Kết Quả Phân Lập Và Tinh Sạch Steviosid

- Phân lập và tinh sạch steviosid

Phân lập và tinh sạch hàm lượng steviosid từ glycosid thô bằng cách sử dụng metanol, tỷ lệ glycosid thô và metanol được khảo sát trong khoảng 1:2 đến 1:7. Xác định hàm lượng steviosid bằng HPLC ta thu được kết quả ở Bảng 4.3.1. Qua kết quả thu được ta thấy hàm lượng steviosid dao động từ 74,3% đến 91,4% và giữa các nghiệm thức khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức độ tin cậy 95%. Theo đó, ở tỷ lệ 1:2 đến 1:4 khi hàm lượng metanol tăng dần thì hàm lượng steviosid có độ tinh khiết cũng tăng và giữa các nghiệm thức từ 1:2 đến 1:4 có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức độ tin cậy 95%. Ở tỷ lệ 1:5 đến 1:7 mặc dù hàm lượng metanol tăng dần nhưng hàm lượng steviosid không tăng và giữa các nghiệm thức này không khác biệt có ý nghĩa thống kê. Nhìn chung, từ kết quả ở trên cho thấy rằng tỷ lệ tốt nhất cho quá trình phân lập và tinh sạch hàm lượng steviosid là tỷ lệ 1:5 và độ tinh khiết của steviosid là 91,1% - 91,5%.

Bảng 4.3.1 Kết quả phân lập và tinh sạch steviosid

Tỷ lệ bột và metanol(w/v) Hàm lượng steviosid (%)

1:2 74,3a±0,1528

1:3 74,7b±0,0577

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 73 trang tài liệu này.

1:4 80,8c±0,1528

1:5 91,3d±0,2000

1:6 91,2d±0,1528

1:7 91,4d±0,0707

Các số liệu trong bảng là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại

Các giá trị có mẫu tự giống nhau không khác biệt về mặt thống kê ở độ tin

cậy 95%

- Phân lập và tinh sạch rebaudiosid A

Phần dịch lọc từ thí nghiệm tinh sạch steviosid cho vào tủ sấy để loại bỏ metanol và tiến hành tinh sạch rebaudiosid A. Dịch lọc sau khi loại bỏ methanol được pha loãng với nước và cho qua màng siêu lọc polysulfone. Dịch lọc thu được đưa đi sấy khô thu được xirô. Xirô thu được thêm etanol và duy trì nhiệt độ ở mức 45-50°C, khoảng 30 phút. Trong thời gian này sự kết tủa được hình thành, lọc lấy kết tủa và làm khô. Hàm lượng chất tạo ngọtthu được đem đi xác định rebaudiosid A bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao. Rebaudiosid A có độ tinh khiết thu được trình bày ở Bảng 4.3.2.

Bảng 4.3.2 Kết quả phân lập và tinh sạch rebaudiosid A

Tỷ lệ xirô và etanol (w/v) Hàm lượng Rebaudiosid A (%)

1:2 88,5a±0,0577

1:3 90,5b±0,0577

1:4 90,6c±0,0001

1:5 90,8d±0,1000

1:6 90,7d±0,1155

1:7 90,8d±0,0577

Các số liệu trong bảng là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại

Các giá trị có mẫu tự giống nhau không khác biệt về mặt thống kê ở độ tin

cậy 95%

Trong quá trình phân lập và tinh sạch hàm lượng rebaudiosid A, tỷ lệ hỗn hợp xirô và etanol dùng giới hạn ở khoảng 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7. Qua kết quả trình bày ở Bảng 4.3.2 cho thấy hàm lượng rebaudiosid A dao động từ 88,5% đến 90,8%, giữa các nghiệm thức khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức độ tin cậy 95%. Bên cạnh đó, cũng thấy rằng ở các tỷ lệ 1:2, 1:3, 1:4 hàm lượng metanol tăng dần thì hàm lượng rebaudiosid A cũng tăng theo. Ở các tỷ lệ 1:5, 1:6, 1:7 hàm lượng etanol tăng nhưng tỷ lệ rebaudiosid A không tăng. Vì thế, trong quá trình phân lập và tinh sạch rebaudiosid A tỷ lệ bột và etanol tốt nhất là 1:5 và độ tinh khiết của rebaudiosid A là 90,7% - 90,9%.

CHƯƠNG V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

5.1 Kết luận

Qua nghiên cứu này, quá trình khảo sát tỷ lệ thích hợp của bột lá Cỏ Ngọt và nước trong quá trình chiết xuất giới hạn khoảng 1:20 đến 1:25 w/v. Nhiệt độ và thời gian chiết xuất tốt nhất là 75oC trong 240 phút và 100oC trong 30 phút. Sự phân lập và tinh sạch steviosid từ hỗn hợp glycosid thô đã được tiến hành bằng cách sử dụng metanol để kết tủa, tỷ lệ glycosid thô và metanol là giữa 1:2 đến 1:7 w/v, tốt nhất là 1:5 w/v, hàm lượng steviosid thu được trong khoảng 90,1% -

91,5%. Sự phân lập và tinh sạch rebaudiosid A được tiến hành bằng cách sử dụng etanol để kết tủa rebaudiosid A, tỷ lệ xirô và etanol là 1:2 đến 1:7 w/v, tốt nhất là 1:5 w/v, rebaudiosid A với 90,7% - 90,9% độ tinh khiết thu được. Hai chất ngọt thu được không sinh năng lượng, không đắng, áp dụng trong thực phẩm và dược phẩm.

5.2 Đề nghị

- Tiếp tục tinh sạch hợp chất steviosid và rebaudiosid A trên đạt tiêu chuẩn chất chuẩn đối chiếu dùng trong lĩnh vực hóa phân tích và kiểm nghiệm.

- Tiếp tục phân lập các chất còn lại rebaudiosid B, C, D, E và Dulcosid

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1.Abou-Arab A. E, Abou-Arab A. A, and Abu-Salem M. F. (2010). Physico-chemical assessment of natural sweeteners steviosides produced from Stevia rebaudianabertoni plant. African Journal of Food Science 4(5): 269- 281.

2.Arayjo Funari Ferri L, Bazotte RB. (2006). Comparative effects of Stevia rebaudiana leaves and stevioside on glycaemia and hepatic gluconeogenesis. Planta Med, 72, 691-696.

3.Carakostas M.C, Curry L.L, Boileau A.C, Brusick D.J. (2008). Overview the history, echnical function and safety of rebaudioside A, a naturallyoccurring steviol glycoside, for use in food and beverages. Food and Chemical Toxicology. 46: S1–S10.

4.Chen TH, Chen SC, Chan P, Chu YL, Yang HY, Cheng JT. (2005). Mechanism of the hypoglycemic effect of stevioside, a glycoside of Stevia rebaudiana. Planta Med. 71, 108- 113.

5 Cramer B, Ikan R. (1986). Sweet glycosides from the Steviaplant. Chemistry in Britain

22: 915-916.

6.Curry L.L, Roberts A. (2008). Subchronic toxicity of rebaudioside A. Food Chem. Toxicol.46/7S, S11–S20.

7.Curi R, Alvarez M, Bazotte RB, Botion LM, Godoy JL, Bracht A. (1986). Effect of Stevia rebaudiana on glucose tolerance in normal adult humans. Braz J Med Biol Res, 19, 771-4.

8.Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Trung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiến, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Thu, Nguyễn Tập, Trần Toàn.(2004). Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam. Nhà xuất bản Khoa học Kỹ Thuật Hà Nội tập 1, trang 495-498.

9.Dyrskog SE, Jeppensen PB, Colombo M, Abudula R, Hermansen K. (2005). Preventive effects of soy based diet supplemented with stevioside on development of type 2 diabetes. Metabolism; 54: 1181-1188.

10.Geuns, J.M. (2003). Stevioside. Phytochemistry. 64(5): 913-921.

11.Ghosh S, Subhudhi E, Nayak S. (2008). Antimicrobial assay of Stevia rebaudiana Bertoni leaf extracts against 10 pathogen. Int J Integrative Biol; 2(1): 27-31.

12.Ghanta S, Banerjee A, Poddar A, Chattopadhyay S. (2007). Oxidative DNA damage preventive activity and antioxidant potential of Stevia rebaudiana (Bertoni) Bertoni, a natural sweetener. J Agric Food Chem.55, 10962-10967.

13.Goad J. L. and Akihisa T. (1997). Analysis of sterols, Blackie Academic and Professional Pub First edition, p.378.

14.Hagiwara A, Fukushima S, Kitaori M. (1984). Effects of the three sweetenerson rats urinary bladder carcinogenesis initiated by Nbutyl- N-(4-hydroxybutyl)-nitrosamine. Gann. 75: 763–768.

15. Kinghorn A.D, Soejarto D.D. (1991) .Stevioside. In: Nabors L.B, Gelardi R.C. (eds)

Alternative Sweeteners. New York: Marcel Dekker, 157–171.

16.Lailerd N, Saengsirisuwan V, Sloniger JA, Toskulkao C, Henriksen EJ. (2004). Effects of stevioside on glucose transport activity in insulin-sensitive and insulin-resistant rat skeletal muscle. Metabolism 53, 101-107.

17.Medon P.J, Pezzuto J.M, Havanec-Brown J.M, Nanayakkara N.P, Soejarto D.D, Kamath S.K. (1982). Safety assessment of some Steviarebaudiana sweet principles. Fed. Proc. 41, 1568−1982.

18.Nishiyama P, Alvarez M, Vieira LG. (1992). Quantitative analysis ofstevioside in the leaves of Stevia rebaudiana by near infraredreflectance spectroscopy. J. Sci. Food Agric. 59: 277-281.

19.Pariwat P, Homvisasevongsa S, Muanprasat C, & Chatsudthipong V. (2008). A natural plant-derived dihydroisosteviol prevents choleratoxin-induced intestinal fluid secretion. J Pharmacol Exp Ther 324,798-805.

20.Phillips K.C. (1987). Stevia: Steps in developing a new sweetener. In: Grenby TH, editor. Developments in sweeteners New York: Elsevier. pp 1–5.

21.Savita S.M, Sheela K, Sunanda S, Shankar A.G, Ramakrishna P, Sakey S. (2004). Health implications of Stevia rebaudiana. J. Hum. Eco. 15: 191-194.

22.Sharma N, Kaushal N, Chawla A, Mohan M, Sethi A, Sharma Y. (2006). Stevia rebaudiana A review. Agrobios Newslett. 5(7):46–48.

23.Shiozaki K, Fujii A, Nakano T, Yamaguchi T, & Sato M. (2006). Inhibitory effects of hot water extract of the Stevia stem on the contractile response of the smooth muscle of the guinea pig ileum. Biosci Biotechnol Biochem 70, 489-494. 19

24.Soejarto D.D. (2002). Ethnobiology of Stevia and Stevia rebaudiana. In:Kinghorn, A.D.(Ed.), Stevia the genus Stevia (Medicinal and Aromatic Plants– Industrial Profiles). Taylor & Francis/CRC Press, New York/London, UK, 40–67.

25.Soejarto DD, Kinghorn AD, Fransworth NR .(1982). Potential sweetening agents of plants origin. J.Nat.Prod.45:590- 599.

26.Toyoda K, Matsui H, Shoda T, Uneyama C, Takada K, Takahashi M.(1997). Assessment of the carcinogenicity of stevioside in F344 rats. FoodChem. Toxicol. 35: 597–603.

27.Tomita T, Sato N, Arai T, Shiraishi H, Sato M, Takeuchi, M. (1997). Bactericidal activity of a fermented hot-water extract from Stevia rebaudiana Bertoni towards enterohemorrhagic Escherichia coli 0157:H7 and other food-borne pathogenic bacteria. Microbiol Immunol 4, 1005-1009.

28.Takahashi K, MatsudaM, Ohashi K, Taniguchi K, Nakagomi 0, Abe Y. (2001). Analysis of anti-rotavirus activity of extract from Stevia rebaudiana Phytochemistry, 1976, 15,981-983.

29.Xiao J, Kruhuffer M, Orntoft T, Hermansen K. (2003). Antihyperglycemic and blood pressure-reducing effects of stevioside in the diabetic Goto- Kakizaki rat. Metabolism. 52, 372-378.

30.Yasukawa K, Kitanaka S, Seo S.(2002). Inhibitory effect of stevioside on tumor promotion by 12-O-tetradecanoylphorbol- 13-acetate in two-stage carcinogenesis in mouse skin. Biol Pharm Bull, 25, 1488- 1490.

PHỤ LỤC 1.PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HOÁ LÝ

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

HPLC phân tích được thực hiện bằng cách sử dụng cột HIQSIL 100 C18 (25 cm x 4,6 mm ID, 5 micron). Nhiệt độ cột được duy trì ở mức 27-28°C và đầu dò UV điều chỉnh ở 210 nm. Pha động là acetonitril HPLC và nước khử ion (80:20) và độ pH được điều chỉnh đến 3,0 bằng acid phosphoric 85%. Các mẫu được lọc qua bộ lọc 0,22 µm hoặc tương đương. Thể tích tiêm đã được thiết lập để 10μL với tốc độ dòng của 1ml / phút. Các chuẩn steviosid hydrate (98%) và rebaudiosid A (96%), (Sigma – Aldrich) đã được sử dụng.

Phân tích thống kê

Các thí nghiệm được tiến hành ba lần lặp lại. Phân tích phương sai (ANOVA) được thực hiện và sự khác biệt có ý nghĩa (p <0,05) giữa các giá trị trung bình được đánh giá bởi Duncan, sử dụng SPSS phiên bản 19.0 (SPSS, Chicago, IL, USA).