Phân Loại Các Chủng Bt Bằng Phản Ứng Huyết Thanh

EDTA, pH = 8.0: 10mM

Glucose: 50mM

 Dung dịch Sol II: NaOH: 20mM.

SDS: 1%

 Dung dịch Sol III: CH3COOK: 60ml CH3COOH: 11,5ml H2O: 28,5ml

Các dung dịch dung trong điện di trên gel agarose

 Dung dịch TE: Tris HCl 10mM, pH= 8.0

EDTA 1mM, pH= 8.0

 Dung dịch đệm điện di TAE 50X:

Tris base 121g

Acid acetic 5M: 28.6 ml EDTA 0.5M pH=8.0: 50ml

Nước khử ion đủ 500ml

 Dung dịch đệm tra mẫu DNA (loading buffer) 5X:

Tris HCl 1M pH= 8.0: 1ml EDTA 0.5M pH=8.0: 2ml

Glycerol: 2ml Bromphenol blue 1%: 2ml

 Gel điện di agarose 1%: agarose 1g, TAE 1X: 100ml

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Phân loại các chủng Bt bằng phản ứng huyết thanh

Phương pháp phân loại Bt bằng phản ứng huyết thanh dựa trên đặc tính huyết thanh học của chủng Bt, nghĩa là dựa trên kháng nguyên tiêm mao H và được tiến hành bằng phản ứng ngưng kết các tế bào sinh dưỡng với kháng huyết thanh tương ứng. Phương pháp này cho phép xác định dưới loài Bt, tạo điều kiện thuận lợi cho việc lựa chọn các chủng Bt có hoạt tính cao với các bộ côn trùng. Các chủng Bt tham gia vào phản ứng ngưng kết huyết thanh phải là các chủng

có khả năng chuyển động. Do vậy, trước khi tiến hành phương pháp này, chúng tôi tiến hành kiểm tra khả năng chuyển động của các chủng nghiên cứu trên môi trường MT3 [30].

Cách tiến hành: các chủng Bt được cấy vào trong ống Craige (là ống thủy tinh nhỏ, được cắm thẳng đứng vào môi trường Craige chứa trong ống nghiệm to), nuôi ở 37ºC trong 24-28 giờ. Khi đó, những tế bào có khả năng chuyển động sẽ di chuyển lên phía trên bề mặt môi trường, giữa ống Craige và ống nghiệm. Vi khuẩn phát triển ở bề mặt này sẽ được cấy vào ống nghiệm có chứa 2ml môi trường MT2, lắc ở 70–75 vòng/phút trong khoảng thời gian 12-15 giờ [30].

Phản ứng ngưng kết với kháng huyết thanh tương ứng được quan sát trên kính hiển vi: lấy 2µl dịch nuôi nhỏ lên phiến kính lòm để kiểm tra khả năng chuyển động của vi khuẩn, sau đó nhỏ tiếp 2µl huyết thanh chuẩn (đã pha loãng) và quan sát dưới kính hiển vi.

2.2.2 Xác định mật độ bào tử Bt

Cấy các chủng Bt ra từng đĩa môi trường MPA riêng rẽ, nuôi ở 28ºC sau 3 ngày để thu sinh khối. Sinh khối vi khuẩn được xử lý ở 70ºC trong 10 phút, sau đó pha loãng đến nồng độ 10-8 lấy 100µl dịch ở mỗi nồng độ pha loãng 10-7 và 10-8 cấy thảm trên đĩa petri chứa môi trường MPA. Nuôi ở 28ºC trong 24h, đếm số khuẩn lạc mọc trên đĩa có nồng độ pha loãng nhỏ nhất. Số lượng bào tử được tính theo công thức:

CFU = n . a . 10

CFU: số lượng bào tử trong 1 ml dịch nuôi cấy.

n: số khuẩn lạc trung bình tạo thành trong 100µl dịch pha loãng a: nồng độ pha loãng.

2.2.3 Thử hoạt tính diệt côn trùng thử nghiệm

Để đánh giá khả năng tiêu diệt côn trùng bộ cánh vảy của các chủng nghiên cứu, chúng tôi tiến hành thử nghiệm trên đối tượng sâu xanh da láng (Spodoptera exigua) và sâu tơ (Plutella xylostella) theo phương pháp của Thiery và Frachon ở nồng độ 107 và 109 bào tử/ml đối với sâu xanh da láng và nồng độ

105 và 107 bào tử/ml đối với sâu tơ 105. Mỗi nồng độ thử nghiệm với 3 đĩa petri và mỗi đĩa 10 con sâu tơ và 3 con sâu đối với sâu xanh da láng [34].

Chuẩn bị:

Các chủng Bt được cấy thảm trên môi trường MPA, nuôi ở 280C trong 72 giờ. Sau đó, sinh khối được thu vào ống eppendorf chứa 1ml nước cất vô trùng. Pha loãng mật độ bào tử ở nồng độ 105 đến 107 bào tử/ml để thử hoạt tính.

Lá cải xanh hoặc lá bắp cải sạch (không phun thuốc trừ sâu, không sâu bệnh) rửa sạch và tráng qua bằng nước cất, để khô tự nhiên, cắt lá với diện tích đều nhau sao cho vừa đĩa petri. Nhúng lá vừa cắt vào dịch Bt đã pha loãng và để 10 phút cho hai mặt lá được ngấm hết dịch Bt, lấy ra để khô ở nhiệt độ phòng. Sau đó cho lá đã khô dịch vào các đĩa petri, mỗi đĩa thử 10 con hoặc 3 con sâu xanh da láng. Nuôi ở nhiệt độ phòng và nơi thoáng mát và theo dòi tỉ lệ sâu chết trong 3 ngày.

Tỉ lệ sâu chết được tính theo công thức Abbott:

A = (C – T)/C. 100

A: % sâu chết

C: số sâu sống ở mẫu đối chứng T: số sâu sống ở mẫu thí nghiệm.

2.2.4 Tách chiết DNA plasmid

- Nuôi vi khuẩn trong môi trường MPB ở 28°C, lắc 200 vòng/phút, qua đêm.

- Lấy 1,5ml dịch nuôi cấy ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút, thu cặn.

- Bổ sung 150µl dung dịch sol I, vortex.

- Bổ sung 150µl dung dich sol II, đảo nhẹ bằng tay.

- Bổ sung 150µl dung dịch sol III, lắc mạnh cho tủa hòa tan.

- Ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút, 4ºC, thu dịch nổi.

- Bổ sung 1ml cồn tuyệt đối

- Tủa ở - 20°C trong 4 giờ.

- Ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút, thu tủa.

- Làm khô tự nhiên.

- Hòa tủa trong 35µl RNase, ủ ở 37°C trong 1h.

- Đẩy nước lên tới 500µl.

- Bổ sung chloroform: isoamylalcohol (24:1); tỷ lệ 1: 1, đảo bằng tay.

- Ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút, 4ºC, thu dịch nổi

- Bổ sung NaOAC/KOAC, tỷ lệ 1: 10.

- Bổ sung cồn tuyệt đối, tỷ lệ 2,5: 1.

- Ủ ở -20ºC trong ít nhất 4h.

- Ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút ở 4ºC, thu tủa.

- Rửa tủa bằng 200µl cồn 70º.

- Ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút ở 4ºC, thu tủa.

- Làm khô, hòa tủa trong 35µl dH2O.

- Bảo quản ở - 20ºC .

2.2.5 Sàng lọc chủng Bt mang gene cry1C bằng PCR

Phương pháp PCR do Karl Mulis và cộng sự phát hiện năm 1985. Nhờ enzym DNA polymerase xúc tác, trên các mạch khuôn DNA tổng hợp nên các mạch đơn mới. Các mạch đơn mới được tổng hợp lại được sử dụng làm khuôn cho quá trình tổng hợp mạch mới ở chu kỳ tiếp theo. Sự tổng hợp mạch đơn DNA mới cần có sự tham gia của DNA mồi tạo các nhóm 3’-OH tự do. Các nucleotide được gắn ở vị trí nhóm OH tự do tạo thành mạch đơn mới.

Thành phần 1 phản ứng PCR: dNTPs 2µl

Đệm (có Mg2+) 2µl

Mồi 1C F 1µl

Mồi 1R 1µl

Taq polymease 0,2µl

DNA Temp 2µl

dH2O 11,8µl

Thể tích/phản ứng: 20µl

Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1%.

2.2.6 Tách dòng đoạn gene cry1C

Gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng pGEM-T Easy

Sản phẩm PCR được gắn trực tiếp vào vector tách dòng nhờ enzyme nối T4- DNA ligase.

Thành phần phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng:

Đệm 5µl

Vector 1µl

T4-DNA ligase 1µl

Sản phẩm PCR 3µl Phản ứng ghép nối được tiến hành 14 - 16h ở 4ºC.

Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E. coli DH5α

 Nguyên tắc: Dưới tác dụng của CaCl2 thành tế bào đang ở thời kỳ sinh trưởng trở nên xốp tạo điều kiện cho DNA có thể chui qua lỗ màng vào tế bào chất khi sốc nhiệt.

 Quy trình gồm 2 bước

+ Chuẩn bị tế bào khả biến:

- Nuôi cấy 1 khuẩn lạc E. coli DH5α trong môi trường LB lỏng qua đêm.

- Chuyển 0,5ml dịch nuôi cấy tế bào qua đêm sang 50ml môi trường LB.

- Lắc 200 vòng/phút trong 2h ở 37ºC. Đo OD600 đạt 0,5-0,6 thì hút lấy mẫu vào ống eppendorf đặt trên đá 1h. Sau bước này mọi thao tác luôn phải được thực hiện ở 4ºC.

- Mẫu sau đặt đá 1h được ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút, loại dịch nổi. Hòa tế bào thu được trong 1-1,5ml CaCl2 100mM vô trùng, vortex và ly tâm thu tủa ở 6000 vòng/phút trong 10 phút.

- Hòa tan lại tủa trong 1,5ml CaCl2 100mM, vortex, ủ mẫu trên đá trong 2h, cứ 15 phút đảo 1 lần.

- Ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút ở 4ºC, hòa tế bào trong 60µl CaCl2 100 mM, bổ sung 15% glycerol.

- Bảo quản tế bào ở - 80ºC

+ Biến nạp:

- Lấy tế bào khả biến từ - 80ºC để vào đá 30 phút.

- Hút 5µl sản phẩm của phản ứng nối ghép gene vào dung dịch tế bào khả biến và trộn đều, để đá 30 phút (nhằm tạo cho hỗn hợp có một nhiệt độ thấp nhất định và tạo điều kiện cho vector tái tổ hợp tiếp cận tế bào một cách đồng đều).

- Sốc nhiệt ở 42ºC trong 60-90 giây sau đó giữ trong đá 2 phút.

- Bổ sung 200-300µl môi trường LB và lắc ở 37ºC, 200 vòng/phút trong 1- 1,5 giờ.

- Trải 150µl sản phẩm trên đĩa petri chứa môi trường LBA bổ sung ampicilin

+ X- gal, nuôi ở 37ºC từ 14-16h.

Sàng lọc khuẩn lạc bằng PCR colony

Các thành phần PCR colony tương tự như phản ứng khuếch đại gene cry1C với mồi đặc hiệu, chỉ khác ở chỗ khuôn DNA được thay thế bằng một lượng nhỏ sinh khối từ các khuẩn lạc trắng và sử dụng cặp mồi M13.

Tách DNA plasmid từ E. coli DH5α

Lấy khuẩn lạc vi khuẩn chứa plasmid tái tổ hợp (khuẩn lạc màu trắng) cấy vào 2ml môi trường LB chứa ampicillin, lắc qua đêm 200 vòng/phút ở 37ºC.

Qui trình tách tương tự như quy trình tách DNA plasmid của Bt Xử lý DNA plasmid bằng enzyme giới hạn EcoRI

Để xác định chính xác vector tái tổ hợp có mang đoạn gene mong muốn hay không, cắt đoạn DNA đã ghép nối vào plasmid bằng EcoRI.

Trình tự cắt của EcoRI:

Thành phần của phản ứng cắt:

Thành phần

Thể tích (µl)
DNA plasmid	6µl
Buffer	1µl
EcoRI	0,5µl
dH2O	2.5µl
Tổng thể tích	10µl