Nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng Bacillus Thuringiensis sinh Protein tinh thể diệt côn trùng cánh vảy

2. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu

1.1. Mục tiêu

- Sàng lọc được các chủng Bacillus thuringiensissubsp. aizawai (Bta) có hoạt tính diệt côn trùng bộ cánh vảy.

- Tách dòng và đọc trình tự được gene cry1C của các chủng Bta đã sàng lọc có hoạt tính diệt côn trùng bộ cánh vảy.

1.2. Nội dung

- Thu thập các chủng B. thuringiensis phân lập tại một số địa điểm ở Thái Nguyên.

- Sàng lọc các chủng Bt có hoạt tính diệt côn trùng bộ cánh vảy bằng phương pháp huyết thanh học.

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 63 trang tài liệu này.

- Thử hoạt tính diệt côn trùng bộ cánh vảy của các chủng Bta thu nhận được.

- Phát hiện các chủng Bta mang gene cry1C từ các chủng có hoạt tính diệt côn trùng cánh vảy bằng phương pháp PCR.

- Tách dòng gene cry1C mã hóa protein tinh thể diệt côn trùng bộ cánh vảy.

- Xác định trình tự đoạn gene cry1C đã được tách dòng và so sánh với trình tự gene trên Gene Bank.

Chương 1. TỔNG QUAN

1.1. Đại cương về Bacillus thuringiensis

1.1.1. Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng B. thuringiensis

Trên thế giới

B. thuringiensis là vi khuẩn có hoạt tính diệt côn trùng do nhà khoa học Nhật Bản Ishitawa phát hiện năm 1901 khi ông nghiên cứu về bệnh ở tằm dâu, đã phát hiện ra nguyên nhân gây bệnh cho tằm là do một loại vi khuẩn thuộc chi Bacillus. Ông đặt tên vi khuẩn này là Bacillus sotto [8].

Năm 1911, Berliner (người Đức) đã phân lập được một loại vi khuẩn gây bệnh từ xác ấu trùng bướm phấn Địa Trung Hải ở vùng Thuringien và ông đã đặt tên là Bacillus thuringiensis năm 1915 [8].

Năm 1930, Bacillus thuringiensis đã được thử nghiệm chống sâu đục thân ở Châu Âu.

Năm 1938, chế phẩm Bt đã được sản xuất lần đầu tiên để diệt sâu hại lúa mì tại Pháp.

Năm 1953, Hannay và Fitzjame đã phát hiện ra thể vùi và công bố tinh thể có bản chất là protein [8].

Năm 1957, công ty Sandoz (Thụy Sỹ) đã sản xuất thuốc “Thuricide” với khối lượng lớn từ chủng B. thuringiensis subsp. kurstaki. Năm 1956, Angus đã chứng minh hoạt tính diệt sâu là do tinh thể tách ra từ tế bào và bào tử [33].

Năm 1962, de Barjac và Bonnefoi đã đưa ra một phương pháp phân loại mới cho các chủng Bt và Bacilus sphaericus (Bs) bằng phương pháp huyết thanh.

Năm 1970, công nghiệp sản xuất Bt phát triển mạnh khi phát hiện ra chủng Btk HD1 có hoạt tính diệt sâu cao.

Năm 1977, Goldberg và Margarit đã phát hiện dưới loài Bt var. israelensis diệt ấu trùng muỗi và ruồi thuộc bộ hai cánh. Phát hiện này đã chứng tỏ phổ hoạt tính của Bt không chỉ bó hẹp trong bộ cánh vảy (Lepidoptera) mà còn với cả bộ hai cánh (Diptera) [14].

Năm 1981, Schnepf và Whiteley lần đầu tiên đã phân lập và tách dòng gene độc tố mã hóa diệt sâu của chủng Bt subsp. kurstaki HD-1 gọi là gene cry1 và cho biểu hiện gene này ở E. coli. Từ đó một số lượng lớn các gene đã được tách dòng và nghiên cứu đặc tính.

Năm 1983, phổ hoạt tính của Bt lại được nâng lên khi Krieg và cộng sự phát hiện ra dưới loài Bt subsp. tenebrionis diệt bộ cánh cứng (Coleoptera). Chủng này được phân lập từ bọ cánh cứng Tenebrio molitar. Sau đó, công ty Mycogen phát hiện ra một chủng tương tự Bt subsp. morrisoni đặt tên là Bt subsp. Sandiego và đã tổng hợp được chuỗi gene độc tố của chúng [14].

Năm 1985, gene cry Bt được chuyển vào cây trồng để diệt sâu và đến năm 1995 các cây chuyển gene đầu tiên đã được đưa vào sản xuất và ứng dụng.

Từ năm 1987 -1992, người ta cũng đã phát hiện thấy Bt có khả năng diệt giun tròn thực vật, diệt ve bét, mạt thuộc bộ Trematoda và diệt kiến thuộc bộ Hymenoptera. Đến nay rất nhiều chủng Bt được phát hiện, nghiên cứu về các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa và được sử dụng để sản xuất có tính thương mại cao [10, 13, 25].

Năm 1995, cây chuyển gene thương phẩm đầu tiên được đưa vào sản xuất, từ đó một chương mới về ứng dụng của Bt vào cây trồng nông nghiệp – cây trồng công nghệ sinh học và thực phẩm chuyển gene [2].

Năm 2003, Sakai và cs đã công bố thông tin protein tinh thể của Bt có khả năng diệt tế bào ung thư.

Năm 2005, Ohba và N.D. Binh đã phát hiện protein của 4 dưới loài Bt phân lập ở Việt Nam có thể hạn chế sự phát triển của tế bào ung thư cổ tử cung ở người [10,13].

Đến nay rất nhiều chủng Bt được phát hiện, nghiên cứu và được sử dụng để sản xuất có tính thương mại cao.

Ở Việt Nam

Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng về Bacillus thuringiensis ở Việt Nam được khoảng 40 năm chia làm 3 thời kỳ chính với nhiều công trình của các tác giả như Nguyễ n Công Bì nh , Phạm Bá Nhạ, Ngô Đình Bính, những người đầu tiên mở đường nghiên cứu về B. thuringiensis tại Việt Nam [10].

Thời kỳ mở đầu nghiên cứu

Các công bố khoa học về nghiên cứu B. thuringiensis ở thời kỳ này còn rất ít. Vào thời kỳ này một số viện nghiên cứu đã tiến hành sản xuất B. thuringiensis bằng phương pháp thủ công và bán công nghiệp trong phòng thí nghiệm sử dụng các chủng Bacillus thuringiensis thuộc loài phụ Bacillus thuringiensis var. thuringiensis, B. thuringiensis var. kurstaki. Các chế phẩm B. thuringiensis này đã được sử dụng cho vùng rau ngoại thành Hà Nội và đã thu được các kết quả tốt. Tuy nhiên từ 1984 đến 1993, việc sản xuất chế phẩm B. thuringiensis đã bị giảm sút vì các chế phẩm B. thuringiensis sản xuất ra có chất lượng không cao nên tốc độ tiêu thụ giảm [8,10].

Thời kỳ sản xuất và ứng dụng (1984-1994)

Ở thời kỳ này, các chế phẩm B. thuringiensis sản xuất theo phương pháp dịch thể được áp dụng rộng rãi, có hiệu quả phòng trừ rất rò rệt, hơn nữa có giá thành hợp lý nên được nông dân ưa chuộng. Sau đó, một số đơn vị thuộc các trường đại học đề xuất phương án sản xuất chế phẩm B. thuringiensis theo phương pháp lên men hở không cần vô trùng nhưng đã không thu được kết quả tốt [10].

Thời kỳ nghiên cứu cơ bản, ứng dụng và phát triển (từ năm 1994 đến nay)

Cuối thời kỳ sản xuất và ứng dụng, chế phẩm B. thuringiensis kém chất lượng không tiêu thụ được. Sản xuất và ứng dụng B. thuringiensis bước vào thời kỳ thoái trào, các nhà nghiên cứu buộc phải quay lại nghiên cứu cơ bản để phục vụ cho xây dựng công nghệ sản xuất và cơ sở ứng dụng. Do vậy các nhà khoa

học đã chuyển việc nghiên cứu B. thuringiensis sang hướng mới như tìm kiếm các chủng B. thuringiensis có phổ diệt sâu rộng, hoạt tính diệt sâu cao để phục hồi lại việc sản xuất thuốc trừ sâu B. thuringiensis và ứng dụng công nghệ chuyển gene B. thuringiensis phục vụ sản xuất [10].

Các nghiên cứu của Ngô Đình Bính và cs cho thấy các chủng B. thuringiensis phân lập tại Việt Nam rất đa dạng về thành phần loài [6]. Năm 2005, Lê Thị Minh Thành và cs khi nghiên cứu sự phân bố và đa dạng gen e của Bt phân lập ở một số tỉnh thuộc vùng Đông Bắc Bộ đã phân loại được 22 dưới loài trên tổng số 82 dưới loài đã được phát hiện trên thế giới [7, 11].

Trên cơ sở phát hiện, tách dòng và đọc trình tự gene có trong các chủng B. thuringiensis phân lập tại Việt Nam, Ngô Đình Bính và cs đã tách dòng và biểu hiện gene mã hóa tổng hợp protein Cry1C và Cry1D diệt sâu khoang trong E. coli thu được các protein tái tổ hợp có hiệu quả diệt sâu cao hơn so với đối chứng [5,12].

Ở Việt Nam, những nghiên cứu về lĩnh vực chuyển gene kháng côn trùng vào cây trồng để tạo ra các cây có khả năng kháng các sâu bệnh mới đã được bắt đầu từ cuối thế kỷ 20. Có rất nhiều nghiên cứu chuyển gene cry1A kháng sâu vào cây trồng thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens để tạo ra các giống cây trồng có khả năng kháng sâu như: cây đậu xanh, cây cải bông. [9,13]. Năm 2003, Phan Đình Pháp và cs đã chuyển gene cry1B vào cây lúa thông qua phương pháp sử dụng súng bắn gen. Năm 2005, gene kháng sâu trên được chuyển vào cây cà tím thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens [14].

1.1.2. Đặc điểm hình thái của Bt

Bt là đối tượng được nghiên cứu nhiều nhất trong số các tác nhân vi sinh vật gây bệnh cho côn trùng. Bt có đặc điểm là vi khuẩn đất, tế bào có dạng que, kích thước 3-6m, có thể đứng riêng rẽ hoặc tạo thành chuỗi. Bt hô hấp hiếu khí không bắt buộc, bắt màu Gram dương, có khả năng di động nhờ tiêm mao mọc trên bề mặt tế bào [26,27,28].

Khuẩn lạc của Bt có màu trắng sữa, hình tròn, bề mặt xù xì, viền khuẩn lạc nhăn, đường kính có thể đạt tới 8-10m. Một số chủng Bt xuất hiện khuẩn lạc dạng trơn nhẵn.

Mỗi tế bào Bt khi trưởng thành có khả năng sinh bào tử và tinh thể độc bản chất là protein, có khả năng diệt côn trùng. Bào tử Bt có dạng hình trụ hoặc hình trứng, kích thước 1,6-2m. Bào tử được hình thành trong điều kiện môi trường bất lợi như nhiệt độ cao, môi trường nghèo chất dinh dưỡng. Khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử có thể nảy mầm thành tế bào sinh dưỡng [21,27].

Hình 1.1. Bào tử và tinh thể của Bacillus thuringiensis [21]

Cùng với quá trình tạo bào tử, các tinh thể protein độc tố cũng được tổng hợp. Tinh thể có kích thước 0,6-2m, có hình dạng không cố định (có thể là hình lập phương, hình lưỡng tháp hoặc hình cầu). Tinh thể có thể chiếm tới 30% trọng lượng khô của tế bào. Khi nhuộm tế bào Bt bằng thuốc nhuộm fushin và quan sát dưới kính hiển vi có thể nhận thấy tinh thể Bt bắt màu hồng sẫm còn bào tử thì bắt màu hồng nhạt [27].

Hình 1.2. Tinh thể của vi khuẩn Bacillus thuringiensis [21]

1.1.3. Đặc điểm sinh hoá

Bt không lên men sinh axid trong môi trường chứa arrabinorase, xylose, manitol, nhưng tạo axit ở môi trường chứa glucose. Có khả năng thủy phân tinh bột, khử nitrate thành nitrite, phát triển được ở môi trường chứa 0,001% lysozyme, 7% NaCl với pH 5,7, có phản ứng với lòng đỏ trứng gà. Bt không có khả năng khử amine ủa phenilalanin, không sử dụng axid citric, không khử muối sulfate (www.phenyl alanine tailieu.vn).

Bt có khả năng sinh trưởng phát triển ở nhiệt độ dao động từ 15-450C. Nhiệt độ tối ưu là 28- 32οC.

Bt không mẫn cảm với pH, pH tối ưu cho sự phát triển của Bt là pH= 7. Bt có khả năng oxy hóa hydrocarbon đến axid hữu cơ và dioxide carbon theo chu trình Embden- Meyerhoff- Panas [6, 7, 8].

1.1.4. Đặc điểm phân loại

Có rất nhiều phương pháp phân loại B. thuringiensis khác nhau: Phân loại Bt dựa trên đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh hoá (Heimpel và Angus, 1958).Phân loại theo typ huyết thanh kháng nguyên - H. Phân loại bằng thực khuẩn thể dựa trên tính mẫn cảm khác nhau với các thực khuẩn thể khác nhau.Phân loại theo typ huyết thanh kháng protein tinh thể.Phân loại theo loại hình enzym lipase.Phân loại theo nguồn bệnh.

Tuy nhiên, các phương pháp phân loại này vẫn còn tồn tại những mặt hạn

chế.

Năm 1962, de Barjac và Bonnefoi đã đưa ra một phương pháp phân loại mới cho Bt bằng phản ứng huyết thanh và đã mô tả 27 type huyết thanh chính có hoạt tính diệt côn trùng thuộc bộ cánh vảy, hai cánh, cánh cứng, nguyên sinh động vật, động vật chân khớp. Phương pháp phân loại theo type huyết thanh H được sử dụng chủ yếu do đơn giản và có tính đặc hiệu cao. Phương pháp phân loại này, dựa trên phản ứng ngưng kết giữa kháng nguyên tiêm mao H của vi khuẩn với kháng huyết thanh tương ứng. Số lượng các type huyết thanh và các chủng phân loại theo huyết thanh tăng cùng với tổng số các chủng phân lập được. Cho đến năm 2003, người ta đã phát hiện được 69 typ huyết thanh bao gồm 82 thứ huyết thanh khác nhau của B. thuringiensis. Theo hệ thống phân loại thì B. thuringiensis subsp. aizawai thuộc type huyết thanh số 7 (Theo Bonnefoi & de Barjac 1963) [5].

Bảng phân loại theo type huyết thanh H được trung tâm quốc tế B. thuringiensis đặt tại Viện Pasteur, Paris khuyến cáo sử dụng cho tất cả các phòng thí nghiệm Bt trên thế giới từ năm 1982 và có 69 type huyết thanh H.

1.1.5. Phân loại gene độc tố của vi khuẩn Bacillus thuringiensis

Kích thước hệ gene của B. thuringiensis vào khoảng 2,4- 5,7 triệu bp. Thể nhân ở vi khuẩn là dạng nhân nguyên thủy chưa có màng nhân nên chưa có hình dạng nhất định và được gọi là vùng nhân. Khi nhuộm màu tế bào bằng Feulgen có thể thấy nhân hiện màu tím. Trong vùng nhân có một NST duy nhất dạng vòng chứa 1 sợi DNA xoắn kép. Thể nhân chứa đựng thông tin di truyền của Bt. Hầu hết các chủng B. thuringiensis phân lập mang các nhân tố di truyền ngoài nhiễm sắc thể (NST), các nhân tố di truyền này có thể đóng vòng hoặc không đóng vòng. Trên thế giới người ta đã mô tả được bản đồ cấu trúc gene tự nhiên cho một số chủng B. thuringiensis.

Năm 1982, Held và cộng sự đã sử dụng chữ viết tắt "cry" (bắt nguồn từ chữ crystal - tinh thể) để biểu diễn gene tổng hợp protein tinh thể diệt sâu. Các