nitrous axit và khí ngạt nitơ (nitơ mustard) có thể gây biến đổi trực tiếp trên ADN. Các chất chêm vào ADN (proflavine, acridine…).

Đột biến điểm trực tiếp

Gần đây, nhiều nghiên cứu cho thấy tỷ lệ đột biến của các gen đặc thù được tăng lên bởi phương pháp gây đột biến trực tiếp. Điều này được thực hiện để thu được tần số tối đa các đột biến mong muốn và đòi hỏi kiến thức rộng về gen điều khiển sản phẩm đích và bản đồ gen của cơ thể sinh vật. Gần đây các đột biến invitro được sử dụng bằng tái tổ hợp cùng với kỹ thuật di truyền để làm biến đổi gen được tách ra hay một phần của gen. Nó bao gồm thay đổi trình tự bazo của ADN và thay đổi codon trong gene mã hóa cho các axit amin. Nó có thể được thực hiện bằng phương pháp kỹ thuật protein. Mong muốn cải thiện có thể được tăng khả năng chịu nhiệt, thay đổi dải cơ chất, giảm ức chế phản hồi tiêu cực, thay đổi dải pH (Pathak & cs., 2015).

2.2.3. Lên men sản xuất enzyme

Trong quá trình sản xuất enzyme, có nhiều phương thức lên men được các nhà sản xuất chấp nhận, trong đó có hai phương pháp chính là lên men chìm

(Submerged fermentation - SmF) và lên men bề mặt rắn (Solid state fermentation

- SSF). Trong những thập kỷ gần đây, các nhà nghiên cứu và sản xuất có xu hướng sử dụng kỹ thuật lên men bề mặt rắn (SSF) để sản xuất ra nhiều enzyme từ các vi sinh vật (Singh & cs., 2011).

2.2.3.1. Lên men bề mặt rắn/Lên men xốp (Solid state fermentation - SSF)

Lên men bề mặt rắn được định nghĩa là quá trình lên men gồm cơ chất rắn và được thực hiện trong điều kiện không hoặc gần như không có mặt của nước tự do; tuy nhiên cơ chất phải có đủ độ ẩm để cung cấp cho sự sinh trưởng và quá trình trao đổi chất của vi sinh vật (Singhania & cs., 2009). Tiềm năng của SSF nằm trong việc đưa vi sinh vật nuôi cấy trong môi trường có nồng độ cơ chất cao nhất để lên men, hệ thống SSF giống với môi trường sống tự nhiên của các vi sinh vật do đó đây là lựa chọn thích hợp cho sự sinh trưởng và tạo ra các sản phẩm có giá trị (Singhania & cs., 2009). Quá trình lên men SSF có tiềm năng to lớn trong việc sản xuất enzyme. Ngoài các ứng dụng thông thường trong các ngành công nghiệp thực phẩm và lên men, enzyme của vi sinh vật còn có vai trò quan trọng trong chuyển hóa sinh học các dung môi hữu cơ, chủ yếu cho các chất có hoạt tính sinh học (Pandey & cs., 1999).

a. Ưu nhược điểm của lên men bề mặt rắn

Lên men bề mặt rắn nhận được nhiều sự quan tâm của của các nhà nghiên cứu cho sản xuất nhiều loại enzyme công nghiệp do những ưu điểm của nó đem lại như sau: Lên men bề mặt rắn dễ thực hiện, quy trình công nghệ thường không phức tạp, yêu cầu đối với các thiết bị lên men đơn giản, không tốn kém, do đó giảm thiểu chi phí trong quá trình sản xuất. Môi trường nuôi cấy trong lên men rắn đơn giản. Một số cơ chất có thể được sử dụng trực tiếp như là môi trường rắn hoặc được bổ sung thêm một số chất dinh dưỡng. Lên men bề mặt rắn cho năng suất cao hơn trong một khoảng thời gian ngắn hơn, lượng enzyme được tạo thành từ lên men bề mặt thường cao hơn rất nhiều so với lên men chìm. Đây là đặc điểm ưu việt rất quan trọng trong giải thích tại sao phương pháp nuôi cấy bề mặt hiện nay phát triển mạnh trở lại. Sản phẩm thu hồi sau lên men với lượng dung môi ít, hạn chế nước thải ra môi trường. Mặt khác, sản phẩm sau khi thu nhận dễ sấy khô và dễ bảo quản và dễ tinh sạch. Hàm lượng ẩm thấp, do đó hạn chế sự lây nhiễm của các vi sinh vật khác. Dễ dàng xử lý khi bị tạp nhiễm trong quá trình lên men (Singhania & cs., 2009).

Lên men bề mặt rắn mặc dù có nhiều ưu điểm song vẫn còn một số nhược điểm như sau: Các vi sinh vật nuôi cấy bởi phương pháp SSF bị hạn chế bởi rào

cản về hàm lượng ẩm của môi trường. Khó khăn trong việc xác định các thông số của môi trường lên men như pH, oxy tự do, CO2 (Singhania & cs., 2009).

b.Vi sinh vật sử dụng cho sản xuất enzyme bằng lên men bề mặt rắn

Trong lên men SSF, hầu hết các nhóm vi sinh vật (nấm men, nấm sợi, vi khuẩn) đều có thể sinh trưởng và phát triển trên bề mặt môi trường rắn để sinh ra các nhóm enzyme khác nhau. Việc lựa chọn một chủng đặc thù tùy thuộc vào mục đích, yêu cầu và một số yếu tố, đặc biệt là tính chất của cơ chất và điều kiện môi trường. Tuy nhiên, nấm sợi là thích hợp cho lên men SSF vì cơ chất và các điều kiện trong SSF gần giống với điều kiện sống tự nhiên của nấm sợi (Tengerdy & Szakacs, 2003).

Các enzyme thủy phân như cellulase, xylanase, pectinase... hầu hết đều được tạo ra bởi các loài nấm sợi, vì các enzyme đó được sử dụng trong tự nhiên cho sự sinh trưởng của chúng. Trichoderma sp. và Aspergillus niger đã được sử dụng rộng rãi nhất cho các enzym này. Các enzyme phân giải tinh bột cũng thường được tạo ra bởi nấm sợi và các chủng ưa thích thuộc về các loài thuộc chi Aspergillus và Rhizopus. Mặc dù việc sản xuất thương mại của amylases được thực hiện bằng cách sử dụng cả các chủng nấm và vi khuẩn, α- amylase của vi khuẩn thường dùng để phân giải tinh bột do sự ổn định với nhiệt độ cao của nó. Để đạt được hiệu suất cao với chi phí sản xuất thấp, dường như các dòng biến đổi gen sẽ đóng vai trò chính trong việc sản xuất enzyme (Pandey & cs., 1999).

c. Cơ chất sử dụng trong lên men bề mặt rắn để sản xuất enzyme

Trong môi trường lên men bề mặt rắn, các vi sinh vật sẽ phát triển trên bề mặt môi trường, nhận chất dinh dưỡng từ hạt môi trường và sinh tổng hợp ra enzyme nội bào và ngoại bào. Các enzyme ngoại bào sẽ thẩm thấu vào trong các hạt môi trường, còn các enzyme nội bào nằm trong sinh khối vi sinh vật.

Việc lựa chọn cơ chất cho sản xuất enzyme bằng lên men SSF phụ thuộc vào nhiều yếu tố, chủ yếu liên quan đến chi phí và sự tiện lợi của cơ chất, do đó có thể bao gồm việc lựa chọn một số loại phế thải nông nghiệp. Trong quá trình SSF, cơ chất không chỉ cung cấp chất dinh dưỡng cho sự sinh trưởng của vi sinh vật mà còn còn đóng vai trò như vị trí neo giữ cho các tế bào. Cơ chất mà cung cấp tất cả các chất dinh dưỡng cần thiết cho vi sinh vật phát triển được coi là cơ chất lý tưởng. Tuy nhiên, một số các chất dinh dưỡng có thể có ở nồng độ dưới mức tối ưu, hoặc thậm chí không có trong các cơ chất. Trong những trường hợp như vậy, cần thiết

phải bổ sung thêm các chất dinh dưỡng khác ở bên ngoài. Một số loại cơ chất cũng cần phải được xử lý trước trước khi được sử dụng cho SSF (hóa học hoặc cơ học) như ligno-xenlulose, để cho vi sinh vật dễ sử dụng hơn cho sự sinh trưởng của chúng (Pandey & cs., 1999).

Trong số các yếu tố cần thiết cho sự phát triển của vi sinh vật và sản xuất enzyme việc sử dụng cơ chất đặc thù, kích thước hạt và độ ẩm/hoạt độ nước là yếu tố quan trọng nhất (Pandey & cs., 1999). Vi sinh vật không chỉ phát triển trên bề mặt môi trường, nơi ngăn cách pha rắn (môi trường) và pha khí (không khí) mà còn phát triển trên bề mặt của các hạt môi trường nằm hẳn trong lòng môi trường. Môi trường nuôi cấy cần vừa có độ xốp cao và vừa phải có độ ẩm thích hợp. Các hạt cơ chất có kích thước càng nhỏ càng cung cấp diện tích bề mặt lớn cho sự tấn công của vi sinh vật, đó là một yếu tố mong muốn. Tuy nhiên, kích thước các hạt cơ chất quá nhỏ làm cho cơ chất bị bết lại có thể gây cản trở cho quá trình hô hấp của các vi sinh vật hiếu khí, làm cho chúng sinh trưởng kém. Trái lại, các hạt có kích thước lớn sẽ tạo điều kiện cho hoạt động hô hấp tốt hơn (do tăng không gian giữa các hạt), nhưng cung cấp bề mặt giới hạn cho sự tấn công của vi sinh vật. Vì vậy kích thước của các hạt phải được xem xét, lựa chọn cho phù hợp với từng quy trình cụ thể (Pandey & cs., 1999).

Lên men xốp khác với lên men lỏng, vì sự sinh trưởng của vi sinh vật và sản phẩm tạo ra ở trên hoặc cạnh bề mặt của các hạt cơ chất rắn có độ ẩm thấp. Do đó, điều quan trọng là phải cung cấp cấp một hàm lượng nước tối ưu và kiểm soát hoạt độ nước của cơ chất cho quá trình lên men, vì sự có mặt của nước ở nồng độ thấp hơn hoặc cao hơn sẽ ảnh hưởng xấu đến hoạt động của vi sinh vật. Hơn nữa, nước có tác động lớn đến các tính chất lý hoá của chất rắn và điều này ảnh hưởng đến năng suất của quá trình lên men (Pandey & cs., 1999).

Phế thải nông nghiệp được coi là nguồn cơ chất tốt nhất cho quá trình SSF. Trong những năm gần đây, nhiều phụ phẩm công-nông nghiệp đã được sử dụng làm cơ chất cho SSF như: bã mía, cám mì, cám gạo, cám ngô, cám đậu, rơm rạ, vỏ trấu, bã đậu nành, xơ dừa, bã sắn, bã thải dầu cọ, bột sắn, bột mì, bột ngô, bột giấy, bột củ cải đường, bột đậu phộng.... Trong đó, bã sắn và bã mía có nhiều lợi thế hơn so với các cơ chất khác như rơm lúa, vì hàm lượng tro thấp, khả năng giữ nước cao. So với bã mía thì bã sắn có lợi thế hơn là nó không yêu cầu quá trình tiền xử lý và có thể phân hủy bởi hầu hết các vi sinh vật cho các mục đích khác nhau. Bã sắn được sử dụng nhiều trong sản xuất axit citric, hương liệu, và các chất trao đổi

khác (Pandey & cs., 1999).

d. Các yếu tố ảnh hưởng đến sản xuất enzyme trong các hệ thống lên men bề mặt rắn

Các yếu tố chính ảnh hưởng đến sự tổng hợp enzyme của vi sinh vật trong hệ thống lên men xốp gồm: lựa chọn cơ chất và vi sinh vật phù hợp; tiền xử lý cơ chất; kích thước hạt (khoảng trống giữa các hạt và diện tích bề mặt) của cơ chất; hàm lượng nước và hoạt độ nước của cơ chất; độ ẩm tương đối; loại và lượng của vi sinh vật cấy vào; kiểm soát nhiệt độ của vật chất lên men/loại bỏ nhiệt của quá trình trao đổi chất; duy trì tính đồng bộ trong môi trường của hệ thống lên men xốp và môi trường không khí xung quanh, như tốc độ hấp thụ oxy và giải phóng CO2 (Pandey & cs., 1999).

2.2.3.2. Lên men chìm/lên men lỏng (Submerged Fermentation- SmF/ Liquid Fermentation - LF)

Lên men chìm là quá trình nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường lỏng, tất cả các chất dinh dưỡng có trong môi trường cho sự phát triển của vi sinh vật trong quá trình lên men phải ngập nước. Các yếu tố cần kiểm soát trong lên men chìm là: nhiệt độ, pH, tốc độ khuấy, nồng độ oxy...Các hợp chất hoạt tính sinh học được tiết ra trong môi trường lên men. Cơ chất trong quá trình lên men được sử dụng khá nhanh do đó cần phải được thay thế hoặc bổ sung chất dinh dưỡng liên tục (Subramaniyam & cs., 2012). Lên men chìm là phương pháp được sử dụng phổ biến trong quy trình lên men công nghiệp vì có thể kiểm soát được toàn bộ các thông số của quá trình lên men, do đó có thể lên men lớn với thể tích thay đổi từ hàng nghìn đến hàng trăm nghìn lít.

a. Ưu nhược điểm của lên men chìm

So với phương pháp lên men bề mặt rắn, thì lên men chìm có nhiều ưu điểm đó là: Tốn ít diện tích, vi sinh vật chỉ cần nuôi cấy trong một thiết bị với thể tích lớn, diện tích mặt thoáng nhỏ, do đó việc kiểm soát độ vô trùng tốt, dễ dàng kiểm soát được toàn bộ quy trình, dễ cơ giới hóa và tự động hóa trong quá trình theo dõi, ít cần sử dụng nhân lực và đảm bảo độ đồng nhất của sản phẩm (do chúng cùng được thu từ một thiết bị).

Tuy nhiên phương pháp lên men chìm có một số nhược điểm như sau: Đòi hỏi đầu tư nhiều kinh phí cho trang thiết bị. Trong lên men chìm cần phải khuấy và sục khí liên tục vì vi sinh vật chỉ sử dụng được ôxy hoà tan trong môi trường. Khí được nén qua một hệ thống lọc sạch tạp trùng, hệ thống này tương đối phức tạp và dễ gây nhiễm cho môi trường nuôi cấy. Nếu một mẻ lên men vì một lý do