67 A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-04/2008
52
94
94
83
91
A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-05/2008 A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-093/2008 A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-03/2008
A/CHICKEN/VIETNAM/NCVD-016/2008
Clade 7
83
35
A/chicken/Shanxi/10/2006 2006
A/chicken/Shandong/A-10/2006 2006
A/chicken/Shanxi/2/2006
Clade 7
33
33
A/Beijing/01/2003
A/chicken/Korea/es/2003
99
A/black-headed goose/Qinghai/1/2005
A/chicken/Bhutan/248006/2010 A/duck/India/TR-NIV4396/2008
A/duck/Hunan/1386/2003
99
14
59
55
58
27
A/Indonesia/239H/2005 A/Indonesia/CDC1046/2007 A/Indonesia/535H/2006
A/Ck/Indonesia/2A/2003 2003 A/chicken/East Java/UT6045/2007
A/duck/Guangxi/351/2004
96
28 80 A/chicken/Thailand/ICRC-7356/2010
68
53
34
51
53
66
74
31
A/Thailand/Kan353/2004 2004
A/duck/Vietnam/48/2004 2004 A/Cambodia/P0322095/2005
A/Vietnam/CL100/2004 A/duck/Vietnam/286/2005
A/Muscovy duck/Ca Mau/07-04/2007 A/chicken/Lang Son/200/2005 2005
A/duck/Guiyang/3834/2005 2005
A/Anhui/T2/2006 2006
46
77 A/Anhui/2/2005 2005
25
68
A/Shanghai/1/2006 2006
A/crested myna/Hong Kong/540/2006
41
99
97
33
A/Hong Kong/6841/2010 A/mallard/Korea/1195/2010
A/Hunan/1/2006
83
77 A/duck/Guangxi/150/2006
A/duck/Laos/P0117/2007
A/duck/Zhejiang/52/2000
A/goose/Fujian/bb/2003
100
A/goose/Vietnam/3/05 2005
99 A/Duck/Hong Kong/y283/1997 A/Hong Kong/156/1997
94
93
A/duck/Shantou/195/2001 A/Chicken/Hong Kong/SF219/2001
A/Goose/Guangdong/1/96
0.002
Hình 3.5. Cây phả hệ dự t ên chuỗi nucleotide gen M củ c c chủng i A/H5N1 clade 7 (Được lập bằng phương ph p phân tích neighbo -joining sử dụng phần mề MEGA 5, gi t ị boostrap 1000)
Bảng 3.7. D nh ch c c chủng i c A/H5N1 ử dụng đ o nh à lập cây ph t inh loài dự t ên gen M
D nh ph p q c tế | Loài ắc | Nă phân lập | Nơi phân lập | S đăng ký ngân hàng gen | |
1 | A/Goose/Guangdong/1/96 | Ngỗng | 1996 | Trung Quốc | AF144306 |
2 | A/Hong Kong/156/1997 | Người | 1997 | Hong Kong | AF036358 |
3 | A/Duck/Hong Kong/y283/1997 | Vịt | 1997 | Hong Kong | AF098567 |
4 | A/duck/Zhejiang/52/2000 | Vịt | 2000 | Trung Quốc | AY585397 |
5 | A/duck/Shantou/195/2001 | Vịt | 2001 | Hong Kong | CY029002 |
6 | A/Chicken/Hong Kong/SF219/2001 | Gà | 2001 | Trung Quốc | AF509048, |
7 | A/chicken/Korea/es/2003 | Gà | 2003 | Hàn Quốc | EF541460 |
8 | A/Ck/Indonesia/2A/2003 | Gà | 2003 | Indonesia | AY651377 |
9 | A/goose/Fujian/bb/2003 | Ngỗng | 2003 | Trung Quốc | DQ997402 |
10 | A/Beijing/01/2003 | Người | 2003 | Trung Quốc | EF587280 |
11 | A/duck/Hunan/1386/2003 | Vịt | 2003 | Trung Quốc | CY029310 |
12 | A/Thailand/Kan353/2004 2004 | Người | 2004 | Thái Lan | EF541446 |
13 | A/duck/Guangxi/351/2004 | Vịt | 2004 | Trung Quốc | DQ320943 |
14 | A/Vietnam/CL100/2004 | Người | 2004 | Việt Nam | DQ492986 |
15 | A/duck/Vietnam/48/2004 2004 | Vịt | 2004 | Việt Nam | DQ492944 |
16 | A/Cambodia/P0322095/2005 | Người | 2005 | Cam pu chia | HQ200461 |
17 | A/Indonesia/239H/2005 | Người | 2005 | Indonesia | EU146665 |
18 | A/black-headed goose/Qinghai/1/2005 | Ngỗng | 2005 | Trung Quốc | DQ100567 |
19 | A/Anhui/2/2005 | Người | 2005 | Trung Quốc | CY060147 |
20 | A/duck/Guiyang/3834/2005 | Vịt | 2005 | Trung Quốc | EF124151 |
21 | A/chicken/Lang Son/200/2005 | Gà | 2005 | Việt Nam | GU186717 |
22 | A/goose/Vietnam/3/05 2005 | Ngỗng | 2005 | Việt Nam | DQ366317 |
23 | A/duck/Vietnam/286/2005 | Vịt | 2005 | Việt Nam | DQ492958 |
24 | A/crested myna/Hong Kong/540/2006 | Chim | 2006 | Hong Kong | EF12405 |
25 | A/Indonesia/535H/2006 | Người | 2006 | Indonesia | EU146756 |
26 | A/chicken/Shandong/A-10/2006 | Gà | 2006 | Trung Quốc | HM172139 |
27 | A/chicken/shanxi/10/2006 | Gà | 2006 | Trung Quốc | HM172135.1 |
28 | A/chicken/shanxi/2/2006 | Gà | 2006 | Trung Quốc | DQ914817 |
Có thể bạn quan tâm!
-
Ch Ẩn Bị Ix (Hỗn Hợp Phản Ứng Rt- Cr Giải T Ình Tự Gen -
Cây Phả Hệ Dự Chuỗi Nucleotide Gen H5 Củ Những I C A/h5N1 Cl De 7 (Được Lập Bằng Phương Ph P Phân Tích Neighbor- -
Hiện Tượng Chèn À Xó C C Xit In Tại Vị T Í Cle Ge Ite Củ C C Chủng I A/h5N1 Cl De 7 Phân Lập Ở Việt N -
Ki T Đặc Tính Gây Ngưng Kết Hồng Cầu (Phản Ứng Ha) -
Kết Quả Đ Nh Gi Đ C Lực Của Virus C A/h5N1C A/h5N1 Cl De 7 T Ên Gi Cầm -
Kết Quả Đ Nh Gi Đ Bài Thải Củ I T Ên Đ Ng Vật Thí Nghiệm Gây Nhiễ
Xem toàn bộ 162 trang tài liệu này.
D nh ph p q c tế | Loài ắc | Nă phân lập | Nơi phân lập | S đăng ký ngân hàng gen | |
29 | A/Anhui/T2/2006 2006 | Người | 2006 | Trung Quốc | EU008577 |
30 | A/Hunan/1/2006 | Người | 2006 | Trung Quốc | CY060173 |
31 | A/Shanghai/1/2006 | Người | 2006 | Trung Quốc | AB462298 |
32 | A/duck/Guangxi/150/2006 | Vịt | 2006 | Trung Quốc | EF124078 |
33 | A/chicken/East Java/UT6045/2007 | Gà | 2007 | Indonesia | GQ122542 |
34 | A/Indonesia/CDC1046/2007 | Người | 2007 | Indonesia | CY019411 |
35 | A/duck/Laos/P0117/2007 | Vịt | 2007 | Lào | CY040921 |
36 | A/Muscovy duck/Ca Mau/07- 04/2007 | Ngan | 2007 | Việt Nam | GU186746 |
37 | A/duck/India/Tr-NIV4396/2008 | Vịt | 2008 | Ấn Độ | CY046105 |
38 | A/chicken/Bhutan/248006/2010 | Gà | 2010 | Bhutan | CY066007 |
39 | A/mallard/Korea/1195/2010 | Vịt trời | 2010 | Hàn Quốc | HQ695916 |
40 | A/Hong Kong/6841/2010 | Người | 2010 | Hong Kong | HQ636463 |
41 | A/chicken/Thailand/ICRC- 7356/2010 | Gà | 2010 | Thái Lan | HM590792 |
Dựa trên phân tích cây phả hệ của gen chúng tôi có thể nhận xét r ng các chủng virus cúm gia cầm A H N1 thuộc clade 7 của Việt Nam có độ tương đồng cao và xắp xếp thành một nhóm với nhau, và n m trong nhóm với các chủng virus cúm A/H5N1 clade 7 của Trung Quốc. Kết quả phân tích này chứng tỏ gen M của các virus cúm A/H5N1 clade 7 của Việt Nam và Trung Quốc có cùng nguồn gốc. Để thấy rõ hơn sự khác biệt di truyền mức độ nucleotide và axit amin, chúng tôi so sánh gen của các chủng virus cúm A/H5N1clade 7 của Việt Nam với một số virus cúm A/H5N1của Trung Quốc. Kết quả được biểu thị
bảng 3.8.
Mức độ sai khác về di truyền gen M giữa các chủng virus cúm A/H5N1 clade 7 của Việt Nam với nhau gần như không đáng kể, c thể sự sai khác tối đa về mức độ nucleotide là 1% và mức độ axit amin là 0,6%.
Mức độ sai khác giữa các chủng virus cúm A/H5N1thuộc clade 7 của Việt Nam và các chủng thuộc clade của Trung Quốc cũng rất thấp. Sự sai khác tối
đa về di truyền mức độ nucleotide và axit amin giữa các virus của 2 nhóm này lần lượt là 3,0±0.1% và 3,3±0.2% (virus A chicken/Shanxi/2/2006).
So sánh sự sai khác về di truyền giữa các chủng virus cúm thuộc clade do chúng tôi phân lập với các chủng virus thuộc clade khác trên cơ s gen , chúng tôi nhận thấy sự sai khác về nucleotide và axit amin không nhiều, chỉ trong khoảng 3,6% về nucleotide và 2-4% về axit amin. Duy chỉ có 2 chủng A goose Vietnam 3 0 và chủng A HongKong 1 6 9 thuộc clade 0 thì có sự khác biệt khá lớn: sự sai khác về mức độ nucleotide tới 10% và về mức độ axit amin tới 7%. Một chủng virus A H N1 khác cũng thuộc clade 0 là chủng A Goose Guangdong 1 96, được coi là thủy tổ của các chủng virus cúm A H N1độc lực cao, có độ sai khác về di truyền với các chủng virus thuộc clade
của Việt Nam mức độ nucleotide là ,3±0.2% ( ,2- ,6%) và mức độ axit amin là 4,2±0.2 % (4,1-4,4%).
Tóm lại, kết quả phân tích phát sinh loài, kết quả phân tích sự sai khác di truyền dựa trên gen H , N1 và của các chủng virus cúm A/H5N1 clade 7 của Việt Nam cho thấy, các chủng virus thuộc clade 7 của Việt Nam có độ tương đồng cao với nhau chứng tỏ chúng có cùng nguồn gốc, và tương đồng với các chủng virus A H N1 cũng thuộc clade phân lập Trung Quốc.
Từ các kết quả trên có thể kết luận r ng các chủng virus cúm A H N1 thuộc clade 7 của Việt Nam cùng nguồn gốc với các virus thuộc clade 7 của Trung Quốc, và xâm nhập vào Việt Nam chứ không phải là các virus tiến hóa từ các chủng virus cúm A H N1độc lực cao gây bệnh trước đó trên gia cầm (2003- 2008) tại Việt Nam. Hiện tượng các chủng virus thuộc clade được phát hiện vùng biên giới năm 2008, cùng với sự xuất hiện của nhiều clade khác Việt Nam như clade 2.3.4 và 2.3.2 Việt Nam rất giống với những chủng virus cúm A H N1 lưu hành và gây bệnh trên gia cầm Trung Quốc cho thấy nguy cơ xâm nhập và xuất hiện của các chủng virus cúm A/H5N1từ bên ngoài vào Việt Nam là rất lớn, vì vậy cần phải tăng cường công tác giám sát nh m phát hiện sớm những virus cúm A H N1có thể sẽ xâm nhập hoặc đang lưu hành trên gia cầm Việt Nam.
Bảng 3.8. So nh ức đ kh c biệt về di truyền t ên gen M của 5 chủng virus c A/H5N1 th c clade 7 so
nh ới m t s chủng tham chiếu
Ký hiệ chủng
Tên chủng i 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Axit amin (%)
A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008 | 0,6 | 0,3 | 0,3 | 0,3 | 1,6 | 1,3 | 3,5 | 1,9 | 7,4 | 1,9 | 2,1 | 3,8 | 4,4 | 7,4 | ||
2 | A/chicken/Vietnam/NCVD-093/2008 | 1,0 | 0,3 | 0,3 | 0,3 | 1,6 | 1,3 | 3,5 | 1,9 | 7,4 | 1,9 | 1,8 | 3,8 | 4,4 | 7,4 | |
3 | A/chicken/Vietnam/NCVD-03/2008 | 0,9 | 0,3 | 0,0 | 0,0 | 1,3 | 0,9 | 3,2 | 1,6 | 7,1 | 1,6 | 1,8 | 3,5 | 4,1 | 7,1 | |
4 | A/chicken/Vietnam/NCVD-04/2008 | 0,9 | 0,3 | 0,2 | 0,0 | 1,3 | 0,9 | 3,2 | 1,6 | 7,1 | 1,6 | 1,8 | 3,5 | 4,1 | 7,1 | |
5 | A/chicken/Vietnam/NCVD-05/2008 | 0,9 | 0,3 | 0,2 | 0,0 | 1,3 | 0,9 | 3,2 | 1,6 | 7,1 | 1,6 | 1,8 | 3,5 | 4,1 | 7,1 | |
6 | A/chicken/Shandong/A-10/2006 | 1,3 | 1,3 | 1,2 | 1,2 | 1,2 | 0,9 | 3,8 | 1,6 | 7,4 | 1,6 | 1,8 | 3,5 | 4,4 | 7,4 | |
7 | A/chicken/Shanxi/10/2006 | 0,8 | 0,9 | 0,8 | 0,8 | 0,8 | 0,8 | 4,1 | 1,6 | 7,4 | 1,6 | 1,8 | 3,5 | 4,4 | 7,4 | |
8 | A/chicken/Shanxi/2/2006 | 3,1 | 3,1 | 2,8 | 2,9 | 2,9 | 2,8 | 3,0 | 3,2 | 7,4 | 3,2 | 3,5 | 5,1 | 5,8 | 7,4 | |
9 | A/Beijing/01/2003_2003 | 2,4 | 2,4 | 2,3 | 2,3 | 2,3 | 1,7 | 2,1 | 3,5 | 5,8 | 0,0 | 0,7 | 1,9 | 2,8 | 5,8 | |
10 | A/goose/Vietnam/3/05 | 10,0 | 10,1 | 9,7 | 9,7 | 9,7 | 10,0 | 10,4 | 9,3 | 8,7 | 5,8 | 5,7 | 5,8 | 3,8 | 0,0 | |
11 | A/Anhui/2/2005 | 3,0 | 3,1 | 3,0 | 3,0 | 3,0 | 2,4 | 2,7 | 4,0 | 0,9 | 8,1 | 0,7 | 1,9 | 2,8 | 5,8 | |
12 | A/blackheadedgoose/Qinghai/1/2005 | 3,2 | 3,2 | 3,2 | 3,2 | 3,2 | 2,6 | 2,7 | 4,0 | 1,4 | 9,3 | 1,3 | 2,1 | 3,2 | 5,7 | |
13 | A/goose/Fujian/bb/2003 | 4,0 | 4,1 | 3,8 | 3,8 | 3,8 | 3,4 | 3,7 | 4,4 | 2,1 | 8,1 | 2,0 | 2,3 | 2,8 | 5,8 | |
14 | A/Goose/Guangdong/1/96 | 5,5 | 5,6 | 5,2 | 5,2 | 5,2 | 5,0 | 5,3 | 5,7 | 3,5 | 6,0 | 3,4 | 3,8 | 3,2 | 3,8 | |
15 | A/Hong_Kong/156/97 | 10,7 | 10,8 | 10,5 | 10,5 | 10,5 | 10,7 | 11,1 | 9,3 | 9,4 | 1,3 | 8,8 | 9,8 | 8,8 | 7,5 |
Nucleotide (%)
83
3.3. X c định m t s đặc tính inh học của virus A/H5N1 clade 7 phân lập ở Việt N (A/chicken/Vietnam/NCVD-016/2008)
3.3.1. Tính thích ứng t ên ph i gà (x c định ch s EID50)
Virus cúm nói chung và virus cúm gia cầm A/H N1 độc lực cao có khả năng phát triển tốt trên phôi gà, vì vậy phôi gà 9-10 ngày tuổi thường được sử d ng để phân lập virus cúm gia cầm độc lực cao trong công tác chẩn đoán cũng như để giữ giống virus. Tuy nhiên, các chủng virus cúm gia cầm có đặc điểm khác nhau khi nhân lên trên phôi trứng, thể hiện b ng sự gây nhiễm phôi, gây chết phôi và chuẩn độ tối ưu của virus khi nhân lên trên phôi trứng. Sự khác biệt về thời gian gây chết phôi trứng và chuẩn độ tối ưu của các chủng virus khác nhau là khác nhau. Virus có độc lực thấp thường giết chết phôi trứng chậm hơn và có thể thu được virus với nồng độ cao hơn so với virus cúm có độc lực cao và ngược lại.
Để xác định tính thích ứng của các chủng virus cúm gia cầm H5N1 clade
phân lập được, chúng tôi lựa chọn chủng A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008 làm chủng đại diện vì chủng này có thể được coi là gần với chủng gốc thuộc clade có từ Trung Quốc.
Phôi trứng được lấy từ đàn gà khỏe mạnh chưa tiêm vacxin cúm gia cầm H N1, và không nhiễm virus cúm gia cầm trong tự nhiên để tránh tác động nếu có (trong lòng đỏ của phôi trứng) của kháng thể từ gà mẹ được tiêm phòng. Trứng được mua từ lúc 8 ngày tuổi và ấp tiếp 1 ngày để ổn định tại phòng thí nghiệm trước khi sử d ng cho thí nghiệm xác định sự thích nghi của chủng virus cúm A/Chicken/Vietnam/NCVD-016 2008 trên phôi gà.
Chủng virus cúm A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008 đã được chia thành nhiều ống nhỏ sau khi phân lập và giữ nhiệt độ -860C. Trước khi tiến hành thí nghiệm hỗn dịch virus đã được kiểm tra vô trùng theo thường quy và được pha thành nhiều nồng độ từ 10-1 đến 10-8 b ng dung dịch đệm PBS có pH 7,2. Tiến hành gây nhiễm cho phôi trứng với 6 nồng độ pha loãng từ 10-3 đến 10-8 vào xoang niệu mô (allantoic cavity) của phôi trứng, mỗi nồng độ gây nhiễm cho
phôi với liều 100µl phôi, ấp tiếp nhiệt độ 370C, theo dõi 2 lần ngày cách nhau
khoảng 8 giờ trong vòng 4 ngày, loại phôi chết trước 24 giờ. Trong thí nghiệm này có sử d ng 3 phôi trứng tiêm dung dịch PBS làm đối chứng âm và ấp trong cùng điều kiện.
Các phôi trứng chết trong thời gian theo dõi được làm lạnh nhiệt độ 2 – 80C trong vòng 24 giờ cho mạch máu có lại và tiến hành mổ trứng thu hoạch dịch niệu mô. Những phôi trứng sống sau thời gian theo dõi (kể cả đối chứng âm tính) đều được thua dịch niệu mô và được kiểm tra b ng phản ứng HA để xác định khả năng nhiễm của virus trên phôi trứng và xác định chỉ số EID50 theo công thức Reed-Muench.
Trước khi gây nhiễm chúng tôi đã tiến hành kiểm tra vô trùng các ống virus giống trên các môi trường: nước thịt, BHI, thạch thường, thạch máu, Sabauraud và nước thịt gan yếm khí, nh m m c đích xác định chắc chắn phôi trứng chết là do virus cúm gây ra. Chúng tôi kiểm tra phôi trứng hàng ngày 2 lần, cách nhau 8h để ghi nhận chi tiết về thời gian chết của phôi. Kết quả thời gian gây chết phôi trình bày bảng 3.9.
Kết quả xác định khả năng gây nhiễm trên phôi gà và chỉ số EID50 của chủng virus A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008 được trình bày bảng 3.10.
Bảng 3.9. Theo dõi thời gi n gây chết ph i
Số phôi gây nhiễm | Theo dõi số phôi chết | Tổng số phôi chết | Tỷ lệ (%) | ||||
0-24 h | 25-48 h | 49-72 h | 73-96h | ||||
1 | 30 | 0 | 10 | 5 | 5 | 20 | 67 |
2 | 30 | 0 | 10 | 5 | 4 | 19 | 63 |
3 | 30 | 0 | 10 | 5 | 4 | 19 | 63 |
Kết quả cho thấy: không có phôi chết trước 24 giờ, virus bắt đầu giết chết phôi trong vòng 2 ngày từ sau khi gây nhiễm. Điều này cũng phù hợp với các ghi nhận thường nhật khi chúng tôi tiến hành phân lập các mẫu có virus cúm gia cầm H N1 trên phôi trứng, và cũng phù hợp với các nghiên cứu trước đây (Easterday
và cs, 199 ; Wanasawaeng và cs, 2009) nhận xét r ng virus cúm độc lực cao thường giết chết phôi trứng trong vòng 48 giờ sau khi gây nhiễm (h.p.i – hour post-infection) lên xoang niệu mô.
Bảng 3.10. Kết quả theo dõi tỷ lệ s ng/chết của ph i trứng khi gây nhiễm virus A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008
Hiệu giá pha loãng | Số phôi gây nhiễm | Số phôi bị nhiễm | Số phôi không nhiễm | Số tích lũy | Tỷ lệ nhiễm virus (%) A (A+B) × 100 | |||
Nhiễm virus (A) | Không nhiễm (B) | Tổng cộng (A+B) | ||||||
Lần 1 | 10-3 | 5 | 5 | 0 | 20 | 0 | 20 | 100 |
10-4 | 5 | 5 | 0 | 15 | 0 | 15 | 100 | |
10-5 | 5 | 5 | 0 | 10 | 0 | 10 | 100 | |
10-6 | 5 | 4 | 1 | 5 | 1 | 6 | 83.3 | |
10-7 | 5 | 1 | 4 | 1 | 5 | 6 | 16.7 | |
10-8 | 5 | 0 | 5 | 0 | 10 | 10 | 0 | |
ĐC (-) | 3 | 0 | 3 | |||||
EID50/0,1ml | 107 (theo công thức eed-Muench) | |||||||
Lần 2 | 10-3 | 5 | 5 | 0 | 19 | 0 | 19 | 100 |
10-4 | 5 | 5 | 0 | 14 | 0 | 14 | 100 | |
10-5 | 5 | 5 | 0 | 9 | 0 | 9 | 100 | |
10-6 | 5 | 3 | 2 | 4 | 1 | 5 | 80.0 | |
10-7 | 5 | 1 | 4 | 1 | 5 | 6 | 16.7 | |
10-8 | 5 | 0 | 5 | 0 | 10 | 10 | 0 | |
ĐC (-) | 3 | 0 | 3 | |||||
EID50/0,1 ml | 106.9 (theo công thức eed-Muench) | |||||||
Lần 3 | 10-3 | 5 | 5 | 0 | 19 | 0 | 19 | 100 |
10-4 | 5 | 5 | 0 | 14 | 0 | 14 | 100 | |
10-5 | 5 | 5 | 0 | 9 | 0 | 9 | 100 | |
10-6 | 5 | 3 | 2 | 4 | 1 | 5 | 80.0 | |
10-7 | 5 | 1 | 4 | 1 | 5 | 6 | 16.7 | |
10-8 | 5 | 0 | 5 | 0 | 10 | 10 | 0 | |
ĐC (-) | 3 | 0 | 3 | 0 | ||||
EID50/0,1 ml | 106.9 (theo công thức eed-Muench) | |||||||
- Ở nồng độ pha loãng 10-3, toàn bộ phôi trứng chết trong vòng 40h sau khi gây nhiễm.