Hình 3.3. Hiện tượng chèn à xó c c xit in tại vị t í cle ge ite củ c c chủng i A/H5N1 cl de 7 phân lập ở Việt N
3.2.2. Giải t ình tự gen NA(N1) à phân tích cây phả hệ dự t ên ch ỗi nucleotide của gen N1
Gen NA của virus cúm gia cầm cùng với gen HA đã tạo nên kháng nguyên trên bề mặt capsid. Vì vậy, song song với việc giải trình tự gen H , chúng tôi cũng tiến hành giải trình tự và phân tích gen N1 đối với 5 mẫu virus cúm A/H5N1 clade mà chúng tôi đã phân lập được. Tên của 0 chủng virus mà chúng tôi đã giải trình tự gen N1 c thể như sau:
- A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008
- A/Chicken/Vietnam/NCVD-093/2008
- A/Chicken/Vietnam/NCVD-03/2008
- A/Chicken/Vietnam/NCVD-04/2008
- A/Chicken/Vietnam/NCVD-05/2008
Chiều dài của đoạn gen N1 của các mẫu virus cúm A/H5N1clade 7 đã giải trình tự là 1346 nucleotide, mã hóa cho 448 axit amin, kh i đầu b ng bộ mã ATG. Trình tự nucleotide của gen N1 của các chủng virus này được so sánh với
chuỗi gen N1 tương ứng của một số chủng virus cúm A/H5N1của Việt Nam và Trung Quốc phát hiện trong giai đoạn 1996-2010 gồm có chủng virus A/goose/Guangdong 1 96 được coi là thủy tổ của virus cúm A/H5N1 độc lực cao. Cùng với sự so sánh sự khác biệt về chuỗi nucleotide giữa các chủng virus chúng tôi tiến hành lập cây phả hệ của gen N1 dựa trên chuỗi nucleotide và kết quả được biểu diễn hình 3.4. Các chủng virus A H N1 sử d ng để lập cây phát sinh loài cùng với các chủng virus A H N1 thuộc clade của Việt Nam được liệt kê bảng 3.5.
Hình 3.4 cho thấy kết quả phân tích phát sinh loài dựa trên gen N1 cũng đồng nhất đối với kết quả khi so sánh phát sinh loài dựa trên gen H . Nghĩa là gen N1 các chủng virus cúm A/H5N1 clade 7 phân lập Việt Nam cũng có độ tương đồng cao đối với gen N1 của các chủng virus cúm thuộc clade 7 của Trung Quốc và n m thành nhóm với nhau trên cây phả hệ.
Quan sát chi tiết cây phả hệ cho thấy trong số 5 chủng virus A/H5N1 clade
7 phân lập Việt Nam có 4 chủng là A chicken Vietnam NCVD-03/2008, A/chicken/Vietnam/NCVD-04/2008, A/chicken/Vietnam/NCVD-05/2008 và A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008 n m c m lại thành nhóm với nhau. Trong khi đó chủng A/chicken/Vietnam/NCVD-093 lại n m tách khá xa khỏi nhóm này và có mức độ tương đồng gần (n m sát nhau trên cây phát sinh loài) với chủng virus thuộc clade 7 của Trung Quốc phân lập từ năm 2003 (A/Beijing/01/2003).
Kết quả so sánh về sự phân bố của các chủng virus cúm A/H5N1 clade 7 trong cây phả hệ gen H và N1, có thể nhận xét r ng giữa các chủng virus cúm A/H5N1clade cũng có sự tiến hóa khác nhau đối với gen N1, c thể là chủng A/chicken/Vietnam/NCVD-093 khác biệt với nhóm còn lại của các virus clade của Việt Nam. Tuy nhiên khi so sánh với các các chủng virus cúm A/H5N1của những clade khác, có thể nhận thấy rõ ràng là các virus cúm A/H5N1thuộc clade 7 của Trung Quốc cũng như Việt Nam đều có độ tương đồng cao và khác biệt hoàn toàn với các clade khác hiện tại đang lưu hành trong khu vực.
81
100
85
A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-05/2008 *
A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-04/2008 *
A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-03/2008 *
97
73
79
89 68
A/chicken/Shanxi/10/2006
A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-016/2008 *
A/chicken/Hebei/706/2005
A/chicken/Liaoning/A-1/2007 A/mallard/Huadong/hn/2005
A/chicken/Shanxi/2/2006
A/chicken/Ningxia/24/2006
ất đoạn 20 axit amin
Virus clade 7 HA
99 92
97
A/chicken/Hebei/126/2005 A/chicken/Hebei/102/2005
95
98 61
A/chicken/Hebei/326/2005 A/Beijing/01/2003 2003
A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-093/2008 *
A/Viet Nam/1194/2004
46 A/Viet Nam/1203/2004 A/chicken/Vietnam/8/2003
83
10050
91 70
A/chicken/Viet Nam/AG-010/2004 A/Vietnam/CL20/2004
A/chicken/Viet Nam/DT-015/2004 A/chicken/Bac Lieu/07-10/2007
100
95
A/Muscovy duck/Ca Mau/07-04/2007 A/duck/Viet Nam/38ST/2008
100
99
98
A/duck/Hue/V6/2010
A/duck/Viet Nam/TMU026/2009 A/chicken/Viet Nam/TMU025/2009
A/duck/Hai Phong /208/2006
71 A/chicken/Bac Giang/07-74/2007
100
55
A/duck/Ha Tinh/07-53/2007 A/chicken/Ha Nam/07-83/2007
100
51
A/duck/Vietnam/8/05 A/goose/Vietnam/3/05
Mất đoạn 19 axít amin
A/duck/Vietnam/1/2005
A/Hong Kong/485/1997
95
A/chicken/China/27402/1997
99
52 A/HongKong/486/97
72 A/HongKong/481/97
69 54
99
86
49
65
100
A/duck/Guangxi/2291/2004 A/duck/Guangxi/1378/2004 A/chicken/Viet Nam/Ncvd8/2003
A/Hong Kong/213/2003 A/HK/212/03 2003
40 A/Hong Kong/156/97
A/goose/Viet Nam/113/2001
A/Pheasant/HongKong/FY155/01
99
A/goose/Hong Kong/437-6/1999
A/Goose/Guangdong/3/97
90 A/Chicken/HongKong/YU822.2/01
89 A/Goose/Guangdong/1/96
0. 005
Hình 3.4. Cây phả hệ dự t ên chuỗi nucleotide gen N1 củ c c chủng i A/H5N1 clade 7(Được lập bằng phương ph p phân tích neighbo -joining sử dụng phần mề MEGA 5, gi t ị boostrap 1000)
irus có d u là virus /H5N1 clade 7 phân lập t i iệt Na
Bảng 3.5. D nh ch c c chủng i A/H5N1 ử dụng đ o nh à lập cây ph t inh loài dự t ên gen N1
D nh ph p q c tế | Loài ắc | Nă phân lập | Nơi phân lập | S đăng ký ngân hàng gen | |
1 | A/goose/Guangdong/1/96 | Ngỗng | 1996 | Trung Quốc | AF144304 |
2 | A/chicken/Hongkong/YU822/01 | Gà | 1997 | Hong Kong | AY221545 |
3 | A/Hongkong/156/97 | Người | 1997 | Hong Kong | AF036357 |
4 | A/Hongkong/481/97 | Người | 1997 | Hong Kong | AF102663 |
5 | A/Hongkong/485/1997 | Người | 1997 | Hong Kong | AF102664 |
6 | A/Hongkong/486/1997 | Người | 1997 | Hong Kong | AF102658 |
7 | A/chicken/China/27402/1997 | Gà | 1997 | Trung Quốc | GU052122 |
8 | A/goose/Guangdong/3/97 | Ngỗng | 1997 | Trung Quốc | AF364335 |
9 | A/goose/Hongkong/437-6/1999 | Ngỗng | 1999 | Hong Kong | GU052021 |
10 | A/pheasan/Hongkong/FY115/01 | Trĩ | 2001 | Hong Kong | AF509096 |
11 | A/goose/Vietnam/113/2001 | Ngỗng | 2001 | Việt Nam | EF541474 |
12 | A/Hongkong/212/2003 | Người | 2003 | Hong Kong | AY575881 |
13 | A/Hongkong/213/2003 | Người | 2003 | Hong Kong | AB557744 |
14 | A/Beijing/01/2003 | Người | 2003 | Trung Quốc | EF587279 |
15 | A/chicken/Vietnam/8/2003 | Gà | 2003 | Việt Nam | DQ493042 |
16 | A/chicken/Vietnam/ncvd8/2003 | Gà | 2003 | Việt Nam | EF541468 |
17 | A/duck/Guangxi/1378/2004 | Vịt | 2004 | Trung Quốc | DQ321016 |
18 | A/duck/Guangxi/2291/2004 | Vịt | 2004 | Trung Quốc | DQ321022 |
19 | A/chicken/Vietnam/AG-010/2004 | Gà | 2004 | Việt Nam | DQ094278 |
20 | A/chicken/Vietnam/DT-015/2004 | Gà | 2004 | Việt Nam | DQ094279 |
21 | A/Vietnam/1194/2004 | Người | 2004 | Việt Nam | EF541466 |
22 | A/Vietnam/1203/2004 | Người | 2004 | Việt Nam | HM006761 |
23 | A/Vietnam/CL20/2004 | Người | 2004 | Việt Nam | DQ493071 |
24 | A/chicken/hebei/102/2005 | Gà | 2005 | Trung Quốc | EU243134 |
25 | A/chicken/hebei/126/2005 | Gà | 2005 | Trung Quốc | EU2431451 |
26 | A/chicken/hebei/326/2005 | Gà | 2005 | Trung Quốc | DQ349118 |
27 | A/chicken/hebei/706/2005 | Gà | 2005 | Trung Quốc | EU243127 |
28 | A/mallard/huadong/hn/2005 | Vịt trời | 2005 | Trung Quốc | EU195410 |
29 | A/goose/Vietnam/3/05 | Ngỗng | 2005 | Việt Nam | DQ366316 |
30 | A/duck/Vietnam/1/05 | Vịt | 2005 | Việt Nam | DQ366308 |
31 | A/duck/Vietnam/8/05 | Vịt | 2005 | Việt Nam | DQ366324 |
32 | A/chicken/ningxia/24/2006 | Gà | 2006 | Trung Quốc | HM172205 |
33 | A/chicken/shanxi/10/2006 | Gà | 2006 | Trung Quốc | HM172172 |
34 | A/chicken/shanxi/2/2006 | Gà | 2006 | Trung Quốc | DQ914816 |
Có thể bạn quan tâm!
-
Bảng Tổng Hợp Liệ Tính To N Theo Phương Ph P Reed-Muench -
Ch Ẩn Bị Ix (Hỗn Hợp Phản Ứng Rt- Cr Giải T Ình Tự Gen -
Cây Phả Hệ Dự Chuỗi Nucleotide Gen H5 Củ Những I C A/h5N1 Cl De 7 (Được Lập Bằng Phương Ph P Phân Tích Neighbor- -
Cây Phả Hệ Dự T Ên Chuỗi Nucleotide Gen M Củ C C Chủng I A/h5N1 Clade 7 (Được Lập Bằng Phương Ph P Phân Tích Neighbo -Joining Sử Dụng Phần Mề Mega 5, Gi T -
Ki T Đặc Tính Gây Ngưng Kết Hồng Cầu (Phản Ứng Ha) -
Kết Quả Đ Nh Gi Đ C Lực Của Virus C A/h5N1C A/h5N1 Cl De 7 T Ên Gi Cầm
Xem toàn bộ 162 trang tài liệu này.
D nh ph p q c tế | Loài ắc | Nă phân lập | Nơi phân lập | S đăng ký ngân hàng gen | |
35 | A/duck/Haiphong/208/2006 | Vịt | 2006 | Việt Nam | GU052504 |
36 | A/chicken/Liaoning/a-1/2007 | Gà | 2007 | Trung Quốc | HM172206 |
37 | A/chicken/Bacgiang/07-74/2007 | Gà | 2007 | Việt Nam | GU050469 |
38 | A/chicken/Baclieu/07-10/2007 | Gà | 2007 | Việt Nam | GU186763 |
39 | A/chicken/Hanam/07-83/2007 | Gà | 2007 | Việt Nam | GU050477 |
40 | A/muscovyduck/Camau/07-04/2007 | Ngan | 2007 | Việt Nam | GU186747 |
41 | A/duck/Hatinh/07-53/2007 | Vịt | 2007 | Việt Nam | GU050430 |
42 | A/duck/Vietnam/38ST/2008 | Vịt | 2008 | Việt Nam | FJ812005 |
43 | A/chicken/Vietnam/TMU025/2009 | Gà | 2009 | Việt Nam | CY095702 |
44 | A/duck/Hue/V6/2010 | Vịt | 2009 | Việt Nam | JN935005 |
45 | A/duck/Vietnam/TMU026/2009 | Vịt | 2009 | Việt Nam | CY095705 |
Kết quả giải trình tự gen N1 cho thấy các chủng virus cúm A/H5N1clade 7 của Việt Nam có hiện tượng bị đột biến xóa (deletion) nên bị mất 20 axit amin vị trí từ 49-68 trên vùng thân của phân tử kháng nguyên NA. Hiện tượng đột biến xóa 20 axit amin này cũng đã được quan sát thấy hầu hết các virus cúm phát hiện và phân lập được Việt Nam và Trung Quốc từ năm 2004 đến nay.
Có một hiện tượng đột biến khác trên phân tử kháng nguyên NA là sự mất đoạn 19 axit amin các chủng virus cúm A/H5N1phân lập Hong Kong năm 199 (như chủng A Hongkong 1 6 9 ) và một số chủng virus cúm A/H5N1phân lập Việt Nam năm 200 , tuy nhiên cho đến gần đây không còn thấy có sự xuất hiện đột biến xóa 19 axit amin các chủng virus A/H5N1 nữa. Hầu hết các chủng virus A/H N1 độc lực cao cổ điển (như chủng A/goose/Guangdong/1/96) đều có gen N1 với độ dài tối đa (không có đột biến xóa axit amin) và hiện tượng này cũng chỉ còn phát hiện thấy các virus A/H N1 phân lập được cho đến năm 2004.
Phần thân kháng nguyên NA có vai trò quan trọng đối với độc lực của virus cúm gia cầm. Người ta đã phát hiện hiện tượng đột biến xóa 20 axit amin vị trí 49-68 có liên quan đến độc lực cao (Zhou và cs, 2006). Hiện tượng này cũng được phát hiện b i Zhao và cs, 2007 (Zhao và cs, 2008) và điều đó có thể thể hiện sự thích nghi của virus cúm A/H5N1trên gia cầm ( atrosovich và cs, 1999).
Chúng tôi cũng thực hiện việc phân tích sự khác biệt di truyền trên gen N1 về mức độ nucleotide và mức độ axit amin của các chủng virus A H N1 thuộc clade 7 thu thập Việt Nam và một số chủng virus A/H5N1 thuộc clade 7 của Trung Quốc (A/chicken/Shanxi/10/2006, A/chicken/Shanxi/2/2006, A/Beijing/01/2003) so sánh với một số chủng virus cúm A H N1 khác của Trung Quốc (A/HongKong/156/97, A/Goose/Guangdong/1 96) và của Việt Nam (A/VietNam/1194/2004, A/VietNam/1203/2004, A/goose/VietNam/113/2001, A/Goose/Guangdong/1/96). Kết quả trình bày bảng 3.6.
Khi so sánh mức độ khác biệt về di truyền giữa các chủng virus cúm A/H5N1clade 7 của Việt Nam chúng tôi nhận thấy sự sai khác giữa nhóm 4 virus cúm A/H5N1 clade 7 của Việt Nam đã nêu phần trên là A/chicken/Vietnam/NCVD-03/2008, A/chicken/Vietnam/NCVD-04/2008, A/chicken/Vietnam/NCVD-05/2008 và A Chicken Vietnam NCVD-016 2008 là rất thấp, ≤ 2% mức độ nucleotide và ≤2, % mức độ axit amin. Cũng như đã nhận thấy rõ như cây phả hệ nhóm virus này có độ khác biệt tương đối lớn so với chủng virus khác của Việt Nam cũng thuộc clade là A/chicken/Vietnam/NCVD-093/2008. C thể sự sai khác về mức độ nucleotide và mức độ axit amin của nhóm 4 chủng virus mà chúng tôi nêu trên và virus A/chicken/Vietnam/NCVD-093/2008 lần lượt là 4, ±0,2% (4,5-4,9%) và
,6±0,3% ( ,3-6,0%).
Kết quả phân tích cũng cho thấy chủng virus A/chicken/Vietnam/NCVD- 093 về mặt quan hệ hệ phả cũng gần nhất với chủng virus A/Beijing/01/2003, là chủng virus phân lập người năm 2003 của Trung Quốc. C thể sự sau khác chỉ là 2,3% mức độ nucleotide và 2, % mức độ axit amin.
Sự sai khác lớn nhất có thể quan sát thấy giữa các virus cúm A/H5N1 thuộc clade 7 thu thập Việt Nam so với các chủng virus A/H N1 có hiện tượng đột biến xóa 19 axit amin (virus A/Hong_Kong/156/97 và virus A goose Vietnam 3 0 ) là 12,3-1 ,1% nucleotide và 9, - 10,4%. mức độ axit amin.
Bảng 3.6. Mức đ kh c biệt về di truyền t ên gen N1 của 5 chủng i c A/H5N1 cl de 7 o nh ới m t s chủng tham chiếu
Tên chủng | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | |
Axit amin (%) | |||||||||||||||
1 | A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008 | 2,5 | 2,7 | 2,7 | 5,3 | 2,3 | 3,0 | 3,4 | 5,0 | 4,8 | 6,2 | 9,5 | 9,7 | 5,3 | |
2 | A/Chicken/Vietnam/NCVD-03/2008 | 1,9 | 0,7 | 0,4 | 5,5 | 2,0 | 2,5 | 3,6 | 5,8 | 5,5 | 6,2 | 9,7 | 9,9 | 5,3 | |
3 | A/Chicken/Vietnam/NCVD-04/2008 | 2,0 | 0,5 | 0,4 | 6,0 | 2,3 | 3,0 | 4,1 | 6,0 | 5,8 | 6,7 | 10,2 | 10,4 | 5,8 | |
4 | A/Chicken/Vietnam/NCVD-05/2008 | 2,0 | 0,4 | 0,4 | 5,5 | 2,3 | 2,7 | 3,6 | 6,0 | 5,8 | 6,2 | 10,0 | 10,2 | 5,3 | |
5 | A/Chicken/Vietnam/NCVD-093/2008 | 4,5 | 4,7 | 4,9 | 4,5 | 5,5 | 4,1 | 2,5 | 5,5 | 5,0 | 5,3 | 9,7 | 9,9 | 4,1 | |
6 | A/chicken/Shanxi/10/2006 | 1,6 | 1,4 | 1,6 | 1,7 | 4,5 | 2,7 | 3,6 | 5,5 | 5,5 | 6,5 | 10,2 | 10,4 | 5,3 | |
7 | A/chicken/Shanxi/2/2006 | 2,7 | 2,5 | 2,7 | 2,7 | 4,1 | 2,4 | 2,0 | 4,6 | 4,1 | 4,8 | 8,5 | 8,5 | 3,9 | |
8 | A/Beijing/01/2003 | 2,4 | 2,7 | 3,0 | 2,8 | 2,3 | 2,3 | 2,3 | 3,6 | 3,2 | 3,6 | 8,2 | 8,2 | 2,3 | |
9 | A/Viet_Nam/1194/2004 | 4,7 | 5,2 | 5,4 | 5,4 | 4,3 | 4,7 | 4,6 | 2,8 | 0,9 | 5,0 | 8,7 | 8,7 | 3,4 | |
10 | A/Viet_Nam/1203/2004 | 4,2 | 4,8 | 5,0 | 5,0 | 3,8 | 4,3 | 4,1 | 2,3 | 1,0 | 4,6 | 8,2 | 8,2 | 3,4 | |
11 | A/goose/Viet_Nam/113/2001 | 6,6 | 6,7 | 6,8 | 6,4 | 5,7 | 6,5 | 6,0 | 4,5 | 5,6 | 4,9 | 7,9 | 7,7 | 2,8 | |
12 | A/Hong_Kong/156/97 | 14,2 | 14,8 | 15,1 | 14,7 | 13,8 | 14,4 | 13,2 | 13,0 | 13,8 | 13,3 | 12,2 | 1,1 | 6,9 | |
13 | A/goose/Vietnam/3/05 | 13,0 | 13,4 | 13,7 | 13,3 | 12,3 | 13,0 | 11,9 | 11,4 | 12,3 | 11,7 | 10,9 | 1,8 | 6,9 | |
14 | A/Goose/Guangdong/1/96 | 5,2 | 5,6 | 5,9 | 5,5 | 4,3 | 5,3 | 5,0 | 3,0 | 3,6 | 3,3 | 3,2 | 11,1 | 9,8 | |
Nucleotide (%) | |||||||||||||||
77
Sự sai khác di truyền của các chủng virus cúm thuộc clade mà chúng tôi thu thập Việt Nam so với chủng virus được coi là thủy tổ của virus cúm A H N1 độc lực cao (A/Goose/Guangdong/1/96) là 4,3 – ,9% mức độ nucleotide và 4,1 – ,8% mức độ axit amin.
3.2.3. Giải t ình tự gen M à phân tích cây phả hệ dự t ên ch ỗi nucleotide của gen M
Hệ gen của virus cúm gia cầm type A nói chung và virus A H N1 gồm có 8 phân đoạn, trong đó có 2 phân đoạn gen HA và NA mã hóa tạo nên 2 loại kháng nguyên bề mặt có ý nghĩa cho việc xác định subtype của virus. Tại thời điểm hiện tại các chủng virus cúm gia cầm độc lực cao A H N1 Đông Nam Á có gen HA và NA có nguồn gốc và tiến hóa từ virus tiền thân là A Goose Guangdong 1 96 phát hiện được Trung Quốc. Trong khi đó các gen mã hóa cho các protein nội sinh ( , PA, PB2 và PB1) lại từ nhiều nguồn khác nhau. Điều này đã tạo nên sự tái tổ hợp thành nhiều genotype khác biệt (Guan và cs, 2002; Li và cs, 2004). Vì vậy để nghiên cứu thêm về đặc tính di truyền của các chủng virus A H N1 thuộc clade Việt Nam chúng tôi tiến hành giải trình tự gen của các mẫu virus này.
Chiều dài chuỗi nucleotide của gen đã giải trình tự là 983 bp (base pair) mã hóa cho 2 đoạn gen 1 và 2. Trình tự của gen M của chủng virus mà chúng tôi phân lập được mang so sánh với một số chủng virus cúm gia cầm A H N1 độc lực cao phát hiện các nước thuộc châu Á, trong đó có chủng virus cúm A Goose Guangdong 1 96 là virus thủy tổ của các virus cúm gia cầm độc lực cao và một số chủng virus Việt Nam trước đây. Dựa trên sự sai khác chuỗi gen M của các chủng virus A H N1 so sánh chúng tôi đã lập cây phả hệ (phylogenetic tree) để theo dõi, phân tích sự tiến hóa của các chủng virus này so với các chủng virus cúm A H N1 trước kia.
Danh sách các chủng virus A H N1 dùng để so sánh lập cây phát sinh loài được trình bày bảng 3.7.