Cây Phả Hệ Dự Chuỗi Nucleotide Gen H5 Củ Những I C A/h5N1 Cl De 7 (Được Lập

Tên của các mẫu đã phân lập được virus cúm A/H5N1và tên của các mẫu

NA đã phát hiện dương tính virus cúm A/H5N1 được đặt theo danh pháp quốc tế: Tên type cúm A Loài Tên nước Tên viết tắt Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương b ng tiếng Anh-ký hiệu của virus hoặc mẫu. Kết quả chi tiết về các mẫu đã phân lập và phát hiện dương tính virus cúm A/H5N1 được trình bày bảng 3.2.

Tìm kiếm sự tương đồng của các virus cúm được thực hiện b ng chương trình BLAST trên ngân hàng dữ liệu (NCBI, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast) sử d ng chuỗi nucleotide của gen HA cho thấy, các mẫu virus này có độ tương đồng rất cao với hai chủng virus đã được mô tả trước đây là virus A chicken Hebei 326 200 H N1 và virus A chicken Shanxi 2 2006 H N1 (độ tương đồng trung bình của gen HA mức độ nuleotide lần lượt là 96,1% và 96,3%) và cả 1 mẫu này đều được sắp xếp n m trong một nhóm.

Phân tích trình tự gen b ng phương pháp lập cây phả hệ (phylogenetic tree) để tìm kiếm tổ tiên (nguồn gốc) của 15 mẫu virus cúm này cho thấy gen HA của các virus n m chung một nhóm với một nhóm ph của các virus cúm H N1 trước đây có gen HA được phân loại là clade . Tên một số chủng virus cúm A H N1 của tất cả các clade từ 0-9 sử d ng để xây dựng cây phát sinh loài gen HA H được thể hiện bảng 3.3. Trong số mẫu xét nghiệm trên đây chúng tôi không phát hiện thấy mẫu virus A/H5N1 thuộc clade 2.3.4. Điều này cũng có thể hợp lý vì thực ra virus A H N1 clade 2.3.4 đã xâm nhập vào Việt Nam từ năm 2007.

Một điều chú ý là, khi quan sát trên cây phát sinh loài dựa trên gen HA có thể thể thấy rõ có 13 trong số 15 mẫu virus cúm A H N1 clade của Việt Nam tách thành 2 nhóm nhỏ rõ rệt (xem hình 3.2.), tạm được gọi là nhóm A và nhóm B để phân tích (tên c thể của từng mẫu trong mỗi nhóm A và B được tình bày trong bảng 3.2.). Thêm vào đó, 2 mẫu virus cúm A/Chicken/Vietnam/NCVD- 016 2008 và A chicken Vietnam NCVD-swab19 2008 dường như đã chiếm vị trí

trung gian trong cây phả hệ, gần với gốc của 2 nhóm nhưng không n m trong 2 nhóm này.

Hình 3.2. Cây phả hệ dự chuỗi nucleotide gen H5 củ những i c A/H5N1 cl de 7 (Được lập bằng phương ph p phân tích Neighbor-

joining sử dụng phần mề MEGA 5, gi t ị boostrap 1000)

Khoảng cách tiến hóa của gen HA giữa 2 nhóm A và B cho thấy sự khác biệt giữa các dòng virus n m trong clade này được chỉ ra b ng độ dài của các nhánh trong cây phả hệ (Hình 3.2.) cũng như khoảng cách trung bình nucleotide của chúng đối với tổ tiên clade 7 gần nhất (virus A chicken Shanxi 2 2006). Để định lượng sự dị biệt di truyền giữa các mẫu virus A/H5N1 này và các virus A/H5N1 khác, chúng tôi tiến hành so sánh theo cặp đôi về sự khác biêt theo tỷ lệ phần trăm với chuỗi nucleotide và chuỗi axit amin (Bảng 3.4.)

Trong phân tích sự khác biệt di truyền gen HA của virus A H N1 clade của Việt Nam và các chủng virus A H N1 tham chiếu, chúng tôi chỉ lựa chọn các mẫu mà đã phân lập được virus vì sau này tiếp t c sử d ng các mẫu virus phân lập cho việc nghiên cứu đặc tính kháng nguyên. Kết quả phân tích sự khác biệt di truyền gen HA được trình bày bảng 3.4.

Các chủng virus đại diện từ một số clade H5N1 khác nhau (clade 0, clade 1, clade 4, clade 2.1.3, clade 2.2, clade 2.3.4 và clade ) đã được sử d ng trong phân tích này để cung cấp các tham chiếu nh m so sánh mức độ của sự khác biệt về di truyền giữa các mẫu virus cúm A/H5N1 clade 7 mới phát hiện với nhau và giữa chúng với một số clade khác đã được báo cáo trước đây (Weiss, 2003).

Các gen HA của 2 nhóm virus A hoặc B cho thấy sự khác biệt trong cùng nhóm mức độ rất thấp đối với chuỗi nucleotide cũng như chuỗi axit amin, c thể sự khác biệt trung bình tổng thể về nucleotide là 0,39% và về axit amin là 0,38%. Ngược lại, sự khác nhau giữa hai nhóm A và nhóm B đạt trung bình 4,0 % và ,69% lần lượt các mức độ nucleotide và amino acid trên khắp vùng gen HA mã hóa.

Cũng trong năm 200 – 2009, Trung Quốc cũng phát hiện ra nhiều chủng virus cúm A/H5N1 khác nhau trong đó có virus cúm A/H5N1 thuộc clade 7. Theo nghiên cứu của các nhà khoa học Trung Quốc (Jiang và cs, 2010) các virus A H N1 clade phân lập trong giai đoạn này cũng khác biệt một cách rõ rệt với những virus được phân lập từ trước đó, với sự khác biệt trung bình về chuỗi nucleotide trên gen HA là ,4%.

Bảng 3.3. D nh ch c c chủng i c A/H5N1 dùng đ o nh

à lập cây ph t inh loài dự t ên gen H5

Stt

Tên chủng	Clade	Loài ắc	Nă phân lập	Nơi phân lập	S đăng ký ngân hàng gen
1	A/goose/Guangdong/1/96	0	Ngỗng	1996	Trung Quốc	AF144305
2	A/Hong Kong/156/97	0	Người	1997	Hong Kong	AF036356
3	A/Hong Kong/213/03	1	Người	2003	Hong Kong	DQ992842
4	A/Viet Nam/1194/2004	1	Người	2004	Việt Nam	EF541402
5	A/Viet Nam/1203/2004	1	Người	2004	Việt Nam	HM006759
7	A/Cambodia/JP52a/2005	1	Người	2005	Campuchia	EF456805
6	A/Viet Nam/HN30408/2005	1	Người	2005	Việt Nam	EF456803
9	A/Muscovy duck/Vietnam/4/2007	1	Ngan	2007	Việt Nam	AB593439
8	A/duck/Vietnam/1/2007	1	Vịt	2007	Việt Nam	CY029559
10	A/chicken/Indonesia/11/2003 2.1.1	2.1	Gà	2003	Indonesia	EF473081
11	A/Indonesia/CDC594/2006 2.1.2	2.1	Người	2006	Indonesia	CY014272
12	A/Indonesia/CDC1032/2007 2.1.3	2.1	Người	2007	Indonesia	CY019384
15	A/whooper swan/Mongolia/244/2005	2.2	Chim hoang	2005	ông Cổ	GU186700
16	A/turkey/Turkey/1/2005 2.2	2.2	Gà Tây	2005	Thổ Nhĩ Kỳ	EF619980
17	A/bar-headed goose/Qinghai/1A/2005	2.2	Chim hoang	2005	Trung Quốc	DQ659327
13	A/chicken/Egypt/9403-clevb214/2007	2.2	Gà	2007	Ai Cập	EU623468
14	A/Egypt/1394-NAMRU3/2007	2.2	Người	2007	Ai Cập	EF535817
19	A/Egypt/321-NAMRU3/2007	2.2	Người	2007	Ai Cập	EF535822
18	A/Nigeria/6/07 2.2	2.2	Người	2007	Nigeria	EU146920
21	A/duck/Hunan/127/2005 2.3.1	2.3.1	Vịt	2005	Trung Quốc	DQ320902
20	A/duck/Hunan/139/2005 2.3.1	2.3.1	Vịt	2005	Trung Quốc	DQ320903
25	A/Chicken/Shantou/810/05 2.3.2	2.3.2	Gà	2005	Trung Quốc	DQ095626
22	A/duck/Vietnam/568/2005 2.3.2	2.3.2	Vịt	2005	Việt Nam	DQ320939
23	A/chicken/Primorje/1/2008 2.3.2	2.3.2	Gà	2008	Nga	EU676174
24	A/whooper swan/Hokkaido/1/2008 2.3.2	2.3.2	Chim hoang	2008	Nhật Bản	AB436550
26	A/chicken/Guiyang/3055/2005 2.3.3	2.3.3	Gà	2005	Trung Quốc	DQ992755
27	A/goose/Guiyang/3422/2005 2.3.3	2.3.3	Ngỗng	2055	Trung Quốc	DQ992757
28	A/duck/Laos/3295/2006	2.3.4	Vịt	2006	Lào	FJ147207
29	A/Japanese white-eye/Hong Kong/1038/2006	2.3.4	Chim	2006	Nhật Bản	HM172104

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 162 trang tài liệu này.

Stt

Tên chủng	Clade	Loài ắc	Nă phân lập	Nơi phân lập	S đăng ký ngân hàng gen
30	A/Anhui/1/2005	2.3.4	Người	2006	Trung Quốc	HM172104
31	A/Muscovy duck/Vietnam/48/2007	2.3.4	Ngan	2007	Việt Nam	CY029695
32	A/Muscovy duck/Vietnam/54/2007	2.3.4	Ngan	2007	Việt Nam	CY029743
33	A/Viet Nam/HN31242/2007	2.3.4	Người	2007	Việt Nam	EU294369
34	A/duck/Guangxi/13/2004	2.4	Vịt	2004	Trung Quốc	DQ366338
35	A/chicken/Yunnan/493/2005	2.4	Gà	2005	Trung Quốc	DQ095625
36	A/chicken/Yamaguchi/7/2004	2.5	Gà	2004	Nhật Bản	GU186708
37	A/chicken/Guangdong/174/04	2.5	Gà	2004	Trung Quốc	AY609312
39	A/duck/Fujian/17/2001	3	Vịt	2001	Trung Quốc	AY585372
38	A/Chicken/Hong_Kong/715.5/01	3	Gà	2002	Hong Kong	AF509025
40	A/goose/Fujian/bb/2003	4	Ngỗng	2003	Trung Quốc	DQ997405
41	A/goose/Guiyang/1175/2006	4	Ngỗng	2006	Trung Quốc	DQ992771
42	A/goose/Guiyang/337/2006	4	Ngỗng	2006	Trung Quốc	DQ992765
43	A/chicken/Jilin/ho/2003	5	Gà	2003	Trung Quốc	DQ997355
44	A/chicken/Viet_Nam/Ncvd8/2003	5	Gà	2003	Việt Nam	EF541407
45	A/duck/Hubei/wg/2002	6	Vịt	2002	Trung Quốc	DQ997094
46	A/blackbird/Hunan/1/2004	6	Chim hoang	2004	Trung Quốc	AY741213
51	A/Beijing/01/2003	7	Người	2003	Trung Quốc	EF587277
47	A/treesparrow/Henan/2/2004	7	Chim	2004	Trung Quốc	AY741217
50	A/domestic mallard/Hunan/79/2005	7	Chim hoang	2005	Trung Quốc	EU430511
52	A/chicken/Hebei/326/2005	7	Gà	2005	Trung Quốc	DQ343150
49	A/goose/Yunnan/3315/2005	7	Ngỗng	2005	Trung Quốc	DQ992794
48	A/duck/Yunnan/5133/2005	7	Vịt	2005	Trung Quốc	DQ992801
53	A/chicken/Shanxi/2/2006	7	Gà	2006	Trung Quốc	DQ914814
55	A/chicken/Hong_Kong/61.9/02	8	Gà	2002	Hong Kong	AY575876
54	A/chicken/Hong_Kongi/86.3/2002	8	Gà	2002	Hong Kong	DQ320927
57	A/chicken/Hubei/14/2004	9	Gà	2004	Trung Quốc	EF670482
56	A/chicken/Hubei/489/2004	9	Gà	2004	Trung Quốc	AY770079

ặc dù các gen HA của nhóm A hoặc B có sự khác biệt rất rất thấp trong nhóm về chuỗi nucleotide hoặc axit amin, nhưng sự khác biệt giữa hai nhóm này đạt trung bình 4,1% mức độ nucleotide và , % mức độ axit amin trên gen HA (Bảng 3.4). Mức độ khác biệt cao tương đương với sự thay thế ≥ 30 axit amin giữa các chuỗi protein HA hai nhóm.

Ngoài ra, các số liệu về sự khác biệt trung bình của tất cả các virus clade 7 đã giải trình tự trong nghiên cứu này so với virus H N1 clade có mối quan hệ gần nhất về gen HA là A chicken Shanxi 2 2006 là 3,8% (3,3-3,9%) mức độ nucleotide và ,8% ( ,4-6,1%) mức độ và axit amin (Bảng 3.4). Tóm lại, những dữ liệu này cho thấy virus A chicken Shanxi 2 2006 là tổ tiên gần nhất của clade HA gen được xác định trong nghiên cứu này.

So sánh gen HA của những chủng virus cúm A H N1 clade phân lập Việt Nam với những chủng đại diện từ các clade khác của virus cúm A/H5N1 như clade 0, clade 4, clade 1, clade 2.1.3, clade 2.2 và clade 2.3.4 cho thấy gen HA cấp độ axit amin liên quan gần nhất với virus nguyên mẫu thuộc clade 4 là A/goose/Guiyang/337/2006 với sự khác biệt axit amin là 8,2-9,0% (trung bình là 8,38%) và liên quan xa nhất đối với virus nguyên mẫu clade 1 là A/Vietnam/1203/2004 với sự khác biệt axit amin trung bình là 9,0-9,7% (trung bình là 9,28%).

Trong số những chủng virus A/H5N1 thuộc các clade HA khác nhau, chủng virus cúm A/H5N1 thuộc clade 0 (A/goose/Guangdong/1/1996) được sử d ng để sản xuất vacxin cúm gia cầm H5N1 (Re-1) đang sử d ng Việt Nam từ năm 200 đến nay. Mức độ khác biệt trung bình cấp độ axit amin giữa các chủng virus cúm A/H5N1 clade phân lập Việt Nam đối với virus A goose Guangdong 1 1996 là 8,86% (8,4-9,1%). Đây là sự khác nhau khá lớn về di truyền, do vậy cần phải xác định rõ khi gia cầm được tiêm vacxin H5N1 Re-1, liệu kháng thể tạo ra có thể bảo hộ chống lại virus cúm A/H5N1clade 7 hay không. Điều này sẽ được chúng tôi trình bày rõ tại phần 3.3.6 và 3.3. của luận án này.

Khi phân tích gen HA của 15 mẫu virus cúm A/H5N1clade 7 của Việt Nam, chúng tôi nhận thấy, các mẫu virus nhóm B có những thay đổi về di truyền đáng kể nhất. Bên cạnh sự thay đổi codon thường xuyên được quan sát thấy gây ra hiện tượng thay thế axit amin, còn xác định được có những sự chèn và xóa các codon đầy đủ khi so sánh với các gen HA của những chủng virus tổ tiên thuộc clade (hình 3.3).

Ký hiệ

Bảng 3.4. So nh ức đ kh c biệt về di truyền t ên gen HA củ 5 chủng i A/H5N1 clade 7

ới t chủng th chiế

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

chủng Virus (Xắp xếp theo cl de

Axit amin (%)

A/goose/Guangdong/1/1996 (0)		3,9	3,8	4,3	4,3	4,5	3,6	6,5	8,4	9,1	9	8,8	9
2	A/goose/Guiyang/337/2006 (4)	4		4,8	5,6	6,1	5,9	4,3	7	8,2	9	8,2	8,1	8,4
3	A/Viet Nam/1203/2004 (1)	3,5	4,5		3,2	3,4	3,4	4,7	7,2	9	9,7	9,3	9,1	9,3
4	A/Indonesia/5/2005 (2.1.3)	4,4	5,4	3,7		3,6	3,2	4,5	7	8,4	9,5	8,8	8,6	9
5	A/bar-headed goose/Qinghai/1/2005 (2.2)	4,3	5,4	3,5	3,5		3,1	5	7,9	8,6	9,1	9,1	9	9,1
6	A/Anhui/1/2005 (2.3.4)	4	5,3	3,3	3,4	3,1		4,5	7,2	9	9,1	9,1	9	9,1
7	A/Beijing/01/2003 (7)	3,1	4	3,7	4,6	4,4	4,1		5	7	7,9	7,2	7	7,4
8	A/chicken/Shanxi/2/2006 (7)	4,6	5,7	5,3	6	6,2	5,6	3,3		5,4	5,9	5,9	5,7	6,1
9	A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008 (7, Vietnam)	6,2	6,5	6,6	7,1	6,9	6,8	4,4	3,3		6,1	3,2	3,1	3,4
10	A/chicken/Vietnam/NCVD-093/2008 (7, Vietnam, nhó A)	6,3	6,7	6,8	7,3	7,1	6,9	4,7	3,6	4		5,7	5,6	5,9
11	A/chicken/Vietnam/NCVD-04/2008 (7, Vietnam, nhó B)	6,8	6,8	7	7,5	7,3	7	4,7	3,9	2,8	4,1		0,2	0,5
12	A/chicken/Vietnam/NCVD-05/2008 (7, Vietnam, nhó B)	6,7	6,7	6,9	7,5	7,2	7	4,7	3,9	2,8	4,1	0,1		0,4
13	A/chicken/Vietnam/NCVD-03/2008 (7, Vietnam, nhó B)	6,6	6,6	6,9	7,4	7,2	6,9	4,6	3,8	2,7	4	0,4	0,3

Nucleotide (%)

Ghi ch -Chữ số trong ngoặc ( ) là clade của virus - Sự khác biệt axit a in được in đậm

Trên cơ s kết quả phân tích chuỗi nucleotide của gen HA (H5), chúng tôi có một số nhận xét sau:

- Các chủng virus A H N1 nhóm B thuộc clade phát hiện Việt Nam đều có hiện tượng xóa mất một axit amin là alanine vị trí 2 3 (dựa trên việc đánh số gen HA (H ) và chèn thêm 3 axit amin vào vị trí polybasic gần cleavage site (chuỗi nối). Hiện tượng chèn axit amin virus nhóm B (các axit amin được gạch bên dưới) tạo ra một chuỗi polybasic vị trí chuỗi nối như sau PQREREGG K *GLF. (xem hình 3.3).

- Trong khi đó, các virus A H N1 nhóm A của clade 7 vẫn duy trì chuỗi trình tự axit amin thông thường PQIEG K *GLF như tất cả các gen HAH5 của các virus cúm A H N1 clade khác. Có một điều đáng chú ý là, virus A/chicken/ Vietnam/NCVD-016 2008, khi phân tích phát sinh loài, chúng tôi nhận thấy virus này dường như là virus tổ tiên (nguồn gốc) của cả 2 nhóm virus A và B thuộc clade 7 Việt Nam, b i chủng virus này có một chuỗi poly basic trung gian mang một axit amin được chèn vào như của nhóm B (PQREGG K *GLF). (hình 3.3).

- Ở một chủng virus trung gian khác giữa 2 nhóm A và B là chủng A/chicken/Vietnam/NCVD-swab19 2008, cũng có chuỗi trình tự trung gian với alanine bị xóa tại vị trí 2 3 và hiện tượng chèn một axit amin (glycine) gần vị trí cleavage site tạo nên chuỗi trình tự polybasic PQIEGGRRRKR*G giống như nhóm B (hình 3.3).

- Tất cả 15 mẫu virus cúm A H N1clade phân lập Việt Nam đều chứa motif glycosyl hóa liên kết-N còn nguyên vẹn tại vị trí 1 4-156 (NNT) phù hợp với sự glycosyl hóa thông thường vị trí này.