Gene Cry1C Và Dưới Loài Bacillus Thuringiensis Subsp . Aizawai

1.1.11. Gene cry1C và dưới loài Bacillus thuringiensissubsp. aizawai

Gene cry1C

Gene cry1C có kích thước khoảng 3 kb trong đó đoạn bảo thủ mã hóa độc tố có kích thước 288bp. Gene cry1C mã hóa protein tinh thể độc tố có khối lượng phân tử khoảng 130kDa. Nhóm dưới loài B.thuringiensis subsp. aizawai có khả năng sinh tinh thể hình thoi chứa gene cry1C. Cho đến thời điểm hiện nay đã có trên 16 gene thuộc phân nhóm cy1C được tách dòng và công bố trên cơ sở dữ liệu của Crichmore, trong đó mới nhất là gene cry1CAa14.

Trong nghiên cứu khả năng tổ chức các thụ thể trên màng tế bào ruột côn trùng thì vùng 2 của độc tố Cry1C có khả năng liên kết cả 3 loại thụ thể có khối lượng phân tử khác nhau.

Dưới loài Bta

Bta là một trong số 82 dưới loài của vi khuẩn B. thuringiensis, thuộc typ huyết thanh số 7 theo khóa phân loại của Bonnefoi và de. Barjac, 1963. Trong số các chủng B. thuringiensis phân lập ở Việt Nam thì có tới 15% số chủng là Bta [5,10].

Bta hình thành tinh thể diệt sâu trong chu kì phát triển ở pha ổn định. Tinh thể có dạng hình thoi là chủ yếu. Dưới loài Bta mang gene mã hóa nhiều loại protein tinh thể của nhóm Cry 1 như Cry 1C, Cry 1D, Cry 1Aa, Cry 1Ab. Vì thế Bta là một trong những dưới loài được sử dụng phổ biến nhất trong các chế phẩm từ Bt. Bta có khả năng diệt nhiều loài sâu hại quan trọng như: sâu tơ (Plutella Xylustella), CL, ICW, sâu xanh da láng, sâu quả cà chua, sâu khoang. Bta vẫn có hiệu quả diệt sâu trên những vùng đã có biểu hiện kháng độc tố Btk [38].

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 63 trang tài liệu này.

Trên thị trường hiện nay, chế phẩm XenTari sản xuất từ Bta được sử dụng rộng rãi và có hoạt tính diệt các loại sâu hại quan trọng mà đã kháng lại thuốc trừ sâu hóa học như: sâu khoang, sâu xanh [10].

1.2. Đại cương về côn trùng bộ cánh vảy

1.2.1. Côn trùng bộ cánh vảy

Bộ cánh vảy(Lepidoptera) là một bộ lớn trong côn trùng học, bao gồm bướm và bướm đêm. Bộ cánh vảy gồm hơn 180.000 loài trong 128 ngành và 47 họ. Trong số hơn 180.000 loài được mô tả cho đến nay có thể tìm thấy hầu như ở khắp mọi nơi. Khoảng 11.300 loài được tìm thấy từ Bắc Mỹ và 10.000 loài tìm thấy ở Úc. Bộ cánh vảy được tìm thấy phần lớn ở hầu hết các môi trường sống, nhưng hầu như chúng luôn luôn sống ở các vùng thực vật bậc cao, đặc biệt là thực vật hạt kín [3].

Cũng như tất cả các côn trùng, loài cánh vảy có một bộ xương ngoài và tách ra thành ba phần : phần đầu, phần ngực, phần bụng. Chúng có 3 cặp chân ở ngực, hai mắt kép lớn và một thuôn dài trên miệng được gọi là vòi. Còn ấu trùng thì cơ thể mềm, phần đầu phát triển và có đến 11 cặp chân (thông thường là 8 cặp). Chúng thường đẻ trứng trên các loài cây chủ, số lượng trứng là khác nhau từ một vài cho đến một vài nghìn. Trứng sau khi nở thành ấu trùng, các ấu trùng ăn tất cả các phần của cây. Ấu trùng phát triển nhanh với nhiều thế hệ trong một năm, tuy nhiên một số loài thời kỳ phát triển mất đến 3 năm. Bộ cánh vảy gây hại nghiêm trọng cho nông nghiệp, chủ yếu là khi tuổi ấu trùng, chúng đục thân, ăn lá làm tổn hại đến cây dẫn đến cây chết: sâu hại bắp ngô, sâu tơ hại rau, sâu đục quả đậu rau.

1.2.2. Côn trùng thử nghiệm

Sâu tơ

Sâu tơ (Plutella xylostella) thuộc bộ cánh vảy (Lepidoptera), họ ngài rau (Plutellidae) hay còn gọi là sâu bay, sâu đu, sâu nhẩy dù.

Sâu tơ phá hoại hầu hết các loại lá: xu hào, cải bắp, đậu tương. Chúng được đánh giá là một loại sâu hại nghiêm trọng và có tính kháng thuốc trong nhiều nghiên cứu. Sâu tơ phân bố rộng rãi, tính đến năm 1982 có tới 128 nước và vùng lãnh thổ đã công bố thấy xuất hiện loài sâu này. Sâu tơ sinh sản cao,

vòng đời ngắn, tính kháng thuốc nhanh. Thiệt hại hàng năm do sâu tơ gây ra khoảng 30- 50% năng suất, chi phí phòng trừ chiếm 20-40% tổng chi phí đầu tư nhất là trên bắp cải [3].

Đặc tính sinh học và hình thái của sâu tơ

Tùy theo nhiệt độ mà sâu tơ có chu kỳ sinh trưởng khác nhau, ở nhiệt độ 20 -300C thì vòng đời của chúng là 20 -30 ngày, ở nhiệt độ 15–200C thì vòng đời là 40 ngày. Đây là loài biến thái qua 4 pha: Trứng – sâu non – nhộng – trưởng thành (Hình 1.5).

Thời trứng 2-3 ngày, hình bầu dục, màu vàng nhạt dài 4- 5mm, đường kính 0,3-0,5mm.Trứng đẻ rời rạc ở mặt dưới lá, gần gân chính và nở trong vòng 3–4 ngày.Thời kỳ sâu non 8-10 ngày, hình ống, màu xanh nhạt, dài 8- 10mm, đầu có màu nâu nhạt, trên các đốt có lông tơ. Sâu non phát triển qua 4 tuổi.Tuổi 1: Thân màu trắng đục, dài khoảng 0,8 mm. Đến cuối tuổi này cơ thể sâu dài từ 1,2-1,5 mm. Tuổi 1 phát triển từ 2-4 ngày.Tuổi 2: Mình sâu bắt đầu chuyển sang màu hơi xanh nhưng vẫn còn đục. Sâu dài từ 1,5-3,5 mm. Ở tuổi 2 sâu phát triển trong thời gian từ 1-3 ngày.Tuổi 3: Mình sâu màu xanh lục tươi, dài từ 3,5-5,5 mm và phát triển từ 1- 3 ngày.Tuổi 4: Sâu có màu xanh lục sậm hơn, kích thước cơ thể từ 5,5-9 mm, phát triển từ 1-4 ngày. Giai đoạn này sâu có màu xanh nhạt, hình ống với nhiều đốt, mỗi đốt đều có nhiều lông nhỏ. Đầu màu nâu vàng có các phiến cứng, trên đó có các chấm mầu nâu nhạt. Trên mảnh cứng của lưng ngực có những chấm xếp thành hình chữ U.

Thời kỳ nhộng 3- 4 ngày, nhộng có màu xanh hoặc vàng nhạt, dài 6-7mm được bao bọc trong kén mỏng màu trắng xốp nằm dưới mặt lá.

Thời kỳ trưởng thành 5-7 ngày, sâu trưởng thành (bướm) thân dài 6- 10mm, sải cánh trung bình 15mm, cánh màu nâu xám, mép cánh trước có ba dấu hình tam giác màu nâu nhạt ngả trắng và có lông nhỏ dài mịn, khi đậu cánh sát thân. Bướm ít bay mà thường di chuyển theo gió, hoạt động nhiều từ chập tối đến nửa đêm, mỗi con cái đẻ từ 50-400 trứng. Trứng được đẻ riêng rẽ trên bề

mặt của lá. Sâu non có 4 tuổi, sâu mới nở đục lá tạo thành rãnh, tuổi lớn ở mặt dưới của lá [3].

Đặc điểm gây hại

Hình 1.5. Vòng đời sâu tơ [3]

Sâu tơ thường gây hại cho các loại cây trồng thuộc họ cải. Sâu non ăn lá, khi mật độ cao nó sẽ ăn thủng lá làm cho lá xơ xác, lá bị tổn thương mất khả năng quang hợp và giữ nước, cây phát triển kém và chết. Sâu tơ phá hoại toàn bộ lá của cây, đặc biệt quan trọng khi sâu tấn công ở giai đoạn mới trồng, sâu non nở đục tạo thành rãnh, ở tuổi sâu lớn ăn toàn bộ biểu bì phiến lá sẽ bị thủng lỗ chỗ. Sâu tơ gây hại quanh năm và gây hại nhiều nhất là vào vụ Đông xuân.

Hình 1.6. Rau bắp cải bị sâu hại [3]

Các nghiên cứu chỉ ra rằng sâu tơ là loại sâu hại nghiêm trọng có khả năng kháng thuốc cao. Trong cơ thể sâu tơ có loại men có thể phân giải thuốc thành chất không độc, đó là hệ men vi thể (microsonal enzyme system). Khi cơ thể sâu tiếp xúc với hóa chất độc, hệ men vi thể được kích thích hoạt động tăng 100- 200 lần [3].

Sâu xanh da láng

Sâu xanh da láng (Spodoptera exigua)có tên khoa học là Spodoptera exigua Hubner, thuộc họ Noctuidae (Ngài Đêm), Lepidoptera (bộ Cánh Vảy).

Ở Việt Nam, nhất là ở vùng đồng bằng sông Cửu Long, từ năm 1981 sâu là đối tượng gây hại chính trên đậu nành, đậu xanh, hành, ớt và một số loại hoa màu ngắn ngày khác.Vòng đời của sâu khoảng 30 đến 40 ngày, chia thành 3 giai đoạn:

Giai đoạn trưởng thành: Bướm là loại bướm đêm, màu trắng xám, chiều dài thân từ 7-10 mm, sải cánh rộng từ 20-25 mm. Đầu màu xám, mang nhiều lông, hai mắt kép to, màu đen, râu đầu hình sợi chỉ, dài từ 5-6 mm. Ngực màu nâu đỏ, được phủ kín bởi một lớp phấn màu xám tro có ánh kim. Cánh trước màu xám hơi ngả nâu, thon dài, hình tam giác, góc cánh hơi bầu, có nhiều vân. Thời gian sống của bướm từ 5-10 ngày và một bướm cái có thể đẻ từ 300- 400 trứng trong vòng từ 3-5 ngày.

Trứng có hình cầu, đường kính từ 0,4-0,5mm, mới đẻ màu xanh đến vàng nhạt, sau chuyển sang màu trắng đục, sắp nở có một chấm đen trên vỏ trứng, đó là mắt của sâu. Trứng được đẻ thành từng ổ, trên phủ lớp lông màu trắng ngà. Thời gian ủ trứng từ 2-4 ngày.

Giai đoạn sâu non: Sâu có từ 5-6 tuổi, phát triển trong thời gian từ 10-19 ngày. Mặt lưng của sâu màu xanh và trơn láng nên còn có tên là "Sâu xanh da láng" để phân biệt với sâu xanh (Heliothis armigera). Chi tiết trong từng tuổi sâu như sau:

Tuổi 1: thân sâu có màu xanh lá cây hay vàng xanh, đầu đen bóng, mang nhiều lông, bụng màu vàng nhạt, cơ thể có chiều dài từ 1,2-1,5mm, thường phần đầu có chiều ngang lớn hơn chiều ngang thân mình và các sọc trên cơ thể chưa rò ràng. Thời gian phát triển của sâu ở tuổi này từ 2-5 ngày.

Từ tuổi 2, màu sắc trên mình sâu bắt dầu thể hiện rò dần. Bụng màu vàng xanh, các đốt trên thân phân biệt rò dần. Mình sâu có 3 sọc màu trắng mờ, một sọc giữa lưng và 2 sọc ở hai bên thân, cả 3 sọc trên chạy từ đốt thứ nhất đến đốt cuối của bụng. Ở tuổi này sâu có kích thước cơ thể trung bình là 0,45x3,7mm. Thời gian phát triển của sâu tuổi 2 từ 2-4 ngày.

Sang tuổi 3, lúc mới lột xác sâu có màu vàng xanh, sau chuyển sang màu xanh lá cây. Đầu màu vàng nhạt, bóng; vẫn còn mang nhiều lông. Các chấm trên mình sâu nhỏ dần, lông ngắn hơn. Thời gian phát triển của sâu ở tuổi này từ 2-3 ngày.

Sau khi nở sâu sống tập trung quanh ổ trứng, ăn phần diệp lục của lá thành những lổ nhỏ, chừa lại lớp biểu bì trắng. Cuối tuổi 1 sâu bắt đầu phân tán sang các lá lân cận. Ấu trùng tuổi 2 ăn lủng lá thành những lổ nhỏ và có tập quán nhả tơ buông mình xuống đất khi bị động. Ở tuổi 3 sâu ăn phá mạnh nhất, cắn lá thành những lổ to; sâu còn đeo trên các chùm hoa của cây đậu nành và ăn các cánh hoa vừa mới nhú. Ở những ruộng có mật số cao sâu ăn lá còn trơ gân chính và cuống và cả trái non [3].

Giai đoạn nhộng: Kéo dài từ 7–10 ngày, sâu thường hóa nhộng trong đất hoặc lùm cỏ khô.

Hình 1.7. Vòng đời của sâu xanh da láng [3]

Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu

2.1.1. Sinh phẩm

150 chủng Bt phân lập từ mẫu đất ở Thái Nguyên, chưa qua phân loại và xác định hình dạng tinh thể, do Phòng Di truyền vi sinh vật cung cấp.

E. coli DH5α được nhận từ Phòng Di truyền Vi sinh, Viện Công nghệ Sinh học.

Sâu tơ (Plutella xylostella) và sâu xanh da láng (Spodoptera exigua) tuổi 2 do Viện Bảo vệ thực vật cung cấp.

Các cặp mồi được sử dụng để khuếch đại gene cry1C do phòng Di truyền vi sinh vật cung cấp.

- Cặp mồi đặc hiệu gene cry1C

TYIC 5’ – CAACCTCTATTTGGTGCAGGTTC 3’

TYIUNI 5’- TCACTGAGTCGCTTCGCATGTTTGACTTTCTC 3’

- Cặp mồi M13

Reverse M13: 5’- CAGGAAACAGCTATG – 3’ Forward M13: 3’- GTAAAACGACGGCCA – 5 ’

Vector tách dòng plasmid: pGEM-T Easy

Taq polymerase, enzyme giới hạn (EcoRI), ligase…của hãng Invitrogen, Fermentas.

2.1.2. Hóa chất và thiết bị

Hóa chất:

- Hóa chất sử dụng trong phân lập và nuôi cấy Bt: agar, cao thịt, cao nấm men, peptone, NaCl….

- Hóa chất sử dụng nhuộm bào tử và tinh thể: fuchsin base

- Hóa chất sử dụng trong điện di: agarose, SDS, Tris-base, TAE.

- Hóa chất sử dụng trong phản ứng PCR: dNTPs, Taq polymease, đệm, nước khử ion…

Thiết bị:

Các thiết bị nghiên cứu gồm: Máy li tâm (Fresco, Đức), máy PCR (PTC- 100, Mỹ), máy vortex (IKA, Đức), máy lắc (Gerharat, Đức), máy soi gel (Vilber Lourmat, Đức), máy chụp gel (Gen Doc), kính hiển vi (Olympus, Nhật), tủ lạnh sâu (Frigo, Đan Mạch)

Ngoài ra chúng tôi cũng sử dụng một số dụng cụ khác phục vụ cho quá trình nghiên cứu như: đĩa petri, bình tam giác, pipet

Môi trường:

Các loại môi trường đã sử dụng trong quá trình thực hiện thí nghiệm:

Môi trường MPA- MT1 (g/l)

Agar: 20g Pepton: 10g Nước cất: 1l

NaCl: 5g Cao thịt: 4g pH: 7

Môi trường MPB- MT2 (g/l)

Pepton: 10g Nước cất: 1l pH: 7 NaCl: 5g Cao thịt: 4g

Môi trường Craige- MT3 (g/l)

Bacto agar: 8g Pepton: 10g Nước cất: 1l

NaCl: 5g Cao thịt: 4g pH: 7

Môi trường LB- MT4 (g/l)

Trypton: 10g Nước cất: 1l pH: 7 NaCl: 5g Cao men: 4g

Môi trường LBA- MT5 (g/l)

Agar: 20g Trypton: 10g Nước: 1l

NaCl: 5g Cao men: 4g pH: 7

Các loại dung dịch:

Các dung dịch dùng trong tách chiết DNA plasmid

 Dung dịch Sol 1: Tris HCl, pH = 8.0: 20mM.