- Ở nồng độ 10-4 toàn bộ số phôi trứng chết trong ngày thứ hai, trong khoảng 40-48 giờ sau khi nhiễm.
- Nồng độ 10-5 cũng giết chết toàn bộ phôi trứng nhưng trong thời gian lâu
hơn so với nồng độ 10-3 và 10-4, nhưng cũng không quá 2h kể từ khi gây nhiễm.
- Ở nồng độ 10-6 có phôi thường chết trong vòng 2 - 96h . Ở độ pha loãng này thường vẫn có 1 -2 phôi vẫn còn sống (tùy theo lần thí nghiệm khác nhau).
- Nồng độ pha loãng cao nhất gây chết phôi trứng là 10-7, tuy nhiên chỉ có
1 phôi chết thời điểm 96h , và 4 phôi vẫn còn sống. Ở nồng độ pha loãng cao nhất là 10-8, toàn bộ số phôi trứng đều sống bình thường.
- Đối chứng âm: các phôi trứng sống khỏe mạnh, bình thường.
Kết quả tính chuẩn độ của virus A/chicken/Vietnam/NCVD-016/2008 lần lượt sau 3 lần là: lần 1 - 107EID50, lần 2 – 106,9EID50 và lần 3 – 106,9EID50 đối với liều sử d ng gây nhiễm là 100 µl. Tính trung bình chuẩn độ của virus trên phôi gà là 107,9EID50/ml.
1
2
3
4
5 6
7
8
9 10 11 12
Hình 3.6. Ki t đặc tính gây ngưng kết hồng cầu (phản ứng HA)
Để xác định khả năng gây nhiễm phôi trứng của virus A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008, chúng tôi thu dịch niệu mô (allantoic
fluid) của toàn bộ số phôi chết và phôi sống và kiểm tra đặc tính ngưng kết hồng cầu (HA) với hồng cầu gà (xem hình 3.6).
Kết quả cho thấy chỉ có dịch niêu mô thu thập từ phôi trứng chết mới có khả năng gây ngưng kết hồng cầu gà, với hiệu giá HA của dịch niệu mô thường đạt từ 8-9log2. Kết quả này cũng tương tự với nghiên cứu của Wanasawaeng và cộng sự (2009) (Wanasawaeng và cs, 2009) khi nghiên cứu một chủng virus cúm A/H5N1 của Thái Lan (ký hiệu C210 Dx1) phân lập năm 2004.
Dịch niêu mô thu thập từ phôi trứng sống (kể cả phôi sống các nồng độ 10-6 và 10-7) không có khả năng gây ngưng kết hồng cầu gà (Xem hình 3.6). Vì vậy có thể nhận định r ng liều gây nhiễm phôi trứng gà (EID-Egg Infectious Dose) cũng chính là liều gây chết phôi (ELD-Egg Lethal Dose).
48giờ
72giờ
Đ i chứng
Phôi đối chứng |
Có thể bạn quan tâm!
-
Cây Phả Hệ Dự Chuỗi Nucleotide Gen H5 Củ Những I C A/h5N1 Cl De 7 (Được Lập Bằng Phương Ph P Phân Tích Neighbor- -
Hiện Tượng Chèn À Xó C C Xit In Tại Vị T Í Cle Ge Ite Củ C C Chủng I A/h5N1 Cl De 7 Phân Lập Ở Việt N -
Cây Phả Hệ Dự T Ên Chuỗi Nucleotide Gen M Củ C C Chủng I A/h5N1 Clade 7 (Được Lập Bằng Phương Ph P Phân Tích Neighbo -Joining Sử Dụng Phần Mề Mega 5, Gi T -
Kết Quả Đ Nh Gi Đ C Lực Của Virus C A/h5N1C A/h5N1 Cl De 7 T Ên Gi Cầm -
Kết Quả Đ Nh Gi Đ Bài Thải Củ I T Ên Đ Ng Vật Thí Nghiệm Gây Nhiễ -
X C Định Đặc Tính Kh Ng Ng Yên Củ C C Chủng I C A/h5N1 Cl De 7 Phân Lập Ở Việt N
Xem toàn bộ 162 trang tài liệu này.
Hình 3.7. Bệnh tích ph i khi gây nhiễ bằng chủng i c A/H5N1 cl de 7 phân lập tại Việt N
Bên cạnh việc kiểm tra đặc tính ngưng kết hồng cầu, chúng tôi cũng tiến hành mổ trứng, thu phôi để kiểm tra bệnh tích phôi. Toàn bộ số phôi trứng chết đều có triệu chứng xuất huyết lan tràn, phôi còi cọc, phát triển kém. Phôi đối
chứng phát triển bình thường (xem hình 3.7). Kết quả của thí nghiệm này cho thấy virus cúm A/H5N1clade 7 - A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008 có khả năng thích ứng tốt trên phôi trứng gà và đạt được hiệu giá tối ưu trung bình là 107,9EID50/ml (106.9-107,0 EID500,1ml (bảng 3.10).
3.3.2. Tính thích ứng t ên tế bào xơ ph i gà (x c định ch s TCID50)
Bên cạnh việc xác định tính thích ứng của virus cúm A/H5N1 clade 7 trên phôi trứng gà, chúng tôi cũng tiến hành song song việc xác định tính thích ứng của virus này trên tế bào xơ phôi gà (CEF).
Chúng tôi sử d ng phôi trứng gà 8 ngày tuổi đã kiểm tra khỏe mạnh, bình thường, mổ trứng và thu hoạch phôi để chế môi trường tế bào CEF. Tế bào CEF được chuẩn bị trên chai T đã phát triển thành lớp sau khi nuôi dưỡng b ng môi trường MEM với 5% huyết thanh thai bê (FBS). Sử d ng trypsine để tách tế bào khỏi thành chai nuôi cấy và tách rời thành từng tế bào và chuyển sang đĩa nuôi cấy tế bào 96 giếng để tiến hành chuẩn độ virus.
Chúng tôi cũng sử d ng virus được pha loãng như khi chuẩn độ trên phôi gà và sử d ng các nồng độ 10-2 - 10-8 để chuẩn độ virus. Mỗi nồng độ virus đã pha loãng được nhiễm cho 5 giếng với lượng 100 µl trên giếng. Đĩa tế bào đã nhiễm virus được nuôi trong tủ ấm 370C có %CO2. Nuôi đĩa tế bào trong vòng ngày và theo dõi hàng ngày để quan sát bệnh tích tế bào (CPE).
Bảng 3.11. Theo dõi thời gi n i gây nhiễ lên tế bào CEF
Số giếng gây nhiễm | Theo dõi số giếng có CPE | Tổng số giếng có CPE | Tỷ lệ (%) | ||||
0-24 h | 25-48 h | 49-72 h | 73-96h | ||||
1 | 30 | 0 | 10 | 14 | 0 | 24 | 80 |
2 | 30 | 0 | 10 | 13 | 0 | 24 | 80 |
3 | 30 | 0 | 10 | 13 | 0 | 23 | 77 |
- Từ nồng độ pha loãng 10-2 đến nồng độ 10-5 toàn bộ các giếng tế bào đều có CPE và thảm tế bào đã bị virus phá hủy trong vòng 24-72 giờ. Đặc biệt nồng độ 10-2 và 10-3 thảm tế bào bị phá hủy hoàn toàn sau 24 giờ nhiễm.
Lần thí nghiệm | Hiệu giá pha loãng | Số giếng gây nhiễm | Số có CPE | Số giếng không có CPE | Số tích lũy | Tỷ lệ nhiễm virus (%) A (A+B) × 100 | ||
Nhiễm virus (A) | Không nhiễm (B) | Tổng cộng (A+B) | ||||||
Lần 1 | 10-2 | 5 | 5 | 0 | 24 | 0 | 24 | 100 |
10-3 | 5 | 5 | 0 | 19 | 0 | 19 | 100 | |
10-4 | 5 | 5 | 0 | 14 | 0 | 14 | 100 | |
10-5 | 5 | 5 | 0 | 9 | 0 | 9 | 100 | |
10-6 | 5 | 2 | 3 | 4 | 3 | 7 | 57.1 | |
10-7 | 5 | 2 | 3 | 2 | 6 | 8 | 25 | |
10-8 | 5 | 0 | 5 | 0 | 11 | 11 | 0 | |
ĐC (-) | 5 | 0 | 5 | |||||
TCID50/0,1ml | 106,2 | |||||||
Lần 2 | 10-2 | 5 | 5 | 0 | 24 | 0 | 24 | 100 |
10-3 | 5 | 5 | 0 | 19 | 0 | 19 | 100 | |
10-4 | 5 | 5 | 0 | 14 | 0 | 14 | 100 | |
10-5 | 5 | 5 | 0 | 9 | 0 | 9 | 100 | |
10-6 | 5 | 4 | 1 | 4 | 1 | 5 | 80 | |
10-7 | 5 | 0 | 5 | 0 | 6 | 6 | 0 | |
10-8 | 5 | 0 | 5 | 0 | 11 | 11 | 0 | |
ĐC (-) | 5 | 0 | 5 | |||||
TCID50/0,1ml | 106,4 | |||||||
Lần 3 | 10-2 | 5 | 5 | 0 | 23 | 0 | 23 | 100 |
10-3 | 5 | 5 | 0 | 18 | 0 | 18 | 100 | |
10-4 | 5 | 5 | 0 | 13 | 0 | 13 | 100 | |
10-5 | 5 | 5 | 0 | 8 | 0 | 8 | 100 | |
10-6 | 5 | 3 | 2 | 3 | 2 | 5 | 60 | |
10-7 | 5 | 0 | 5 | 0 | 7 | 7 | 0 | |
10-8 | 5 | 0 | 5 | 0 | 12 | 12 | 0 | |
ĐC (-) | 5 | 0 | 5 | |||||
TCID50/0,1ml | 106,2 | |||||||
Bảng 3.12. Kết quả theo dõi bệnh tích tế bào t ên CEF khi gây nhiễm virus A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008
- Ở nồng độ pha loãng 10-6 thường chỉ có 2-4 giếng có hiện tượng virus phá hủy gây nên bệnh tích tế bào (CPE).
- Ở nồng độ pha loãng 10-7 chỉ có 2 giếng nhiễm virus lần thí nghiệm thứ nhất, lần thứ 2 và 3 không có giếng nào nhiễm virus.
- Ở nồng độ pha loãng 10-8 không có giếng tế bào nào có hiện tượng thảm tế bào bị phá hủy, không có CPE, tức là không có hiện tượng nhiễm virus.
Với kết quả chuẩn độ trên, chúng tôi tính được chuẩn độ trung bình của virus cúm A H N1 clade trên tế bào xơ phôi gà (CEF) qua các lần chuẩn độ là: lần 1 – 106,22TCID50, lần 2 – 106,4TCID50 và lần 3 – 106,2TCID50 đối với liều sử d ng gây nhiễm là 100 µl. Tính trung bình chuẩn độ của virus trên tế bào xơ phôi gà là 107,3TCID50/ml.
Như vậy, với kết quả chuẩn độ virus cúm A/H5N1 clade 7 (A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008) thực hiện trên phôi trứng gà và tế bào xơ phôi gà, chúng tôi nhận thấy virus này có thể thích nghi, phát triển tốt trên cả 2 môi trường trên, và chuẩn độ của virus trên 2 môi trường nuôi dưỡng này là khá tương đồng với nhau: 107,9EID50 và 107,3TCID50.
Song song với việc sử d ng tế bào xơ phôi gà (CEF-Chicken Embryo Fibroblast), chúng tôi cũng thử nghiệm sử d ng tế bào xơ phôi vịt (DEF-Duck Embryo Fibroblast) và tế bào xơ phôi ngan ( DEF-Muscovy Duck Embryo Fibroblast) tiến hành việc gây nhiễm và chuẩn độ virus cúm A/H5N1 clade 7 trên. Kết quả thí nghiệm cho thấy virus này cũng có thể nhiễm và phát triển tốt trên 2 loại tế bào này xơ phôi vịt và xơ phôi ngan.
Kết quả chuẩn độ cho thấy virus cúm A H N1 clade có hiệu giá 107,3TCID50 và 106,7TCID50 lần lượt trên 2 loại tế bào DEF và DEF (kết quả chi tiết không trình bày). Ngoài ra virus A H N1 clade cũng phát triển tốt trên môi trường tế bào dòng DCK ( ardine Darby Canine Kidney) mà không cần xử lý tripsine TPCK.
o nhiễ virus (có P ) | |
o đối chứng | o nhiễ virus(có P ) |
Hình 3.8. Hình ảnh tế bào CEF à DEF khi phân lập à ch ẩn đ i | |
3.3.3. Kết quả x c định đ c lực củ i c A/H5N1 clade 7
3.3.3.1. Th ng đ c lực dự t ên đặc tính phân tử
Như đã trình bày trong phần tổng quan về virus cúm gia cầm, độc lực và mức độ lây nhiễm của virus cúm trên gia cầm ph thuộc vào tác động của enzyme protease của vật chủ đến sự phá vỡ các liên kết hóa học sau khi dịch mã của phân tử liên kết, và tính th cảm của ngưng kết tố (Hemagglutinin) và sự phá vỡ liên kết của enzyme protease ph thuộc vào số lượng các axit amin cơ bản tại
điểm bắt đầu phá vỡ liên kết tức là tại vùng chuỗi nối của gen HA của virus, đó là các axit amin arginine ( ) và lysine (K).
Khi giải trình tự gen HA, chúng tôi cũng đồng thời xác định mức độ có mặt và số lượng của các axit amin cơ bản Arginine và lysine tại vùng “cleavage site” của các chủng virus cúm A/H5N1 clade 7. Kết quả trình tự vùng chuỗi nối của chủng virus đại diện cho clade của Việt Nam là A/Chicken/Vietnam/NCVD-016 2008 và một số virus cúm A/H5N1 thuộc một số clade khác được so sánh tại bảng 3.13.
Bảng 3.13. C c xit in ùng “cle ge ite” củ i c H5N1 đ c lực cao cl de 7 à t s chủng virus tha chiế
Clade | Nơi phân lập | HA0 cleavage site | |||
A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008 | 7 | iệt a | PQREGGRRRKR*GLF | ||
A/goose/Guangdong/1/96 | 0 | Trung Quốc | PQRERRRKKR*GLF | ||
A/Hong_Kong/213/03 | 1 | Hong Kong | PQRERRRKKR*GLF | ||
A/chicken/Vietnam/15/2007 | 1 | Việt Nam | PQREGRRKKR*GLF | ||
A/chicken/Egypt/9403/2007 | 2.2 | Ai Cập | PQGERRRKKR*GLF | ||
A/chicken/Primorje/1/2008 | 2.3.2 | Nga | PQRERRRKR*GLF | ||
A/duck/Vietnam/568/2005 | 2.3.2 | Việt Nam | PQRERRRKR*GLF | ||
A/Anhui/1/2005 | 2.3.4 | Trung Quốc | PLRERRRKR*GLF | ||
A/duck/Vietnam/37/2007 | 2.3.4 | Việt Nam | PLRERRRKR*GLF | ||
A/chicken/Yunnan/493/2005 | 2.4 | Trung Quốc | PQRERRRKR*GLF | ||
A/crow/Osaka/102/2004 | 2.5 | Nhật Bản | PQRE-RRKKR*GLF | ||
A/Pheasant/Hong_Kong/FY155/01 | 3 | Hong Kong | PQRERRRKKR*GLF | ||
A/goose/Guiyang/337/2006 | 4 | Trung Quốc | PQRERRRKKR*GLF | ||
A/duck/Guangxi/668/2004 | 5 | Trung Quốc | PQREIRRKKR*GLF | ||
A/chicken/Yichang/lung-1/04 | 6 | Trung Quốc | PQRERRRKKR*GLF | ||
A/chicken/Shanxi/2/2006 | 7 | Trung Quốc | PQREGGRRKR*GLF | ||
A/Chicken/Hong_Kong/YU22/2002 | 8 | Hong Kong | PQRERRRKKR*GLF | ||
A/goose/Shantou/1621/05 | 9 | Trung Quốc | PQRERRRKKR*GLF | ||
Ch thích: * bi u th v trí HA0 t i chuỗi nối (cleavage site) giữa H 1 và H 2
Cũng tương tự các virus cúm A H N1 độc lực cao thuộc các clade HA khác (clade 0 – clade 9), chủng virus cúm A/H5N1 clade 7 (A/Chicken/Vietnam/NCVD-016 2008) cũng có motif chứa nhiều axit amin cơ bản như arginine và lysine tại vùng chuỗi nối. Như vậy đây là chỉ thị cho thấy virus cúm A H N1 này được xếp loại vào nhóm virus cúm có độc lực cao đối với gia cầm (HPAI).
3.3.3.2. Đ nh gi đ c lực t ên đ ng vật thí nghiệm
Như đã trình bày trên, chúng tôi đã phân lập được 5 mẫu virus cúm A/H5N1 clade , nhưng để đánh giá độc lực của virus này chúng tôi chỉ sử d ng một chủng virus là A Chicken Vietnam NCVD-016 2008 vì qua phân tích phát sinh loài (phylogeny) dựa trên gen HA, virus này n m tại gốc của nhóm các chủng virus A H N1 clade của Việt Nam và gần nhất với các virus cúm A/H5N1 clade 7 Trung Quốc.
Trước khi tiến hành gây bệnh, toàn bộ động vật thí nghiệm được lấy máu, chắt huyết thanh và kiểm tra kháng thể cúm gia cầm H5 b ng kháng nguyên cúm gia cầm H5N1 (A/Chicken/Scotland/59). Đây là kháng nguyên được các phòng thí nghiệm thuộc hệ thống của C c Thú y sử d ng để đánh giá kết quả tiêm phòng. Kết quả kiểm tra đã xác định toàn bộ số động vật thí nghiệm đều âm tính kháng thể cúm gia cầm H , và đảm bảo đủ điều kiện để thực hiện thí nghiệm gây bệnh đánh giá độc lực virus cúm A/H5N1 clade 7.
Động vật được đánh số để theo dõi theo chi tiết từng con. Mỗi động vật thí nghiệm được gây nhiễm với liều 106TCID50100µl virus cúm A H N1clade qua đường nhỏ mũi (virus được lưu giữ tủ -860C, lấy ra và
chuẩn bị ngay trước khi tiến hành gây nhiễm). Thí nghiệm được lặp lại 2 lần. Kết quả tổng hợp theo dõi thí nghiệm đánh giá độc lực của virus A/Chicken/Vietnam/NCVD-016 2008 được trình bày trong bảng 3.14.