Tên của các mẫu đã phân lập được virus cúm A/H5N1và tên của các mẫu
NA đã phát hiện dương tính virus cúm A/H5N1 được đặt theo danh pháp quốc tế: Tên type cúm A Loài Tên nước Tên viết tắt Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương b ng tiếng Anh-ký hiệu của virus hoặc mẫu. Kết quả chi tiết về các mẫu đã phân lập và phát hiện dương tính virus cúm A/H5N1 được trình bày bảng 3.2.
Tìm kiếm sự tương đồng của các virus cúm được thực hiện b ng chương trình BLAST trên ngân hàng dữ liệu (NCBI, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast) sử d ng chuỗi nucleotide của gen HA cho thấy, các mẫu virus này có độ tương đồng rất cao với hai chủng virus đã được mô tả trước đây là virus A chicken Hebei 326 200 H N1 và virus A chicken Shanxi 2 2006 H N1 (độ tương đồng trung bình của gen HA mức độ nuleotide lần lượt là 96,1% và 96,3%) và cả 1 mẫu này đều được sắp xếp n m trong một nhóm.
Phân tích trình tự gen b ng phương pháp lập cây phả hệ (phylogenetic tree) để tìm kiếm tổ tiên (nguồn gốc) của 15 mẫu virus cúm này cho thấy gen HA của các virus n m chung một nhóm với một nhóm ph của các virus cúm H N1 trước đây có gen HA được phân loại là clade . Tên một số chủng virus cúm A H N1 của tất cả các clade từ 0-9 sử d ng để xây dựng cây phát sinh loài gen HA H được thể hiện bảng 3.3. Trong số mẫu xét nghiệm trên đây chúng tôi không phát hiện thấy mẫu virus A/H5N1 thuộc clade 2.3.4. Điều này cũng có thể hợp lý vì thực ra virus A H N1 clade 2.3.4 đã xâm nhập vào Việt Nam từ năm 2007.
Một điều chú ý là, khi quan sát trên cây phát sinh loài dựa trên gen HA có thể thể thấy rõ có 13 trong số 15 mẫu virus cúm A H N1 clade của Việt Nam tách thành 2 nhóm nhỏ rõ rệt (xem hình 3.2.), tạm được gọi là nhóm A và nhóm B để phân tích (tên c thể của từng mẫu trong mỗi nhóm A và B được tình bày trong bảng 3.2.). Thêm vào đó, 2 mẫu virus cúm A/Chicken/Vietnam/NCVD- 016 2008 và A chicken Vietnam NCVD-swab19 2008 dường như đã chiếm vị trí
trung gian trong cây phả hệ, gần với gốc của 2 nhóm nhưng không n m trong 2 nhóm này.
Hình 3.2. Cây phả hệ dự chuỗi nucleotide gen H5 củ những i c A/H5N1 cl de 7 (Được lập bằng phương ph p phân tích Neighbor-
joining sử dụng phần mề MEGA 5, gi t ị boostrap 1000)
Khoảng cách tiến hóa của gen HA giữa 2 nhóm A và B cho thấy sự khác biệt giữa các dòng virus n m trong clade này được chỉ ra b ng độ dài của các nhánh trong cây phả hệ (Hình 3.2.) cũng như khoảng cách trung bình nucleotide của chúng đối với tổ tiên clade 7 gần nhất (virus A chicken Shanxi 2 2006). Để định lượng sự dị biệt di truyền giữa các mẫu virus A/H5N1 này và các virus A/H5N1 khác, chúng tôi tiến hành so sánh theo cặp đôi về sự khác biêt theo tỷ lệ phần trăm với chuỗi nucleotide và chuỗi axit amin (Bảng 3.4.)
Trong phân tích sự khác biệt di truyền gen HA của virus A H N1 clade của Việt Nam và các chủng virus A H N1 tham chiếu, chúng tôi chỉ lựa chọn các mẫu mà đã phân lập được virus vì sau này tiếp t c sử d ng các mẫu virus phân lập cho việc nghiên cứu đặc tính kháng nguyên. Kết quả phân tích sự khác biệt di truyền gen HA được trình bày bảng 3.4.
Các chủng virus đại diện từ một số clade H5N1 khác nhau (clade 0, clade 1, clade 4, clade 2.1.3, clade 2.2, clade 2.3.4 và clade ) đã được sử d ng trong phân tích này để cung cấp các tham chiếu nh m so sánh mức độ của sự khác biệt về di truyền giữa các mẫu virus cúm A/H5N1 clade 7 mới phát hiện với nhau và giữa chúng với một số clade khác đã được báo cáo trước đây (Weiss, 2003).
Các gen HA của 2 nhóm virus A hoặc B cho thấy sự khác biệt trong cùng nhóm mức độ rất thấp đối với chuỗi nucleotide cũng như chuỗi axit amin, c thể sự khác biệt trung bình tổng thể về nucleotide là 0,39% và về axit amin là 0,38%. Ngược lại, sự khác nhau giữa hai nhóm A và nhóm B đạt trung bình 4,0 % và ,69% lần lượt các mức độ nucleotide và amino acid trên khắp vùng gen HA mã hóa.
Cũng trong năm 200 – 2009, Trung Quốc cũng phát hiện ra nhiều chủng virus cúm A/H5N1 khác nhau trong đó có virus cúm A/H5N1 thuộc clade 7. Theo nghiên cứu của các nhà khoa học Trung Quốc (Jiang và cs, 2010) các virus A H N1 clade phân lập trong giai đoạn này cũng khác biệt một cách rõ rệt với những virus được phân lập từ trước đó, với sự khác biệt trung bình về chuỗi nucleotide trên gen HA là ,4%.
Bảng 3.3. D nh ch c c chủng i c A/H5N1 dùng đ o nh
à lập cây ph t inh loài dự t ên gen H5
Tên chủng | Clade | Loài ắc | Nă phân lập | Nơi phân lập | S đăng ký ngân hàng gen | |
1 | A/goose/Guangdong/1/96 | 0 | Ngỗng | 1996 | Trung Quốc | AF144305 |
2 | A/Hong Kong/156/97 | 0 | Người | 1997 | Hong Kong | AF036356 |
3 | A/Hong Kong/213/03 | 1 | Người | 2003 | Hong Kong | DQ992842 |
4 | A/Viet Nam/1194/2004 | 1 | Người | 2004 | Việt Nam | EF541402 |
5 | A/Viet Nam/1203/2004 | 1 | Người | 2004 | Việt Nam | HM006759 |
7 | A/Cambodia/JP52a/2005 | 1 | Người | 2005 | Campuchia | EF456805 |
6 | A/Viet Nam/HN30408/2005 | 1 | Người | 2005 | Việt Nam | EF456803 |
9 | A/Muscovy duck/Vietnam/4/2007 | 1 | Ngan | 2007 | Việt Nam | AB593439 |
8 | A/duck/Vietnam/1/2007 | 1 | Vịt | 2007 | Việt Nam | CY029559 |
10 | A/chicken/Indonesia/11/2003 2.1.1 | 2.1 | Gà | 2003 | Indonesia | EF473081 |
11 | A/Indonesia/CDC594/2006 2.1.2 | 2.1 | Người | 2006 | Indonesia | CY014272 |
12 | A/Indonesia/CDC1032/2007 2.1.3 | 2.1 | Người | 2007 | Indonesia | CY019384 |
15 | A/whooper swan/Mongolia/244/2005 | 2.2 | Chim hoang | 2005 | ông Cổ | GU186700 |
16 | A/turkey/Turkey/1/2005 2.2 | 2.2 | Gà Tây | 2005 | Thổ Nhĩ Kỳ | EF619980 |
17 | A/bar-headed goose/Qinghai/1A/2005 | 2.2 | Chim hoang | 2005 | Trung Quốc | DQ659327 |
13 | A/chicken/Egypt/9403-clevb214/2007 | 2.2 | Gà | 2007 | Ai Cập | EU623468 |
14 | A/Egypt/1394-NAMRU3/2007 | 2.2 | Người | 2007 | Ai Cập | EF535817 |
19 | A/Egypt/321-NAMRU3/2007 | 2.2 | Người | 2007 | Ai Cập | EF535822 |
18 | A/Nigeria/6/07 2.2 | 2.2 | Người | 2007 | Nigeria | EU146920 |
21 | A/duck/Hunan/127/2005 2.3.1 | 2.3.1 | Vịt | 2005 | Trung Quốc | DQ320902 |
20 | A/duck/Hunan/139/2005 2.3.1 | 2.3.1 | Vịt | 2005 | Trung Quốc | DQ320903 |
25 | A/Chicken/Shantou/810/05 2.3.2 | 2.3.2 | Gà | 2005 | Trung Quốc | DQ095626 |
22 | A/duck/Vietnam/568/2005 2.3.2 | 2.3.2 | Vịt | 2005 | Việt Nam | DQ320939 |
23 | A/chicken/Primorje/1/2008 2.3.2 | 2.3.2 | Gà | 2008 | Nga | EU676174 |
24 | A/whooper swan/Hokkaido/1/2008 2.3.2 | 2.3.2 | Chim hoang | 2008 | Nhật Bản | AB436550 |
26 | A/chicken/Guiyang/3055/2005 2.3.3 | 2.3.3 | Gà | 2005 | Trung Quốc | DQ992755 |
27 | A/goose/Guiyang/3422/2005 2.3.3 | 2.3.3 | Ngỗng | 2055 | Trung Quốc | DQ992757 |
28 | A/duck/Laos/3295/2006 | 2.3.4 | Vịt | 2006 | Lào | FJ147207 |
29 | A/Japanese white-eye/Hong Kong/1038/2006 | 2.3.4 | Chim | 2006 | Nhật Bản | HM172104 |
Có thể bạn quan tâm!
-
Kết Quả Tiê Phòng Vacxin C Gi Cầ Chương T Ình Q C Gia -
Bảng Tổng Hợp Liệ Tính To N Theo Phương Ph P Reed-Muench -
Ch Ẩn Bị Ix (Hỗn Hợp Phản Ứng Rt- Cr Giải T Ình Tự Gen -
Hiện Tượng Chèn À Xó C C Xit In Tại Vị T Í Cle Ge Ite Củ C C Chủng I A/h5N1 Cl De 7 Phân Lập Ở Việt N -
Cây Phả Hệ Dự T Ên Chuỗi Nucleotide Gen M Củ C C Chủng I A/h5N1 Clade 7 (Được Lập Bằng Phương Ph P Phân Tích Neighbo -Joining Sử Dụng Phần Mề Mega 5, Gi T -
Ki T Đặc Tính Gây Ngưng Kết Hồng Cầu (Phản Ứng Ha)
Xem toàn bộ 162 trang tài liệu này.
Tên chủng | Clade | Loài ắc | Nă phân lập | Nơi phân lập | S đăng ký ngân hàng gen | |
30 | A/Anhui/1/2005 | 2.3.4 | Người | 2006 | Trung Quốc | HM172104 |
31 | A/Muscovy duck/Vietnam/48/2007 | 2.3.4 | Ngan | 2007 | Việt Nam | CY029695 |
32 | A/Muscovy duck/Vietnam/54/2007 | 2.3.4 | Ngan | 2007 | Việt Nam | CY029743 |
33 | A/Viet Nam/HN31242/2007 | 2.3.4 | Người | 2007 | Việt Nam | EU294369 |
34 | A/duck/Guangxi/13/2004 | 2.4 | Vịt | 2004 | Trung Quốc | DQ366338 |
35 | A/chicken/Yunnan/493/2005 | 2.4 | Gà | 2005 | Trung Quốc | DQ095625 |
36 | A/chicken/Yamaguchi/7/2004 | 2.5 | Gà | 2004 | Nhật Bản | GU186708 |
37 | A/chicken/Guangdong/174/04 | 2.5 | Gà | 2004 | Trung Quốc | AY609312 |
39 | A/duck/Fujian/17/2001 | 3 | Vịt | 2001 | Trung Quốc | AY585372 |
38 | A/Chicken/Hong_Kong/715.5/01 | 3 | Gà | 2002 | Hong Kong | AF509025 |
40 | A/goose/Fujian/bb/2003 | 4 | Ngỗng | 2003 | Trung Quốc | DQ997405 |
41 | A/goose/Guiyang/1175/2006 | 4 | Ngỗng | 2006 | Trung Quốc | DQ992771 |
42 | A/goose/Guiyang/337/2006 | 4 | Ngỗng | 2006 | Trung Quốc | DQ992765 |
43 | A/chicken/Jilin/ho/2003 | 5 | Gà | 2003 | Trung Quốc | DQ997355 |
44 | A/chicken/Viet_Nam/Ncvd8/2003 | 5 | Gà | 2003 | Việt Nam | EF541407 |
45 | A/duck/Hubei/wg/2002 | 6 | Vịt | 2002 | Trung Quốc | DQ997094 |
46 | A/blackbird/Hunan/1/2004 | 6 | Chim hoang | 2004 | Trung Quốc | AY741213 |
51 | A/Beijing/01/2003 | 7 | Người | 2003 | Trung Quốc | EF587277 |
47 | A/treesparrow/Henan/2/2004 | 7 | Chim | 2004 | Trung Quốc | AY741217 |
50 | A/domestic mallard/Hunan/79/2005 | 7 | Chim hoang | 2005 | Trung Quốc | EU430511 |
52 | A/chicken/Hebei/326/2005 | 7 | Gà | 2005 | Trung Quốc | DQ343150 |
49 | A/goose/Yunnan/3315/2005 | 7 | Ngỗng | 2005 | Trung Quốc | DQ992794 |
48 | A/duck/Yunnan/5133/2005 | 7 | Vịt | 2005 | Trung Quốc | DQ992801 |
53 | A/chicken/Shanxi/2/2006 | 7 | Gà | 2006 | Trung Quốc | DQ914814 |
55 | A/chicken/Hong_Kong/61.9/02 | 8 | Gà | 2002 | Hong Kong | AY575876 |
54 | A/chicken/Hong_Kongi/86.3/2002 | 8 | Gà | 2002 | Hong Kong | DQ320927 |
57 | A/chicken/Hubei/14/2004 | 9 | Gà | 2004 | Trung Quốc | EF670482 |
56 | A/chicken/Hubei/489/2004 | 9 | Gà | 2004 | Trung Quốc | AY770079 |
ặc dù các gen HA của nhóm A hoặc B có sự khác biệt rất rất thấp trong nhóm về chuỗi nucleotide hoặc axit amin, nhưng sự khác biệt giữa hai nhóm này đạt trung bình 4,1% mức độ nucleotide và , % mức độ axit amin trên gen HA (Bảng 3.4). Mức độ khác biệt cao tương đương với sự thay thế ≥ 30 axit amin giữa các chuỗi protein HA hai nhóm.
Ngoài ra, các số liệu về sự khác biệt trung bình của tất cả các virus clade 7 đã giải trình tự trong nghiên cứu này so với virus H N1 clade có mối quan hệ gần nhất về gen HA là A chicken Shanxi 2 2006 là 3,8% (3,3-3,9%) mức độ nucleotide và ,8% ( ,4-6,1%) mức độ và axit amin (Bảng 3.4). Tóm lại, những dữ liệu này cho thấy virus A chicken Shanxi 2 2006 là tổ tiên gần nhất của clade HA gen được xác định trong nghiên cứu này.
So sánh gen HA của những chủng virus cúm A H N1 clade phân lập Việt Nam với những chủng đại diện từ các clade khác của virus cúm A/H5N1 như clade 0, clade 4, clade 1, clade 2.1.3, clade 2.2 và clade 2.3.4 cho thấy gen HA cấp độ axit amin liên quan gần nhất với virus nguyên mẫu thuộc clade 4 là A/goose/Guiyang/337/2006 với sự khác biệt axit amin là 8,2-9,0% (trung bình là 8,38%) và liên quan xa nhất đối với virus nguyên mẫu clade 1 là A/Vietnam/1203/2004 với sự khác biệt axit amin trung bình là 9,0-9,7% (trung bình là 9,28%).
Trong số những chủng virus A/H5N1 thuộc các clade HA khác nhau, chủng virus cúm A/H5N1 thuộc clade 0 (A/goose/Guangdong/1/1996) được sử d ng để sản xuất vacxin cúm gia cầm H5N1 (Re-1) đang sử d ng Việt Nam từ năm 200 đến nay. Mức độ khác biệt trung bình cấp độ axit amin giữa các chủng virus cúm A/H5N1 clade phân lập Việt Nam đối với virus A goose Guangdong 1 1996 là 8,86% (8,4-9,1%). Đây là sự khác nhau khá lớn về di truyền, do vậy cần phải xác định rõ khi gia cầm được tiêm vacxin H5N1 Re-1, liệu kháng thể tạo ra có thể bảo hộ chống lại virus cúm A/H5N1clade 7 hay không. Điều này sẽ được chúng tôi trình bày rõ tại phần 3.3.6 và 3.3. của luận án này.
Khi phân tích gen HA của 15 mẫu virus cúm A/H5N1clade 7 của Việt Nam, chúng tôi nhận thấy, các mẫu virus nhóm B có những thay đổi về di truyền đáng kể nhất. Bên cạnh sự thay đổi codon thường xuyên được quan sát thấy gây ra hiện tượng thay thế axit amin, còn xác định được có những sự chèn và xóa các codon đầy đủ khi so sánh với các gen HA của những chủng virus tổ tiên thuộc clade (hình 3.3).
Ký hiệ
Bảng 3.4. So nh ức đ kh c biệt về di truyền t ên gen HA củ 5 chủng i A/H5N1 clade 7
ới t chủng th chiế
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
chủng Virus (Xắp xếp theo cl de
Axit amin (%)
A/goose/Guangdong/1/1996 (0) | 3,9 | 3,8 | 4,3 | 4,3 | 4,5 | 3,6 | 6,5 | 8,4 | 9,1 | 9 | 8,8 | 9 | ||
2 | A/goose/Guiyang/337/2006 (4) | 4 | 4,8 | 5,6 | 6,1 | 5,9 | 4,3 | 7 | 8,2 | 9 | 8,2 | 8,1 | 8,4 | |
3 | A/Viet Nam/1203/2004 (1) | 3,5 | 4,5 | 3,2 | 3,4 | 3,4 | 4,7 | 7,2 | 9 | 9,7 | 9,3 | 9,1 | 9,3 | |
4 | A/Indonesia/5/2005 (2.1.3) | 4,4 | 5,4 | 3,7 | 3,6 | 3,2 | 4,5 | 7 | 8,4 | 9,5 | 8,8 | 8,6 | 9 | |
5 | A/bar-headed goose/Qinghai/1/2005 (2.2) | 4,3 | 5,4 | 3,5 | 3,5 | 3,1 | 5 | 7,9 | 8,6 | 9,1 | 9,1 | 9 | 9,1 | |
6 | A/Anhui/1/2005 (2.3.4) | 4 | 5,3 | 3,3 | 3,4 | 3,1 | 4,5 | 7,2 | 9 | 9,1 | 9,1 | 9 | 9,1 | |
7 | A/Beijing/01/2003 (7) | 3,1 | 4 | 3,7 | 4,6 | 4,4 | 4,1 | 5 | 7 | 7,9 | 7,2 | 7 | 7,4 | |
8 | A/chicken/Shanxi/2/2006 (7) | 4,6 | 5,7 | 5,3 | 6 | 6,2 | 5,6 | 3,3 | 5,4 | 5,9 | 5,9 | 5,7 | 6,1 | |
9 | A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008 (7, Vietnam) | 6,2 | 6,5 | 6,6 | 7,1 | 6,9 | 6,8 | 4,4 | 3,3 | 6,1 | 3,2 | 3,1 | 3,4 | |
10 | A/chicken/Vietnam/NCVD-093/2008 (7, Vietnam, nhó A) | 6,3 | 6,7 | 6,8 | 7,3 | 7,1 | 6,9 | 4,7 | 3,6 | 4 | 5,7 | 5,6 | 5,9 | |
11 | A/chicken/Vietnam/NCVD-04/2008 (7, Vietnam, nhó B) | 6,8 | 6,8 | 7 | 7,5 | 7,3 | 7 | 4,7 | 3,9 | 2,8 | 4,1 | 0,2 | 0,5 | |
12 | A/chicken/Vietnam/NCVD-05/2008 (7, Vietnam, nhó B) | 6,7 | 6,7 | 6,9 | 7,5 | 7,2 | 7 | 4,7 | 3,9 | 2,8 | 4,1 | 0,1 | 0,4 | |
13 | A/chicken/Vietnam/NCVD-03/2008 (7, Vietnam, nhó B) | 6,6 | 6,6 | 6,9 | 7,4 | 7,2 | 6,9 | 4,6 | 3,8 | 2,7 | 4 | 0,4 | 0,3 |
Nucleotide (%)
Ghi ch -Chữ số trong ngoặc ( ) là clade của virus - Sự khác biệt axit a in được in đậm
69
Trên cơ s kết quả phân tích chuỗi nucleotide của gen HA (H5), chúng tôi có một số nhận xét sau:
- Các chủng virus A H N1 nhóm B thuộc clade phát hiện Việt Nam đều có hiện tượng xóa mất một axit amin là alanine vị trí 2 3 (dựa trên việc đánh số gen HA (H ) và chèn thêm 3 axit amin vào vị trí polybasic gần cleavage site (chuỗi nối). Hiện tượng chèn axit amin virus nhóm B (các axit amin được gạch bên dưới) tạo ra một chuỗi polybasic vị trí chuỗi nối như sau PQREREGG K *GLF. (xem hình 3.3).
- Trong khi đó, các virus A H N1 nhóm A của clade 7 vẫn duy trì chuỗi trình tự axit amin thông thường PQIEG K *GLF như tất cả các gen HAH5 của các virus cúm A H N1 clade khác. Có một điều đáng chú ý là, virus A/chicken/ Vietnam/NCVD-016 2008, khi phân tích phát sinh loài, chúng tôi nhận thấy virus này dường như là virus tổ tiên (nguồn gốc) của cả 2 nhóm virus A và B thuộc clade 7 Việt Nam, b i chủng virus này có một chuỗi poly basic trung gian mang một axit amin được chèn vào như của nhóm B (PQREGG K *GLF). (hình 3.3).
- Ở một chủng virus trung gian khác giữa 2 nhóm A và B là chủng A/chicken/Vietnam/NCVD-swab19 2008, cũng có chuỗi trình tự trung gian với alanine bị xóa tại vị trí 2 3 và hiện tượng chèn một axit amin (glycine) gần vị trí cleavage site tạo nên chuỗi trình tự polybasic PQIEGGRRRKR*G giống như nhóm B (hình 3.3).
- Tất cả 15 mẫu virus cúm A H N1clade phân lập Việt Nam đều chứa motif glycosyl hóa liên kết-N còn nguyên vẹn tại vị trí 1 4-156 (NNT) phù hợp với sự glycosyl hóa thông thường vị trí này.