Đặc Tính Và Vai Trò Của Các Vi Sinh Vật Sử Dụng Trong Lên Men Thức Ăn Chăn Nuôi

Trước nhu cầu và ý nghĩa thực tiễn của các chế phẩm sinh học, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đã đưa ra định hướng phát triển chăn nuôi đến năm 2030 là phải khuyến khích phát triển mạnh công nghiệp sản xuất nguyên liệu, thức ăn bổ sung, nhất là công nghệ sinh học nhằm đáp ứng đủ các chế phẩm sinh học thay thế kháng sinh, hóa chất dùng trong chăn nuôi và tận thu, nâng cao giá trị dinh dưỡng các nguồn phụ phẩm nông nghiệp, công nghiệp trong nước, như: bã, men bia, bã dứa, bã sắn, tiết và phụ phẩm lò mổ, vỏ đầu tôm, đầu xương và mỡ cá tra (Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, 2020).

2.4. SỬ DỤNG THỨC ĂN LÊN MEN TRONG CHĂN NUÔI

2.4.1. Đặc tính và vai trò của các vi sinh vật sử dụng trong lên men thức ăn chăn nuôi

Thức ăn chăn nuôi lên men đã được nghiên cứu rộng rãi để thay thế việc sử dụng kháng sinh làm chất kích thích tăng trọng trong nhiều năm gần đây và để giám giá thành của thức ăn chăn nuôi bằng việc sử dụng các phụ phẩm công - nông nghiệp (Wang & cs., 2018). Thức ăn lên men mang lại nhiều lợi ích cho vật nuôi do sự có mặt của các vi sinh vật có lợi với các đặc tính probiotic, kháng khuẩn, chống oxy hóa, sản sinh các peptit…Chúng có khả năng biến đổi thành phần hóa học của nguyên liệu thức ăn trong suốt quá trình lên men làm tăng cường giá trị dinh dưỡng, cải thiện chất lượng cảm quan, an toàn thực phẩm và có hiệu quả trong bảo quản thức ăn. Bên cạnh đó, các vi sinh vật còn có khả năng phân hủy các thành phần độc hại, các chất kháng dinh dưỡng có trong thức ăn, sinh ra các chất kháng khuẩn, chống oxy hóa, kích thích đặc tính probiotic và các hợp chất tăng cường sức khỏe cho vật chủ (Tamang & cs., 2016; Wang & cs., 2018). Việc sử dụng thức ăn lên men đã được chứng minh giúp cải thiện chức năng của hệ tiêu hóa, duy trì sự cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột, ngăn ngừa bệnh tiêu chảy, cải thiện năng suất và sức khỏe của động vật (Mukherjee & cs., 2016; Wang & cs., 2018).

Đặc tính chức năng của các vi sinh vật trong thức ăn lên men gồm: đặc tính probiotic, đặc tính kháng khuẩn, chống oxy hóa, sinh peptit, phá hủy các thành phần kháng dinh dưỡng…

Probiotic là các vi sinh vật sống khi được bổ sung với số lượng thích hợp sẽ ảnh hưởng có lợi đối với sức khỏe của vật chủ (Hill & cs., 2014). Các vi sinh vật probiotic được sử dụng trong thức ăn phải kháng được axít dịch vị dạ dày và dịch vị mật để đến ruột non, sống và phát triển được trong ruột để hỗ trợ thực hiện các chức năng tiêu hóa và miễn dịch, phải được chứng minh là an toàn khi sử dụng, không

sinh độc tính và không có tác dụng phụ. Các vi sinh vật probiotic phổ biến nhất là vi khuẩn Lactobacillus, Enterococcus và chi Bifidobacterium. Trong những năm gần đây, nấm men và một số nhóm vi khuẩn khác cũng được nghiên cứu là các vi sinh vật probiotic tiềm năng (Hill & cs., 2014). Các vi sinh vật được sử dụng như probiotic gồm: Lactobacillus acidophilus, L.plantarum, L. Casei, L. casei subsp. Rhamnosus, L. delbreuckii subsp. Bulgaricus, L. Fermentum, L.reuteri, Lactococcus lactis subsp. Lactis, L. lactis subsp. Cremoris, Bifidobacterium bifidum, B. Infantis, B.adolescentis, B. Longum, B. Breve, Streptococcus salivarius subsp. Thermophilus, Enterococcus faecalis, E. Faecium, Saccharomyces boulardii (Hill & cs., 2014).

2.4.2. Các vi sinh vật sử dụng trong lên men thức ăn

Các vi sinh vật tham gia vào quá trình lên men thức ăn bao gồm: nhóm vi khuẩn lên men lactic (Lactic Acid Bacteria, LAB) nhóm vi khuẩn Bacillus (gồm các loài thuộc chi Bifidobacterium, Brachybacterium, Brevibacterium, Propionibacterium…), nấm men (chi Candida, Debaryomyces, Geotrichum, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Rhodotorula, Saccharomyces, Saccharomycopsis, Schizosaccharomyces, Torulopsis, Wickerhamomyces, and Zygosaccharomyces) (Tamang & cs., 2016).

2.4.3. Hiệu quả của sử dụng thức ăn lên men trong chăn nuôi

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 197 trang tài liệu này.

Thức ăn lên men được coi là một trong những phương pháp an toàn sinh học để thay thế kháng sinh kích thích tăng trưởng trong chăn nuôi (Kobashi & cs., 2008; Niba & cs., 2009a).

Vai trò của việc bổ sung thức ăn lên men trong chăn nuôi có thể kể ra là: Cải thiện hệ vi sinh vật đường ruột; cải thiện việc sử dụng chất dinh dưỡng; kích thích hệ thống miễn dịch đường ruột; giảm độ pH do đó ngăn chặn sự xâm nhập và phát triển của các vi sinh vật gây bệnh, từ đó cải thiện hàng rào chức năng của ruột (Niba & cs., 2009a).

Thức ăn lên men được đặc trưng bởi số lượng lớn các vi khuẩn LAB (khoảng 109 cfu/ml thức ăn) và nồng độ axit lactic cao (>150 nM) (Niba & cs., 2009b). Hàm lượng axit hữu cơ cao trong thức ăn lên men đã được báo cáo giúp cải thiện hàng rào chống lại sự xâm nhập của các vi sinh vật gây bệnh ở gà bằng cách tăng nồng độ axit, giảm pH của ruột (Niba & cs., 2009b). Tỷ lệ các chủng Escherichia coli kháng chlortetracycline giảm đáng kể trong ruột của lợn con cai sữa khi cho ăn thức ăn lên men lỏng, chỉ còn 22,2% so với khi cho ăn thức ăn thô là 88,9% (Kobashi & cs., 2008). Missotten & cs. (2015) cho rằng, lợi ích chính của

việc sử dụng thức ăn lên lỏng cho lợn là cải thiện về năng suất, đây là chiến lược hiệu quả trong việc thay thế việc sử dung kháng sinh làm chất kích thích trăng trưởng ở lợn. Tác dụng có lợi đã được quan sát ở lợn sữa, lợn cai sữa và lợn vỗ béo. Sự cải thiện đáng kể này là liên quan đến tỷ lệ mầm bệnh có trong dạ dày và ruột lợn. Lợn con sơ sinh có hệ tiêu hóa vô trùng và có hệ vi sinh vật đặc trưng thông qua tiếp xúc với lợn mẹ và môi trường. Vì vậy, giai đoạn ngay sau khi sinh là giai đoạn quan trọng nhất để thiết lập hệ vi sinh vật có lợi ổn định trong đường ruột. Do đó, cho lợn nái ăn thức ăn lên men sẽ ảnh hưởng có lợi đến quần thể vi sinh vật đường ruột của lợn con. Lợn con từ lợn nái cho ăn thức ăn lên men có số lượng coliform trong phân thấp hơn so với lợn con sinh ra từ lợn nái có chế độ ăn bình thường và có số lượng vi khuẩn probiotic cao hơn (Missotten & cs., 2015). Theo Missotten & cs. (2015), việc sử dụng thức ăn lên men lỏng có ảnh hưởng tốt đến năng suất của lợn con cai sữa, tăng trọng ở loạn con tăng 22,3% và cải thiện 10,9% về hiệu quả sử dụng thức ăn. Theo Jensen & Mikkelsen (2001) lợn thịt cho ăn thức ăn lên men đã cải thiện 4,4% về tăng trọng và 6,9% về hiệu quả sử dụng thức ăn. Lợn được ăn thức ăn lên men cũng đã được chứng minh là có ảnh hưởng tốt đến chất lượng thịt do việc chuyển đổi tryptophan trong ruột thành indode thay là skatole, dẫn tới giảm nồng độ skatole trong mỡ lưng của lợn và do đó làm giảm chất béo của lợn đực vỗ béo (Pedersen & Stein, 2010)

Các nghiên cứu trên gia cầm cũng cho thấy việc sử dụng thức ăn lên men đã mang lại những hiệu quả đáng kể. Yamamoto & cs. (2007) báo cáo rằng gà thịt khi cho ăn thức ăn lên men bằng Aspergillus awamori đã cải thiện rõ rệt về tăng trọng và giảm tỷ lệ mỡ bụng so với ăn thức ăn hỗn hợp. Theo Wu & cs. (2015) khi bổ sung thức ăn lên men bằng Aspergillus niger vào chế độ ăn cho gà thịt có thể cải thiện khả năng chống oxy hóa, nó làm giảm malondialdehyde và tăng hoạt động superoxide dismutase, tuy nhiên, ảnh hưởng đến hiệu suất sinh trưởng là không đáng kể. Trong thức ăn lên men có nhiều vi khuẩn LAB và nồng độ axit lactic cao, do đó có thể làm cho gà ít bị nhiễm Salmonella hơn (Heres & cs., 2003).

2.5. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ SỬ DỤNG BÃ SẮN TRONG CHĂN NUÔI

Ở Việt Nam, sắn là cây lương thực quan trọng đứng hàng thứ ba sau lúa và ngô. Cây sắn hiện nay đã chuyển đổi vai trò từ cây lương thực, thực phẩm thành cây công nghiệp hàng hóa có lợi thế cạnh tranh cao. Sản phẩm sắn Việt Nam có nhu cầu cao đối với thị trường xuất khẩu và tiêu thụ nội địa. Việt Nam hiện sản xuất mỗi năm gần 10 triệu tấn sắn củ tươi, trong đó khoảng 70% dành cho xuất khẩu và 30%

cho tiêu thụ trong nước. Việt Nam hiện đã trở thành nước xuất khẩu tinh bột sắn đứng thứ hai trên thế giới sau Thái Lan (Faostat, 2018). Sắn không những là nguồn lương thực, thực phẩm cho người và gia súc mà còn là nguồn nguyên liệu quan trọng có giá trị cho các ngành công nghiệp khác như: dệt, lương thực, dược, chế biến nước giải khát, cồn... Tinh bột sắn được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực công nghiệp, thực phẩm khác nhau. Chính vì vậy trong những năm gần đây ở nước ta nhiều nhà máy sản xuất và chế biến tinh bột sắn ra đời. Theo tính toán để sản xuất được 1 kg tinh bột sắn cần sử dụng 3-4 kg nguyên liệu và lượng chất thải rắn thải ra trong quá trình chế biến tinh bột sắn chiếm 20-30% lượng sắn củ sử dụng gồm bã thải, vỏ cáy, đầu mẩu và mủ sắn. Hiện nay Việt Nam có khoảng 100 nhà máy chế biến tinh bột sắn có quy mô lớn với sản lượng từ 1,8 tấn đến 2 triệu tấn tinh bột/ngày, lượng chất thải rắn thải ra từ các nhà máy này khoảng 0,6 triệu tấn/ngày. Khi chất thải không được thu gom và xử lý kịp thời thì quá trình phân hủy các chất hữu cơ sau 48 giờ sẽ tạo ra các khí H2S, NH3, CH4… gây mùi khó chịu và ô nhiễm môi trường (Nguyễn Thị Hằng Nga & cs., 2016; Le & cs., 2020).

Theo Carta & cs. (1999), trong bã sắn có chứa đến 50% tinh bột, xơ thô từ 21-50%, hàm lượng protein thấp (0,32 -1,61% VCK). Thành phần hóa học của bã sắn khác nhau là do cách chế biến khác nhau và do giống cây trồng khác nhau. Mai Thị Thơm & Bùi Quang Tuấn (2006) cho biết trong bã sắn chứa 8% tinh bột, 15- 20% xơ thô chiếm tới 50% VCK. Theo Nguyễn Hữu Văn & cs. (2008), thành phần hóa học của bã sắn tươi như sau: vật chất khô 11,2%, protein thô 3,6%, NDF 31,2%, khoáng, lipit 0,3%, khoáng tổng số 2,8%, pH 4,21, HCN 26,9 mg/kg tươi. Có thể thấy, độ ẩm trong bã sắn còn khá cao, hàm lượng xơ cao, protein thấp và chứa nhiều độc tố HCN. Vì vậy, để bảo quản và sử dụng bã sắn làm thức ăn chăn nuôi cần có biện pháp xử lý phù hợp, hiệu quả.

Để tận dụng nguồn bã sắn làm thức ăn chăn nuôi và giảm ô nhiễm môi trường, ở nhiều cơ sở chế biến tinh bột quy mô nhỏ và vừa, người ta tiến hành phơi nắng bã sẵn. Giải pháp này tiết kiệm năng lượng sấy nhưng rất tốn lao động thủ công, tốn nhiều diện tích sân phơi, khô không đều, dễ bị nhiễm nấm mốc mất vệ sinh khi dùng làm thức ăn, giá trị sản phẩm thấp. Mặt khác, trong bã sắn còn chứa chất độc cyanogenic glycoside, hàm lượng protein thấp, hàm lượng xơ cao. Trong nghiên cứu của Nguyễn Xuân Trạch (2003), bã sắn khô có hàm lượng protein rất thấp (2-3%), hàm lượng tinh bột 5-8%, hàm lượng xơ thô cao. Việc sử dụng bã sắn dạng này mang lại hiệu quả kinh tế và giá trị dinh dưỡng không cao.

Ủ chua là phương pháp đã được nhiều tác giả nghiên cứu để chế biến và bảo quản bã sắn làm thức ăn cho gia súc nhai lại. Bã sắn khi ủ đống tự nhiên sẽ tự lên men chua rất mạnh do sự chuyển hóa tinh bột thành axit hữu cơ. Ở một số cơ sở người ta đưa bã sắn tươi xuống hố để tránh mất nước, duy trì độ chua bảo quản. Khi bị mất nước hoặc phơi khô không đảm bảo điều kiện thì bã sắn dễ bị tạp nhiễm nấm mốc và bị phân hủy gây thối. Nguyễn Hữu Văn & cs. (2008) đã tiến hành đánh giá giá trị dinh dưỡng của bã sắn công nghiệp ủ chua với các phụ gia để làm thức ăn cho gia súc nhai lại. Kết quả cho thấy, sau khi ủ, bã sắn có pH và hàm lượng HCN giảm nhanh, hàm lượng protein từ 3,5-5,3% VCK. Đây là biện pháp phù hợp để bảo quản bã sắn làm thức ăn cho gia súc nhai lại trong điều kiện nông hộ. Tuy nhiên hàm lượng protein trong bã sắn sau khi ủ chua tương đối thấp, vì vậy khi bổ sung vào khẩu phần ăn của gia súc cần bổ sung thêm thành phần khác giàu protein để cân đối khẩu phần ăn. Mặt khác, việc ủ chua bã sắn nếu không đúng quy cách sẽ dễ bị hư hỏng và giảm chất lượng của sản phẩm. Lên men bã sắn bằng vi sinh vật được coi là phương pháp hiệu quả trong việc chế biến làm thức ăn cho gia súc. Các vi sinh vật thường được sử dụng để lên men bã sắn cũng như các phụ phẩm khác là Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus niger, Trichoderma sp., một số vi khuẩn, nấm men và các vi sinh vật dạ cỏ (Aro, 2008). Đặc biệt việc kết hợp các vi sinh vật trong lên men đã làm tăng giá trị của bã sắn sau lên men. Aro (2008) đã lên men bã sắn với các công thức khác nhau cùng 4 loài nấm (A.fumigatus, A.niger, A.flavus, S.cerevisiae) và 2 loài vi khuẩn Lactobacillus, sau lên men SSF 14 ngày, thành phần dinh dưỡng của bã sẵn ở các công thức đều được cải thiện rõ rệt so với trước lên men: protein thô tăng lên 5,83-7%, xơ thô giảm còn 18,18-17,74%, mỡ thô tăng lên 3,21-4,11%, khoáng tổng số 3,04-3,96% và HCN giảm từ 17,88 (mg/kg) xuống còn 9,4-10,91 (mg/kg). Trần Thị Thu Hồng & cs. (2013) lên men bã sắn Aspergillus oryzae và Saccharomyces cerevisiae đã cải thiện đưưcc hàm lượng protein thô trong bã sắn từ 3,05% lên 16,46%. Hàm lượng HCN trong bã sắn giảm đáng kể theo thời gian lên men.

Việc xử lý và lên men bã sắn bằng đa enzyme và lợi khuẩn để tạo thành TACN có giá trị dinh dưỡng cao và giúp giảm ô nhiễm môi trường, góp phần tăng thu nhập của người dân là vấn đề rất cần thiết và có ý nghĩa thực tiễn cao hiện nay ở nhiều địa phương. Việc tìm kiếm các giải pháp kỹ thuật để xử lý bã sắn làm thức ăn chăn nuôi cần phải đặt ra đúng mức để có thể đưa nguồn phụ phẩm này trở thành thức ăn hữu ích cho vật nuôi, góp phần khai thác các ưu thế tại chỗ và góp phần hạn chế ô nhiễm môi trường do bã sắn phân hủy gây nên.

PHẦN 3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Nội dung 1: Gây đột biến chủng Aspergillus niger A45.1 và tối ưu điều kiện lên men chủng nấm đột biến chọn lọc để sinh tổng hợp đa enzyme (α- amylase, glucoamylase và cellulase) cao.

Nội dung 2: Xử lý bã sắn thành thức ăn chăn nuôi bằng chế phẩm đa enzyme của chủng đột biến chọn lọc và vi sinh vật probiotic bằng công nghệ đường hóa và lên men đồng thời.

Nội dung 3: Đánh giá ảnh hưởng của việc sử dụng bã sắn lên men trong khẩu phần ăn đến năng suất chăn nuôi lợn thịt.

3.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.2.1. Gây đột biến chủng Aspergillus niger A45.1 và tối ưu điều kiện lên men chủng nấm sợi đột biến chọn lọc để sinh tổng hợp đa enzyme (α- amylase, glucoamylase và cellulase) cao

3.2.1.1. Vật liệu

Chủng nấm sợi Aspergillus niger A45.1 được sàng lọc từ bộ giống của phòng Các chất chức năng Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Hóa chất: dung dịch N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine (NTG) (100 mg/ml đệm 0,2M citrate, pH5), 3,5 dinitrosalysilic (DNS), ampicillin (100mg/l), carboxymethyl cellulose 1% (w/v) (CMC; Sigma, St. Louis, MO, USA), hồ tinh bột 1%, đệm axetat (50mM, pH5), glucose, maltose, cao nấm men, tryptone, peptone, NH4Cl, NH4NO3…

Môi trường nuôi cấy và lên men:

Môi trường PDA (Potatose Dextrose Agar) (nguyên liệu, g/l): Khoai tây 200g (gọt vỏ, thái hạt lựu, thủy phân trong 1 giờ, sau dó thu dịch và bỏ bã), glucose 20g, KNO3 0,5g, agar 20g. Môi trường PDB (Potatose Dextrose Broth) không bổ sung agar, nước cất vừa đủ 1 lít, pH 7-7,4.

Môi trường cám gạo dịch thể: 10g cám gạo và 90ml nước sạch trong bình tam giác dung tích 250 ml, điều chỉnh về pH 3,5 bằng HCl 10%.

Môi trường lên men xốp: Cân 10g cám gạo cho vào bình tam giác 250ml, điều chỉnh độ ẩm 30% (w/v) bằng HCl 0,01%.

Các nguyên liệu khác: cám mì, cám gạo, vỏ trấu, mùn cưa, glucose, maltose, tinh bột gạo, sucrose, ure, cao nấm men, tryptone, peptone, NH4Cl, NH4NO3…. được sử dụng.

Dụng cụ: Bình tam giác, ống nghiệm, đĩa petri, que cấy, que gạt, đèn cồn, cốc thủy tinh, pipette, đầu típ, ống falcon, ống eppendorf, thùng lên men…

Máy móc, thiết bị: tủ cấy vô trùng, máy lắc, tủ sấy, máy trộn, máy đo pH, máy ly tâm…

Các môi trường dùng nuôi cấy vi sinh vật được khử trùng ở 115oC trong 30 phút trước khi sử dụng.

3.2.1.2. Phương pháp

a. Phương pháp hoạt hóa và nuôi cấy nấm sợi

Giống gốc là bào tử của chủng nấm sợi Aspergillus niger A45.1 (trong ống eppendorf) bảo quản trong glycerol 30%, điều kiện lạnh sâu (-700C). Trước khi đem giống gốc đi hoạt hóa cần để ở nhiệt độ phòng trong khoảng 30 phút. Tiến hành pha loãng giống gốc bằng nước cất vô trùng đến nồng độ 10-5, 10-6, 10-7. Mỗi độ pha loãng hút 100µl vào đĩa petri có môi trường PDA đã chuẩn bị, tiến hành cấy trải bằng que cấy trang. Ủ các đĩa nuôi cấy ở điều kiện phòng khoảng 5-7 ngày. Kiểm tra độ thuần khiết của các khuẩn lạc nấm.

b. Phương pháp gây đột biến

Tiến hành gây đột biến ngẫu nhiên chủng nấm sợi Aspergillus niger A45.1 bằng tác nhân hóa học NTG kết hợp với tia UV để tạo dòng nấm sợi có khả năng sinh tổng hợp α- amylase, glucoamylase và cellulase cao:

Chủng nấm sợi Aspergillus niger A45.1 được nuôi cấy trong môi trường PDB ở 28oC, 200 vòng/phút, sau 5 ngày thu 2ml dung dịch bào tử (107 bào tử/ml), ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC), thu bào tử, loại dịch nổi. (Phương pháp đếm bào tử - phụ lục 3). Bào tử được hòa vào 500µl dung dịch NTG và lắc kỹ. Đổ dung dịch vào đĩa petri (9cm x 1,5 cm), bật tia UV (50 Watte), khoảng cách từ nguồn UV đến đĩa là 30 cm. Sau 30, 60, 90, 120 và 180 phút chiếu UV, 50 µl dịch đã chiếu được hút cho vào các ống eppendorf và được rửa bằng nước muối sinh lý 3 lần, sau đó pha loãng bằng nước cất vô trùng và cấy trải trên môi trường PDA có bổ sung ampicillin (100mg/l), nuôi cấy ở 30oC trong 4-6 ngày. Sau khi nấm đã mọc, đếm số lượng khuẩn lạc trên đĩa thí nghiệm và đối chứng (không gây đột biến) để dựng đồ thị về tỷ lệ (%) sống sót của bào tử sau chiếu UV. Từ các đĩa

nấm đã mọc, nhặt ngẫu nhiên các khuẩn lạc/liều gây đột biến, cấy trên đĩa PDA, ủ ở 30oC trong 7 ngày, sau đó tiến hành xác định hoạt tính thủy phân tinh bột và xơ (CMC) trên đĩa thạch. Tuyển chọn các chủng đột biết có tiềm năng sinh enzyme thủy phân tinh bột và xơ, lên men để xác định hoạt tính enzyme theo phương pháp được mô tả bởi Vũ Văn Hạnh & cs. (2012) và Kaur & cs. (2014).

c. Phương pháp lên men xốp và chiết tách enzyme thô

Tiến hành lên men sản xuất enzyme theo mô tả của Vu & cs. (2011) có cải tiến về việc sử dụng cơ chất. Cấy (1x1 cm2) nấm sợi đã nuôi 7 ngày tuổi từ đĩa thạch PDA vào bình tam giác 250 ml chứa môi trường cám gạo dịch thể (10%, w/v), nuôi lắc 200 vòng/phút, ở 30oC, sau 3 ngày thu giống cấp 1. Lấy 10% giống cấp 1 trộn vào môi trường lên men xốp (10g cám gạo, độ ẩm 30%), trộn đều, trong 5 ngày ở nhiệt độ phòng.

Lấy 1g sản phẩm sau 5 ngày lên men xốp trộn với 9 ml nước cất vô trùng đựng trong ống falcol 50 ml. Hỗn hợp được lắc 200 vòng/phút, ở 30oC trong 60 phút, ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút, thu dịch nổi và sử dụng làm nguồn enzyme thô.

d. Phương pháp xác định hoạt tính cellulase, α-amylase và glucoamylase

Hoạt tính của α-amylase, glucoamylase và cellulase sau lên men xốp được xác định theo mô tả của Grajek (1987) và Vu & cs. (2010): 1 ml hỗn hợp phản ứng gồm 50µl enzyme pha loãng và 50µl carboxymethyl cellulose 1% (w/v) (CMC; Sigma, St. Louis, MO, USA) hoặc hồ tinh bột 1% trong đệm axetat (50 mM, pH 5). Hỗn hợp phản ứng được ủ tại 50oC trong 30 phút và đường khử sau phản ứng được xác định bằng phương pháp xác định hàm lượng đường khử (Miller, 1959).

e. Phương pháp xác định hàm lượng đường khử (Miller, 1959)

Nguyên tắc: Dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử DNS. Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ đường khử. Đo OD ở bước sóng 540nm.

Hóa chất: Thuốc thử DNS: Cân 5g DNS pha bổ sung thêm 300ml nước cất, đun từ từ đến khoảng 500C. Tiếp tục bổ sung 8g NaOH, khuấy đều, cho thêm 150g muối sodium potassium tartrate - KNaC4H4O6. Bổ sung từ từ nước cất cho đến thể tích 500ml. Đun dần cho đến 1000C, lắc đều cho đến khi các hóa chất tan hết.

Hồ tinh bột 1%: Chuẩn bị khoảng 100ml dung dịch hồ tinh bột 1% bằng cách cân 1g tinh bột cho vào bình pyrex, thêm tiếp 100ml nước cất. Sau đó cho quay trong lò vi sóng khoảng 5 phút để tinh bộ được hồ hóa.