Nghiên cứu nâng cấp tiêu chuẩn dược liệu rễ Ba kích Radix Morindae officinalis của Việt Nam

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

ADN : Acid Deoxyribo Nucleic

ARN : Acid ribonucleic

: Amplified Fragment Length Polymorphism – Đa hình độ dài các

AFLP

đoạn được nhân bản chọn lọc

APG II : Angiosperm Phylogeny Group II - Nhóm phát sinh chủng loài thực vật hạt kín

ARS : ASEAN Reference Standards - Chất chuẩn khu vực ASEAN CBOL : Consortium for the Barcode of Life

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 226 trang tài liệu này.

cpDNA : Chloroplast Deoxyribo Nucleic Acid - Bộ gen lục lạp

ptDNA : Plasma tumor Deoxyribo Nucleic Acid - Bộ gen lạp thể DĐVN : Dược điển Việt Nam

DNA : Deoxyribo Nucleic Acid

dNTP : Deoxynucleoside triphosphate

dATP : Deoxyadenosine triphosphate

dCTP : Deoxycytidine triphosphate

dGTP : Deoxyguanosine triphosphate

EDTA : Ethylenediaminetetraacetic acid

ELSD : Evaporative light scattering detector - Detector tán xạ bay hơi EPRS : EP Reference Standards - Chất chuẩn Dược điển Châu Âu ETS : External transcribed spacer – Vùng sao mã ngoài gene

: Diễn đàn hòa hợp về thuốc thảo dược của các nước Tây Thái Bình

FHH

Dương

HPLC-DAD

: Sắc ký lỏng hiệu năng cao detector mảng diod

HPLC-ELSD : Sắc ký lỏng hiệu năng cao detector tán xạ bay hơi

FOS : Fructo Oligo Saccharid

ICRS : Chất chuẩn Dược điển Quốc tế

IGS : Intergenic spacer – vùng chen giữa các gene

IR : Vùng gen lặp lại đảo ngược (inverted repeat - IR)

ISSR : Inter-Simple Sequence Repeats – Chuỗi lặp lại đơn giản giữa ITS : Internal transcribed spacer

KNV : Kiểm nghiệm viên

LDL : Low density lipoprotein

LSC : large single copy – vùng đơn gen lớn

matK : Maturase K

MeOH : Methanol

mRNA : Messenger Ribonucleic acid

NCBI : National Center for Biotechnology Information PTN : Phòng thử nghiệm

PCR : Polymerase chain reaction – Kỹ thuật khuếch đại gen QTL : Quantiative Trait loci

RAPD : Random Amplified Polymorphic DNA

rbcL : Rubisco large subunit gene

SKLM : Sắc ký lớp mỏng

SSC : Small single copy - Vùng đơn gen nhỏ

TBE : Tris/Borate/EDTA

TCCL : Tiêu chuẩn chất lượng

TLC : Thin layer chromatography – Sắc ký lớp mỏng TIS : Transcription start site – Điểm khởi đầu sao chép TRIS : Tris(hydroxymethyl)aminomethane

USPRS : USP Reference Standards - Chất chuẩn Dược điển Mỹ UV-VIS : Ultraviolet-Visible - Tử ngoại – khả kiến

WHO : World health organization - Tổ chức Y tế thế giới

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU

Bảng 1.1. Vị trí phân loại của chi Morinda 3

Bảng 1.2. Tóm tắt chuyên luận dược liệu rễ Ba kích trong Dược điển 5

Bảng 1.3. Chương trình gradient dung môi định lượng nystose 11

Bảng 1.4. Một số đơn vị cung cấp chất chuẩn monotropein và nystose 13

Bảng 2.1. Danh mục mã hoá các mẫu Ba kích 25

Bảng 2.2. Nội dung thẩm định phương pháp định tính, định lượng monotropein [52]

..........................................................................................................................29

Bảng 2.3. Nội dung thẩm định phương pháp định lượng nystose [52] 34

Bảng 2.4. Chương trình gradient pha động sắc ký lỏng điều chế 38

Bảng 2.5. Nồng độ các thành phần tham gia phản ứng 45

Bảng 2.6. Các mồi chung cho các trình tự ITS và các gen trên chloroplast 46

Bảng 2.7. Chương trình PCR cho đoạn mồi của ITS1-ITS4 [84] 46

Bảng 2.8. Chương trình PCR cho đoạn mồi của ITS U4-ITS P5 [36] 46

Bảng 2.9. Chương trình PCR cho đoạn mồi của matK 1326R-390F [39] 47

Bảng 2.10. Chương trình PCR cho đoạn mồi của rcbLaF-rcbLaR [54], [56] 47

Bảng 2.11. Chương trình PCR cho đoạn mồi của trnH-pbsA [48] 47

Bảng 2.12. Nồng độ các thành phần tham gia phản ứng giải trình tự đoạn gen 48

Bảng 3.1. Độ thích hợp hệ thống sắc ký phương pháp định lượng monotropein 49

Bảng 3.2. Kết quả khảo sát độ tuyến tính của phương pháp định lượng monotropein

..........................................................................................................................50

Bảng 3.3. Kết quả khảo sát độ chính xác của phương pháp định lượng monotropein trong nguyên liệu 51

Bảng 3.4. Kết quả khảo sát độ chính xác của phương pháp định lượng monotropein trong dược liệu BK5 52

Bảng 3.5. Kết quả đánh giá độ đúng của phương pháp định lượng monotropein trong nguyên liệu 52

Bảng 3.6. Kết quả khảo sát độ đúng phương pháp định lượng monotropein trong dược liệu BK5 53

Bảng 3.7. Độ thích hợp hệ thống phương pháp định lượng nystose 54

Bảng 3.8. Kết quả khảo sát độ tuyến tính phương pháp định lượng nystose 56

Bảng 3.9. Kết quả độ chính xác trung gian của phương pháp định lượng nystose trong nguyên liệu 57

Bảng 3.10. Kết quả độ chính xác của phương pháp định lượng nystose trong dược liệu BK5 58

Bảng 3.11. Kết quả khảo sát độ đúng phương pháp định lượng nystose trong nguyên liệu 58

Bảng 3.12. Kết quả khảo sát độ đúng phương pháp định lượng nystose trong dược liệu BK5 59

Bảng 3.13. Số liệu phổ 1H-NMR (D2O, 500 MHz) của chất phân tích và tham khảo

*(D2O, 600 MHz) 66

Bảng 3.14. Số liệu phổ 13C-NMR (D2O, 125 MHz) của chất phân tích và tham khảo

*(D2O, 100 MHz) 67

Bảng 3.15. Kết quả mất khối lượng do làm khô của nguyên liệu monotropein 68

Bảng 3.16. Kết quả xác định tạp chất trong nguyên liệu monotropein 69

Bảng 3.17. Tóm tắt tiêu chuẩn chất lượng chất chuẩn monotropein 70

Bảng 3.18. Số lượng lọ chuẩn monotropein 70

Bảng 3.19. Kết quả đánh giá đồng nhất lô chất chuẩn monotropein 71

Bảng 3.20. Kết quả đánh giá liên phòng chất chuẩn monotropein 72

Bảng 3.21. Kết quả hàm lượng chất chuẩn monotropein 72

Bảng 3.22. Kết quả định lượng độ ổn định chất chuẩn monotropein (6 tháng) 73

Bảng 3.23. Kết quả định lượng độ ổn định chất chuẩn monotropein (1 năm) 74

Bảng 3.24. Kết quả xác định tạp chất liên quan độ ổn định chất chuẩn monotropein (6 tháng) 74

Bảng 3.25. Kết quả xác định tạp chất liên quan độ ổn định chất chuẩn monotropein

(1 năm) 74

Bảng 3.26. Tổng hợp kết quả nghiên cứu độ ổn định chất chuẩn monotropein sau 1

năm 75

Bảng 3.27. Kết quả mất khối lượng do làm khô của nguyên liệu nystose 76

Bảng 3.28. Tóm tắt tiêu chuẩn chất lượng chất chuẩn nystose 77

Bảng 3.29. Số lượng lọ chất chuẩn nystose 78

Bảng 3.30. Kết quả đánh giá đồng nhất lô chất chuẩn nystose 78

Bảng 3.31. Kết quả đánh giá liên phòng chất chuẩn nystose 79

Bảng 3.32. Kết quả hàm lượng chất chuẩn nystose 79

Bảng 3.33. Kết quả định lượng nghiên cứu độ ổn định chất chuẩn nystose (6 tháng)

..........................................................................................................................80

Bảng 3.34. Kết quả định lượng nghiên cứu độ ổn định chất chuẩn nystose (1 năm)

..........................................................................................................................81

Bảng 3.35. Tổng hợp kết quả nghiên cứu độ ổn định chất chuẩn nystose sau 1 năm

..........................................................................................................................82

Bảng 3.36. Kết quả định lượng monotropein trong dược liệu rễ Ba kích 83

Bảng 3.37. Kết quả định lượng nystose trong dược liệu rễ Ba kích 84

Bảng 3.38. Kết quả đo mật độ quang của dịch tách chiết ADN toàn phần 86

Bảng 3.39. Kết quả BLAST search trên NCBI của trình tự ITS 87

Bảng 3.40. Kết quả BLAST search trên NCBI của trình tự matK 88

Bảng 3.41. Kết quả BLAST search trên NCBI của trình tự rbcL 88

Bảng 3.42. Kết quả BLAST search trên NCBI của trình tự trnH-pbsA 88

Bảng 3.43. Kết quả so sánh độ tương đồng và độ phủ của các mẫu Ba kích so với M. officinalis KR869730 và M. officinalis AY551330 89

Bảng 3.44. Khoảng cách di truyền của các mẫu trên trình tự ITS 90

Bảng 3.45. Khoảng cách di truyền giữa các mẫu trên trình tự matK 91

Bảng 3.46. Khoảng cách di truyền giữa các mẫu trên trình tự rbcL 92

Bảng 3.47. Khoảng cách di truyền giữa các mẫu trên trình tự trnH-psbA 93

Bảng 3.48. Tóm tắt các chỉ tiêu bổ sung vào chuyên luận dược liệu rễ Ba kích của Dược điển Việt Nam 94

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của monotropein [14] 6

Hình 1.2. Công thức cấu tạo của nystose [85] 8

Hình 1.3. Sơ đồ và các chu kỳ của phản ứng chuỗi polymerase [15] 17

Hình 1.4. Vị trí các vùng ITS trên cụm đa gen 18S–5.8S–26S rRNA [70] 19

Hình 1.5. Vị trí các gen trên cpDNA của Trifolium subterraneum [88] 21

Hình 1.6. Vị trí tương đối của matK so với trnK trên cpDNA [75] 22

Hình 3.1. Sắc ký đồ xác định độ đặc hiệu của phương pháp định tính, định lượng monotropein 50

Hình 3.2. Sắc ký đồ giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của monotropein 54

Hình 3.3. Độ đặc hiệu phương pháp định lượng nystose trong nguyên liệu 55

Hình 3.4. Độ đặc hiệu phương pháp định lượng nystose trong dược liệu rễ Ba kích

..........................................................................................................................56

Hình 3.5. Kết quả đánh giá độ đặc hiệu phương pháp định tính nystose trong dược liệu rễ Ba kích 60

Hình 3.6. Quy trình chiết xuất dịch chiết toàn phần 61

Hình 3.7. Sơ đồ phân lập, tinh chế monotropein từ cao chiết MeOH 63

Hình 3.8. Sơ đồ phân lập, tinh chế nystose từ cao chiết nước 65

Hình 3.9. Công thức cấu tạo của monotropein 66

Hình 3.10. Công thức cấu tạo của nystose 67

Hình 3.11. Sắc ký đồ tạp chất liên quan monotropein 69

Hình 3.12. Chất chuẩn monotropein, SKS: 0119.C005.01 73

Hình 3.13. Sắc ký đồ SKLM thử tạp chất liên quan nguyên liệu nystose 76

Hình 3.14. Chất chuẩn nystose, SKS: 0119.C006.01 80

Hình 3.15. Kết quả thử tạp chất liên quan nghiên cứu độ ổn định chất chuẩn nystose

..........................................................................................................................82

Hình 3.16. Kết quả điện di tách chiết ADN toàn phần 85

Hình 3.17. Kết quả khuếch đại đoạn ITS với đoạn mồi ITS P5- ITS U4 và ITS4-ITS1

..........................................................................................................................86

Hình 3.18. Kết quả khuếch đại đoạn gen trên chloroplast 87

Hình 3.19. Kết quả gióng hàng trên trình tự ITS 89

Hình 3.20. Kết quả gióng hàng trên trình tự matK 90

Hình 3.21. Kết quả gióng hàng trên trình tự rbcL 91

Hình 3.22. Kết quả gióng hàng trên trình tự trnH-psbA 92