Trang chủ / Cây Cỏ Ngọt

Thí Nghiệm 1: Khảo Sát Tỷ Lệ Chiết Giữa Nước Và Nguyên Liệu Trong Quá

- Tủ sấy (Memmert, Đức)


- Lọc polysulfone (Liumar Technologies, Ottawa, Canađa)


- Các thiết bị thông thường khác hỗ trợ cho quá trình phân tích.


3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Sơ đồ nghiên cứu

Sơ đồ nghiên cứu.


Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 73 trang tài liệu này.


Xây dựng qui trình chiết xuất, phân lập, tinh chế steviosid & rebaudiosid A

Nghiên cứu chiết xuất và tinh sạch steviosid và rebaudiosid A từ cây Cỏ Ngọt Stevia rebaudiana làm chất tạo ngọt trong thực phẩm và dược phẩm - 4


2 hợp chất đặc trưng từ dược liệu đạt độ tinh khiết cao.

3.2.2 Thiết kế thí nghiệm

- Cỡ mẫu: tùy theo hàm lượng hợp chất đặc trưng trong dược liệu, khối lượng dược liệu (cỡ mẫu) sử dụng đủ để chiết xuất nhiều mẻ nhằm thu được 20 g hợp chất.

- Chiết xuất, phân lập, tinh chế: thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm Khoa Sinh học Ứng dụng và phòng thí nghiệm Công nghệ Thực phẩm Trường Đại học Tây Đô.

- Phân tích và kiểm nghiệm: phòng thí nghiệm trung tâm Khoa Dược và Điều Dưỡng Trường Đại học Tây Đô.

3.2.3 Thời gian thực hiện đề tài

Đề tài được thực hiện từ 10/2014 đến 10/2015.

3.2.4 Bố trí thí nghiệm

3.2.4.1 Thí nghiệm 1: khảo sát tỷ lệ chiết giữa nước và nguyên liệu trong quá

trình ly trích hỗn hợp glycosid thô.


* Mục đích: tìm ra tỷ lệ chiết xuất thích hợp giữa nguyên liệu và nước mà ở đó hàm lượng glycosid thô cao nhất.

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên 1 nhân tố, 5 mức độ với 5 nghiệm thức và 3 lần lặp lại cho mỗi nghiệm thức. Kết quả phân tích hàm lượng glycosid thô được xử lý thống kê.

Nhân tố A: tỷ lệ nước


A1: 1:6 A2: 1:9 A5: 1:25


A3: 1:15 A4: 1:20


Bột Cỏ

+ Thêm nước


A1 A2 A3 A4 A5

+ Lọc


Dịch chiết


+ Sấy


Cân


Hình 3.2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn tỷ lệ lá nước thích hợp trong quá trình chiết


* Tiến hành:


Mẫu được mua về tiến hành tách lá ra khỏi thân cây, lá mang phơi khô dưới ánh sáng mặt trời trực tiếp ở nhiệt độ dao động từ 25°C đến 30°C trong 24 giờ đến 48 giờ. Các lá khô được nghiền thành bột. Bột lá Cỏ Ngọt được cho vào túi polyethylene, buộc kín và bảo quản ở nhiệt độ 4 ± 1°C trong tủ lạnh cho đến khi sử dụng (Abou-Arab et al., 2010). Bột lá Cỏ Ngọt cân 1g cho vào cốc 50mL, cho thêm 6mL nước vào ta có tỷ lệ 1:6. Tương tự các cốc còn lại bố trí với tỷ lệ 1:9, 1:15, 1:20, 1:25. Sau đó cho tất cả các cốc vào bếp

đun cách thủy với nhiệt độ 75oC trong vòng 120 phút, mỗi tỷ lệ được tiến

hành 3 lần lặp lại. Khi kết thúc quá trình đun cách thủy, các cốc chứa dịch chiết sẽ được lọc qua giấy lọc. Tách lấy phần dịch lọc cho vào tủ sấy ở nhiệt độ 105oC. Sau khi sấy xong mang cốc ra cho vào bình hút ẩm, chờ ổn định và tiến hành cân cốc. Tính được lượng glycosid thô.

3.2.4.2 Thí nghiệm 2: khảo sát thời gian và nhiệt độ trong quá trình ly trích glycosid thô.

* Mục đích: chọn thời gian và nhiệt độ chiết xuất thích hợp để thu được hàm lượng glycosid thô tốt nhất.

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên 2 nhân tố, với 16 nghiệm thức

và 3 lần lặp lại cho mỗi nghiệm thức. Kết quả phân tích glycosid thô. Nhân tố B: nhiệt độ chiết Nhân tố C: thời gian chiết

B1: 45oC B2: 75oC C1: 30 phút C2: 60 phút

B3: 10oC B4:1000C C3:120 phút C4:240 phút


Cỏ Ngọt


+ Nghiền nhỏ


+ Thêm nước


+ Gia nhiệt

B1 B2 B3 B4


+ Thời gian gia nhiệt


C1 C2 C3 C4


+ Lọc



Dịch lọc


+ Sấy


Cân


Hình 3.2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn nhiệt độ và thời gian thích hợp trong quá

trình chiết


Tiến hành


Từ khảo sát tỷ lệ chiết giữa nước và nguyên liệu trong quá trình ly trích hỗn hợp glycosid thô ở trên ta chọn được tỷ lệ tốt nhất để tiến hành cho thí nghiệm khảo sát thời gian và nhiệt độ trong quá trình ly trích hỗn hợp glycosid thô. Cân 1g bột lá Cỏ Ngọt cho vào cốc 50mL thêm nước vào với tỷ lệ được chọn như trên. Tiến hành gia nhiệt các mẫu ở nhiệt độ 45oC, 75oC, 100oC và làm lạnh ở 10oC với thời gian lần lượt là 30, 60,120, 240 phút. Các mẫu sau đó được lọc qua giấy lọc. Phần rắn bỏ đi, phần dịch lọc cho vào cốc 50mL đã biết trước trọng lượng. Tiếp tục cho cốc chứa dịch lọc vào tủ sấy ở nhiệt độ 105oC và sấy đến khối lượng không đổi. Sau đó cân khối lượng, tính được hàm lượng hỗn hợp glycosid thô có trong mẫu.

3.2.4.3 Thí nghiệm 3: phân lập và tinh sạch hai loại chất tạo ngọt steviosid và

rebaudiosid A


* Mục đích: dùng metanol, cồn tinh sạch hai loại đường steviosid và rebaudiosid A

+ Phân lập, tinh sạch steviosid:


Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên 1 nhân tố là dung môi metanol với 6 nghiệm thức và 3 lần lặp lại cho mỗi nghiệm thức. Việc phân tích hàm lượng steviosid bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).

Nhân tố D: dung môi metanol


D1: 1:1 D2: 1:2 D3: 1:3


D4: 1:5 D5:1:6 D6: 1:7


+ Phân lập, tinh sạch rebaudiosid A:


Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên 1 nhân tố là dung môi etanol với 6 nghiệm thức và 3 lần lặp lại cho mỗi nghiệm thức. Việc phân tích hàm lượng rebaudiosid A bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).

Nhân tố E: dung môi etanol


E1: 1:1 E2: 1:2 E3: 1:3


E4: 1:5 E5: 1:6 E6:1:7


Bột lá Cỏ


Bả


Tủa


Steviosid

+ Thêm nước

+ Đun cách thủy

Dịch lọc

+ Lọc


+ Ca (OH)

+ FeCl3

Dịch lọc

+Lọc


+ Cho qua cột Amberlite

Glucosid thô

+ Sấy


+Thêm methanol


Dịch lọc

+ Sấy D1 D2 D3 D4 D5 D6


Rắn


+Sấy

Xirô

Xirô

+Hòa tan vào nước

+Lọc polysulfon

+Sấy


+Cồn (96o)

E1 E2 E3 E4 E5 E6

+Lọc

Rắn

+Sấy


Rebaudiosid A


Hình 3.2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm phân lập, tinh sạch steviosid và rebaudiosidA


* Tiến hành:


Bột lá Cỏ Ngọt cân 300g thêm nước vào theo tỷ lệ lá: nước tốt nhất đã được chọn ở thí nghiệm khảo sát tỷ lệ chiết giữa nước và nguyên liệu trong quá trình ly trích hỗn hợp glycosid thô. Sau đó cho mẫu vào đun cách thủy ở nhiệt độ và thời gian đun tốt nhất đã được chọn ở thí nghiệm khảo sát thời gian và nhiệt độ trong quá trình ly trích hỗn hợp glycosid thô. Kết thúc thời gian đun, tiến hành cho mẫu qua giấy lọc, phần rắn bỏ đi, phần dịch lọc thu được cho Ca(OH)2 vào đến khi pH của dịch lọc khoảng 10, tiếp tục cho FeCl3 vào dịch lọc để tạo kết tủa. Tiến hành lọc lấy phần dịch, bỏ kết tủa nhằm loại bớt màu của dung dịch. Sau đó, tiếp tục cho phần dịch lọc thu được qua các cột chứa hạt Amberlite lần lượt Amberlite FPC23 H, Amberlite FPA51 và Amberlite FPA98Cl nhằm khử muối, khử ion, khử màu. Phần dịch sau khi cho qua các cột Amberlite mang sấy hoặc sấy phun thu được hỗn hợp glycosid thô. Hỗn hợp glycosid thô thu được đem hòa tan trong metanol và duy trì ở nhiệt độ 20-25°C, trong thời gian khoảng 30 - 60 phút. Tại thời gian này sự kết tủa được hình thành, lọc và làm khô kết tủa ta thu được steviosid, còn phần dịch lọc cho vào tủ sấy để loại bỏ metanol thu được được hỗn hợp ở dạng xirô. Hỗn hợp xirô này được pha loãng với nước và cho qua màng siêu lọc polysulfone. Tiếp tục thu dịch lọc đem sấy khô. Dịch lọc sấy khô thu được thêm etanol và duy trì ở nhiệt độ 45-50°C trong khoảng 30 phút. Trong thời gian này sự kết tủa được hình thành, lọc và làm khô kết tủa ta thu được rebaudiosid A tinh khiết.

..... Xem trang tiếp theo?
⇦ Trang trước - Trang tiếp theo ⇨

Ngày đăng: 04/07/2022