Các Phương Pháp Phân Lập Và Tuyển Chọn Vi Khuẩn L. Platarum

Để xác định ảnh hưởng của các điều kiện stress môi trường lên quá trình sinh tổng hợp EPS, 100 mL dung dịch giống L. plantarum VAL6 sau khi tăng sinh (có OD595 = 1,5) được bổ sung vào 5 L môi trường MRS lỏng. Các thí nghiệm được thực hiện trong bioreactor 5 L của hãng BIOSTAT (Sartorius Stedim, Germany). Vi khuẩn được nuôi cấy ở điều kiện bình thường (pH luôn được duy trì ở 6,8 bằng NaOH 10 M và H3PO4 10 M, nhiệt độ được giữ ở 37 oC, tốc độ khuấy được thiết lập là 250 vòng/phút) trong 24 giờ trước khi thực hiện các thí nghiệm gây stress.

2.3.1.1. Thí nghiệm stress nhiệt

Để đánh giá ảnh hưởng của stress nhiệt lên khả năng sinh tổng hợp EPS của vi khuẩn L. plantarum VAL6, sau 24 giờ nuôi cấy ở điều kiện bình thường. Các nuôi cấy được xử lý ở nhiệt độ cao 42 và 47 oC trong 7 giờ. Thời gian được tính khi bioreactor đạt đến nhiệt độ gây stress cần thiết. Mẫu với thể tích 500 mL dịch nuôi cấy được lấy theo các mốc thời gian 0, 1, 3, 5 và 7 giờ trong quá trình xử lý nhiệt để định lượng EPS, mật số vi khuẩn, khả năng sống sót sau sấy đông khô, tính chất của EPS (hoạt tính chống oxy hóa, khả năng kích thích sự phát triển của vi khuẩn probiotic, hàm lượng protein), thành phần monosaccharide và sự biểu hiện của các gen liên quan tổng hợp EPS. Trong suốt quá trình stress nhiệt, pH luôn được duy trì ở 6,8 và tốc độ khuấy đảo là 250 vòng/phút. Thí nghiệm được thực hiện ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại.

2.3.1.2. Thí nghiệm stress pH

Để đánh giá ảnh hưởng của stress pH lên khả năng sinh tổng hợp EPS của vi khuẩn L. plantarum VAL6, sau 24 giờ nuôi cấy ở điều kiện bình thường. Các nuôi cấy được xử lý ở pH 3 và 8 trong 7 giờ. Thời gian được tính khi bioreactor đạt đến pH gây stress yêu cầu. Mẫu với thể tích 500 mL dịch nuôi cấy được lấy theo các mốc thời gian 0, 1, 3, 5 và 7 giờ trong quá trình xử lý nhiệt để định lượng EPS, mật số vi khuẩn, khả năng sống sót sau sấy đông khô, tính chất của EPS (hoạt tính chống oxy hóa, khả năng kích thích sự phát triển của vi khuẩn probiotic, hàm lượng protein), thành phần monosaccharide và sự biểu hiện của các gen liên quan tổng hợp EPS. Trong suốt quá trình stress pH, nhiệt độ luôn được duy trì ở 37 oC và tốc độ khuấy đảo là 250 vòng/phút. Thí nghiệm được thực hiện ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại.

2.3.1.3. Thí nghiệm stress NaCl

Để đánh giá ảnh hưởng của stress NaCl lên khả năng sinh tổng hợp EPS của vi khuẩn L. plantarum VAL6, sau 24 giờ nuôi cấy ở điều kiện bình thường. Nuôi cấy được xử lý gây stress bằng cách bổ sung NaCl khan để đạt nồng độ 10% (Nồng độ muối 10% được lựa chọn dựa trên các thí nghiệm thăm dò). Mẫu với thể tích 500 mL dịch nuôi cấy được lấy theo các mốc thời gian 0, 1, 3, 5 và 7 giờ trong quá trình xử lý nhiệt để định lượng EPS, mật số vi khuẩn, khả năng sống sót sau sấy đông khô, tính chất của EPS (hoạt tính chống oxy hóa, khả năng kích thích sự phát triển của vi khuẩn probiotic, hàm lượng protein), thành phần monosaccharide và sự biểu hiện của các gen liên quan tổng hợp EPS. Trong suốt quá trình stress NaCl, nhiệt độ luôn được duy trì ở 37 oC, pH là 6,8 và tốc độ khuấy đảo là 250 vòng/phút. Thí nghiệm được thực hiện ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại.

2.3.1.4. Thí nghiệm tăng nồng độ CO2

Thí nghiệm tăng nồng độ CO2 được thực hiện ở giai đoạn đầu của nuôi cấy. Ngay khi chủng giống đầu tiên để nuôi cấy, CO2 được cung cấp liên tục với tốc độ 250 cm3/phút. Các nghiệm thức về thời gian tăng cường CO2 được mô tả ở bảng

2.2. Sau 24 giờ nuôi cấy theo quy định, mẫu với thể tích 500 mL dịch nuôi cấy được lấy để định lượng EPS, mật số vi khuẩn, khả năng sống sót sau sấy đông khô, tính chất của EPS (hoạt tính chống oxy hóa, khả năng kích thích sự phát triển của vi khuẩn probiotic, hàm lượng protein), thành phần monosaccharide và sự biểu hiện của các gen liên quan tổng hợp EPS. Trong suốt quá trình nuôi cấy tăng cường CO2, nhiệt độ luôn được duy trì ở 37 oC, pH là 6,8 và tốc độ khuấy đảo là 250 vòng/phút. Thí nghiệm được thực hiện ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại.

Bảng 2.1. Bố trí thí nghiệm nuôi cấy tăng cường CO2

Nghiệm thức

Thời gian sục CO2 (giờ)	Thời gian không sục CO2 (giờ)	Tổng thời gian nuôi cấy (giờ)
Đối chứng	0	24	24
Xử lý 4 giờ	4	20	24
Xử lý 8 giờ	8	16	24
Xử lý 24 giờ	24	0	24

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 169 trang tài liệu này.

2.3.2. Các phương pháp phân lập và tuyển chọn vi khuẩn L. platarum

2.3.2.1. Phân lập

Các mẫu thực phẩm lên men bao gồm củ kiệu muối chua (ký hiệu: CK), nước nho lên men (ký hiệu: L), dưa cải thảo muối chua (ký hiệu: DC), rau muống muối chua (ký hiệu: RM), cơm mẻ (ký hiệu: CC) và nem chua (ký hiệu: N) được mua từ chợ Long Xuyên, An Giang. Mẫu phân lập được chứa trong các túi lấy mẫu PE vô trùng và được trữ lạnh ở 5 oC chờ phân tích. Mỗi mẫu có khối lượng 10 g được pha loãng bằng nước muối sinh lý nồng độ 0,9% và trải trên môi trường thạch MRS có bổ sung CaCO3 với nồng độ 5 g/L. Ủ ở 37 ºC trong 36 giờ. Chọn các khuẩn lạc làm tan CaCO3 để cấy truyền nhiều lần cho đến khi có được dòng vi khuẩn thuần [179]. Tất cả các chủng vi khuẩn sau khi tách ròng được bảo quản ở -20 °C trong môi trường phân lập tương ứng có bổ sung thêm 30% (v/v) glycerol làm chất bảo vệ tế bào. Tiến hành xác định các đặc điểm hình thái và sinh hóa (nhuộm Gram và hoạt tính catalase) của các dòng vi khuẩn phân lập được.

2.3.2.2. Kiểm tra khả năng sản xuất EPS và định danh vi khuẩn

LAB từ ống giống được nuôi kích hoạt trong môi trường MRS lỏng trong 24 giờ ở 37 oC rồi cấy trải trên môi trường MRS agar. Chọn khuẩn lạc đơn trên đĩa thạch cấy chuyển vào 100 mL môi trường MRS lỏng để nuôi tăng sinh vi khuẩn trong 24 giờ ở 37 oC, lắc với tốc độ 150 vòng/phút.

Hút 1mL dung dịch LAB sau khi tăng sinh chuyển vào 100 mL môi trường MRS lỏng và ủ ở 37 oC trong 36 giờ, lắc với tốc độ 150 vòng/phút. Các mẫu sau khi nuôi cấy được mang đi xác định hàm lượng EPS theo phương pháp được mô tả ở mục 2.3.3. Chủng vi khuẩn sản xuất EPS cao nhất được định danh bằng phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA. Cặp mồi được sử dụng lần lượt là 27f (5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3’) và 1492r

(5’GGTTACCTTGTTACGACTT 3’) [180]. Kết quả giải trình tự được so sánh mức độ tương đồng di truyền trên ngân hàng dữ liệu của NCBI bằng công cụ Nucleotide BLAST. Kiểm tra kích thước sản phẩm khuếch đại PCR của gen recA để khẳng định L. plantarum bằng cặp mồi planF (5’-CCGTTTATGCGGAACACCTA-3’) và pREV (5’-TCGGGATTACCAAACATCAC-3’) [181].

2.3.3. Phương pháp thu nhận EPS

Tổng EPS thô được thu nhận bằng cách trộn 100 mL dịch nuôi cấy với một lượng NaOH để đạt nồng độ 2 M và khuấy nhẹ qua đêm ở nhiệt độ phòng (25 °C). Sau đó, ly tâm ở 6000 vòng/phút trong 15 phút để loại bỏ xác tế bào vi khuẩn và lấy dịch trong ở phía trên. EPS thô được kết tủa bằng ethanol 96% (v/v). Quá trình kết tủa được thực hiện ở 4 °C trong 24 giờ. EPS kết tủa trong ethanol được thu hoạch bằng cách ly tâm ở 6000 vòng/phút trong 15 phút. Cuối cùng, EPS thô được sấy khô ở nhiệt độ 55 °C cho đến khối lượng không đổi [162,182].

2.3.4. Các phương pháp phân tích tính chất của EPS thu được

2.3.4.1. Phương pháp xác định hoạt tính bắt gốc tự do DPPH

Hòa tan 0,1 g EPS vào 10 mL nước cất. Phản ứng được thực hiện bằng cách bổ sung vào ống nghiệm 1,5 mL dung dịch EPS với 1,5 ml dung dịch DPPH 0,15 mM (được pha trong ethanol 96%). Ống đối chứng thay 1,5 mL dung dịch EPS bằng 1,5 mL nước cất. Hỗn hợp được trộn đều và để yên trong bóng tối 30 phút ở nhiệt độ phòng. Đo độ hấp thụ của hỗn hợp dung dịch ở 517 nm. Hoạt tính chống oxy hóa được tính dựa vào đường chuẩn Trolox. Hoạt tính chống oxy hóa được biểu thị bằng μmol Trolox tương đương (TE)/g EPS.

2.3.4.2. Phương pháp xác định hàm lượng protein trong EPS

Hàm lượng protein tổng trong EPS được xác định bằng phương pháp Bradford [183]. Cân 0,1 g EPS, hoà tan và định mức lên 10 ml bằng nước cất. Hút 2 mL thuốc thử Bradford thêm vào 100 μL dung dịch EPS, trộn đều và ủ trong bóng tối 15 phút. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 595 nm. Hàm lượng protein (mg/g EPS) được tính dựa vào đường chuẩn Bovine serum albumin.

2.3.4.3. Phương pháp xác định khả năng kích thích sự phát triển vi khuẩn probiotic của EPS

Sự phát triển của vi khuẩn probiotic (L. acidophilus, L. plantarum và B. longum được thực hiện trong môi trường MRS không đường được bổ sung 10 g/L các loại EPS khác nhau: EPSn (không gây stress); EPS42 (stress nhiệt ở 42 oC); EPS47 (stress nhiệt ở 47 oC), EPSpH3 (stress ở pH 3), EPSpH8 (stress ở pH 8), EPSNaCl (stress NaCl), EPSCO2 (tăng nồng độ CO2). Môi trường MRS bình thường được sử dụng làm mẫu đối chứng. Vi khuẩn probiotic sau tăng sinh được

chủng vào 100 mL môi trường trường MRS lỏng để đạt mật số 106 CFU/mL. Ủ ở 37 °C với tốc độ lắc 150 vòng/phút trong 24 giờ, sau đó đếm mật số tế bào.

2.3.5. Phương pháp đếm mật số vi khuẩn và tính khả năng sống sót sau đông khô

L. plantarum được đếm mật số trên môi trường MRS agar sau 48 giờ nuôi cấy ở 37 oC từ 3 nồng độ pha loãng liên tiếp. Sau khi ủ, chọn đĩa có số lượng khuẩn lạc 25 - 300 khuẩn lạc và đếm số khuẩn lạc có trên đĩa.

Số khuẩn lạc có trong mẫu được tính dựa theo công thức:

A (CFU/mL) = 𝑁

𝑛1𝑉𝑓1+𝑛𝑖𝑉𝑓𝑖

Trong đó: A là số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) vi khuẩn trong 1 mL mẫu; N là tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn; ni là số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i; V là thể tích dịch mẫu (mL) cấy vào trong mỗi đĩa; fi là độ pha loãng tương ứng.

Quá trình đông khô được thực hiện bằng cách ly tâm 10 mL dung dịch huyền phù tế bào ở tốc độ 6000 vòng/phút trong 15 phút ở 4 oC để thu sinh khối tế bào. Tế bào được rửa 3 lần bằng nước muối sinh lý đã khử trùng để loại các thành phần môi trường. Tất cả các tế bào tiếp tục được làm đông lạnh đến -20 ◦C trước khi đông khô.

- Khả năng sống sót sau đông khô (%) được tính bằng cách lấy mật số vi khuẩn còn sống sau sấy đông khô chia cho mật số vi khuẩn trước khi sấy đông khô (tức sau khi gây stress môi trường) rồi nhân với 100.

- Hệ số sống sót (SF) của L. plantarum VAL6 được tính bằng công thức sau [184]: SF = 1- (logCFUTrước sấy – logCFUSau sấy)/logCFUTrước sấy

logCFUTrước sấy= CFU/ml x Tổng thể tích mẫu (ml) trước đông khô.

logCFUSau sấy= CFU/g x Tổng trong lượng của mẫu vi khuẩn (g) sau đông khô.

Mối tương quan giữa tổng EPS và hệ số sống sót được chuyển đổi từ số liệu năng suất EPS thu được dưới các điều kiện stress khảo sát.

2.3.6. Phương pháp xác định thành phần monosaccharide của EPS

Thành phần monosaccharide của EPS được phân tích bằng sắc ký khí sử dụng đầu dò ion hoá ngọn lửa (GC-FID) theo phương pháp được mô tả bởi Yuan và cs. (2016) [185]. Cụ thể 0,1 g EPS được thủy phân với 3 mL acid trifluoroacetic 2 M ở 105 °C trong 4 giờ. Các đường sau khi thuỷ phân được tạo dẫn xuất bằng cách bổ sung hydroxylamin, pyridin và được acetyl hóa bằng anhydrit axetic

(CH3CO)2O. Các dẫn xuất này được sử dụng để xác định monosaccharide. Mẫu 1 μL được tiêm vào GC-FID bằng bộ lấy mẫu tự động. GC được thực hiện trên máy Agilent 6890 N (Mỹ) và cột HP-5MS UI (chiều dài 30 m, đường kính trong 0,25 mm, độ dày film 0,25 mm). Nitơ được sử dụng làm khí mang với tốc độ dòng 1 mL/phút. Các điều kiện sắc ký được sử dụng như sau: nhiệt độ cột ban đầu được giữ ở 120 °C trong 2 phút, tăng lên (tốc độ 20 °C/phút) 200 °C trong 4 phút, và sau đó tăng lên (tốc độ 25 °C/phút) đến 290 °C, giữ ở 290 °C trong 5 phút. Thành phần monosaccharide (%) được xác định bằng cách so sánh với các đường chuẩn mannose, glucose, galactose, rhamnose, arabinose, xylose và fucose.

2.3.7. Phương pháp phân tích biểu hiện gen

2.3.7.1. Phương pháp tách chiết RNA tổng số và tổng hợp sợi cDNA đầu tiên

RNA tổng số được ly trích bằng thuốc thử TRIzol (Invitrogen, Anh) theo hướng dẫn của hãng sản xuất. Cụ thể 500 μL huyền phù tế bào được ly lâm 12.000 vòng/phút để bỏ dịch nổi. Hòa tan tủa trong 500 uL thuốc thử TRIzol, giữ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Ly tâm ở 12.000 vòng trong 10 phút ở 4 °C và chuyển phần nổi phía trên sang một ống tuýp mới. Thêm 500 μL bromochloropropane vào, lắc đều và ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. Ly tâm ở 12.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4

°C, sau đó chuyển pha nước sang một ống tuýp mới. Thêm 250 μL isopropanol vào, đảo trộn trong 5–10 giây và ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 8 phút ở 4 °C và loại bỏ dịch nổi phía trên. Rửa tủa bằng 250 μL ethanol 75%. Ly tâm ở 7.500 vòng/phút trong 5 phút để loại bỏ ethanol và làm khô RNA trong không khí một thời gian ngắn.

RNA được xử lý bằng RQ1 RNase-free DNase (Promega, Madison, Mỹ) để loại bỏ sự nhiễm bẩn DNA. Kiểm tra độ tinh khiết RNA bằng cách đo độ hấp thụ ở bước sóng 260 nm và 280 nm có tỷ lệ A260/A280 là 1,8–2,2 bằng NanoDrop DeNovix DS-11 Spectrophotometer (DeNovix, Wilmington, DE USA). Quá trình tổng hợp sợi cDNA đầu tiên được thực hiện theo phương pháp được mô tả của kít GoScript™ Reverse Transcription System (Promega, Madison, USA). cDNA sau khi tổng hợp được trữ ở -20 °C để tiếp tục thực hiện PCR và phân tích định lượng phản ứng chuỗi polymerase thời gian thực (Real-time qPCR).

2.3.7.2. Thiết kế và tổng hợp mồi

Gen tham chiếu được chọn là 16S rRNA. Các cặp mồi của sáu gen mục tiêu

được thiết kế để phân tích Real-time qPCR dựa trên trình tự bộ gen của L. plantarum WCFS1 (Ngân hàng gen: AL935263.2) sử dụng phần mềm Primer- BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/). Trình tự 16S rRNA của chủng L. plantarum VAL6 được dùng làm khuôn để thiết kế mồi cho gen tham chiếu. Các cặp mồi được thiết kế với chiều dài các trình tự từ 18-23 nucleotide, nhiệt độ bắt cặp (Tm) từ 57-62 °C và tỷ lệ GC không quá 70% (Bảng 2.1). Các đoạn mồi được tổng hợp bởi Công ty TNHH Công nghệ sinh học Brilliance Thượng Hải. Bảng 2.2. Các đoạn mồi được sử dụng phân tích Real-time qPCR

Gene

Mồi	Trình tự mồi (5'->3')	Tm	GC (%)	Chiều dài sản phẩm (bp)
glmU	(+)	ATGCAACAACGGATCAACGC	60,11	50,0	475
glmU	(-)	CGACATTCGTGTGGTGCTTG	60,11	55,0	475
pgmB1	(+)	TCGATGGCGTTATCACGGAC	60,25	55,0	423
pgmB1	(-)	CGGGATCAGGTTTACCGTGT	59,75	55,0	423
cps4E	(+)	AGTTGACTTCTGACGGTCCC	59,32	55,0	449
cps4E	(-)	AACCGTTCCCATCAGCATCT	59,38	50,0	449
cps4F	(+)	CTGGGGCTTTACTCCTGGTG	60,04	60,0	452
cps4F	(-)	CCCCAACGTCCGATTGAGAA	60,04	55,0	452
cps4H	(+)	TTTGCTTTGGTCATGCTGGC	59,97	50,0	596
cps4H	(-)	TCGGACGTTCCGAACCAAAT	59,97	50,0	596
cps4J	(+)	ACGGCTCGATTTTTAGGGCT	59,75	50,0	480
cps4J	(-)	GACGCTCATTGCGATTGGTG	60,25	55,0	480
16S rRNA	(+)	GCATTAAGCATTCCGCCTGG	59,97	55,0	183
16S rRNA	(-)	ACCTGTATCCATGTCCCCGA	60,03	55,0	183

2.3.7.3. Thực hiện Real-time qPCR và tính sự biểu hiện gen

Real-time qPCR được thực hiện trên hệ thống PCR thời gian thực Liberty16 (Ubiquitome Limited, New Zealand), sử dụng SensiFAST SYBR No-Rox Kit (Bioline, Meridian Bioscience, USA) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Hỗn hợp phản ứng chứa 10 μL dung dịch SensiFAST SYBR No-Rox (2X), 7,4 μL mẫu cDNA, 0,8 μL mồi thuận (10 μM), 0,8 μL mồi ngược (10 μM) và 1 μL nước cấp phân tử. Để làm đối chứng âm cho tất cả các thí nghiệm qPCR, cDNA được thay thế bằng RNA (không có bước phiên mã ngược làm khuôn mẫu). Phản ứng cho mỗi gen được thực hiện ba lần trong các phản ứng qPCR riêng lẻ. Các điều kiện

khuếch đại PCR là biến tính ở 95 °C trong 3 phút, tiếp theo là 40 chu kỳ khuếch đại ở 95 °C trong 30 giây, 58 °C trong 30 giây và 72 °C trong 30 giây. Phương pháp 2- ΔΔCt được sử dụng để tính các thay đổi trong mức độ biểu hiện gen [186]. Trong đó ΔΔCt = (Ct, gen mục tiêu - Ct, gen tham chiếu)Thời gian x - (Ct, gen mục tiêu - Ct, gen tham chiếu)Thời gian 0.

2.3.8. Phương pháp xử lý số liệu

Sự sai khác của các số liệu được xử lý bằng DUNCAN’ Test trên phần mềm STATGRAPHICS Centurion XV.I, với số mẫu lặp lại là 3 và sai số giữa các thí nghiệm ở mức ý nghĩa p<0,05.