Stress Môi Trường Và Đáp Ứng Sinh Tổng Hợp Eps Ở Lab

1.9. Stress môi trường và đáp ứng sinh tổng hợp EPS ở LAB

1.9.1. Stress môi trường và sản xuất EPS ở LAB

Sự sản xuất EPS có thể được kích thích bởi các điều kiện stress môi trường khác nhau như một phản ứng bảo vệ tế bào, cũng như tăng cường hình thành màng sinh học [139]. Vi khuẩn tăng cường tổng hợp EPS tạo ra rào cản vật lý trên bề mặt nhằm bảo vệ tế bào khỏi các điều kiện môi trường bất lợi (Hình 1.12) [140]. Nguyen và cs. (2014) cũng đã chứng minh stress nhiệt dưới ngưỡng gây chết giúp tăng cường sản xuất EPS ở B. bifidum [141].

Tế bào không có màng EPS bao

Stress môi trường

Tế bào có màng EPS bao quanh

Hình 1.12. Stress môi trường kích thích sản xuất EPS

Mặc dù không có nghiên cứu nào chứng minh stress pH thấp làm tăng sản xuất EPS, nhưng mối tương quan giữa sản xuất EPS và khả năng chịu đựng acid đã được ghi nhận ở LAB. Chẳng hạn như EPS trong bột chua có thể liên quan đến khả năng chịu acid của LAB [142]. Hay là L. johnsonii FI9785 (chủng đột biến tăng sản xuất EPS) cho thấy khả năng kháng cao hơn với stress acid so với chủng hoang dại và sự giảm sản xuất EPS làm cho vi khuẩn ít có khả năng sống sót khi có sự hiện diện của muối mật, kháng sinh và stress nhiệt, nhưng làm tăng đáng kể quá trình tự kết dính của vi khuẩn; yếu tố quan trọng đối với sự xâm nhập của vi khuẩn đường ruột [118]. Fedorová và cs. cũng tìm ra mối tương quan tích cực giữa sản xuất EPS và tính kháng của L. reuteri với stress pH thấp của đường tiêu hóa [143]. Tương tự, các chủng L. delbrusi subsp. bulgaricus B3, G12 và S. thermophilus W22 sản xuất EPS cao có khả năng kháng với pH 2 tốt hơn so với các chủng sản xuất EPS thấp [144].

EPS giúp tăng cường tính kháng của tế bào đối với pH thấp là nhờ các nhóm chức năng mang điện tích âm được liên kết với EPS có thể hạn chế sự tiếp cận của acid với tế bào vi khuẩn [145]. Ngoài ra, sự hình thành lớp màng sinh học với thành

phần bao gồm các EPS bao quanh có thể giúp bảo vệ tế bào tốt hơn. Một nghiên cứu được thực hiện trên L. plantarum M606 khi xử lý bằng acid acetic 11% trong 30 phút đã chứng minh vi khuẩn tạo biofilm có khả năng kháng tốt hơn so với vi khuẩn ở trạng thái không có biofilm bảo vệ [146]. Không có nhiều nghiên cứu báo cáo mối liên quan giữa pH kiềm và sản xuất EPS. Tuy nhiên, người ta cho rằng EPS có liên quan đến sự hình thành các khối huyền phù, bao gồm một hỗn hợp phức tạp của EPS, cung cấp sự bảo vệ vi khuẩn chống lại pH kiềm [147].

Stress thẩm thấu cho thấy ảnh hưởng tích cực đến khả năng tổng hợp EPS ở LAB. Điều kiện stress NaCl (gây ra áp suất thẩm thấu) vừa phải có thể kích thích sản xuất EPS ở Leuc. mesenteroides/pseudomesenteroides 406 [148]. Seesuriyachan và cs. (2012) báo cáo rằng sản xuất EPS tăng khi L. confusus được stress dưới điều kiện mặn cao [149]. Một nghiên cứu khác trên L. confusus TISTR 1498 cũng chứng minh rằng quá trình sinh tổng hợp EPS không phụ thuộc vào sinh khối và nồng độ NaCl cao có thể tăng cường sản xuất EPS trong quá trình lên men rắn [150]. Trái lại, bằng chứng ức chế sản xuất EPS bởi NaCl được báo cáo trong nuôi cấy L. helveticus ATCC 15807 [151]. Để giải thích cho sự tăng sản xuất EPS bởi stress NaCl, các nghiên cứu đã chứng minh rằng sau khi xử lý bằng muối, các tế bào tạo ra phức hợp chất nền ngoại bào (bao gồm EPS) nhiều hơn [152]. Chính phức hợp EPS này với khả năng giữ nước cao giúp ngăn chặn sự mất nước gây ra do thẩm thấu [153].

Tác động của CO2 lên sản xuất EPS ở LAB cũng được ghi nhận ở một vài nghiên cứu. Sản xuất EPS phụ thuộc hoàn toàn vào nồng độ CO2 và năng xuất EPS tối đa do B. longum JBL05 tổng hợp tăng tỷ lệ thuận với nồng độ CO2 trong khoảng 0 -20% [154]. Tương tự, L. casei phát triển trong môi trường giàu CO2 được bao bọc bởi lớp màng giống như hợp phần EPS [155]. Nhiều vi khuẩn phản ứng với stress môi trường, chẳng hạn như acid, bằng cách sinh ra EPS để tạo ra một hàng rào vật lý làm chậm quá trình khuếch tán chất độc hại vào tế bào, và đây cũng có thể là cơ chế của vi khuẩn phản ứng với stress CO2.

1.9.2. Stress môi trường và khả năng chịu stress của LAB

Khả năng sống sót cao dưới các điều kiện môi trường khắc nghiệt sẽ tạo lợi thế lớn về tiềm năng probiotic của LAB. Nhiều nghiên cứu đã khảo sát đặc tính probiotic của LAB thông qua đánh giá khả năng sống sót của chúng dưới các điều

kiện stress môi trường. Stress nhiệt ở 45 °C trong 30 phút không ảnh hưởng đến tốc độ tăng trưởng của L. rhamnosus HN001, stress nhiệt ở 50 °C làm chậm 20% tốc độ tăng trưởng nhưng stress nhiệt ở 55 oC làm giảm 100% tốc độ tăng trưởng [156]. Một số chủng L. plantarum cho thấy khả năng chịu đựng cao khi tiếp xúc với acid hydrochloric (pH 3) và hầu hết trong số chúng biểu hiện giảm đáng kể tỷ lệ sống sót ở pH 2 trong trường hợp có và không có pepsin [157]. Tỷ lệ sống sót của L. plantarum đạt gần 100% ở nồng độ muối mật 0,5% trong 4 giờ. Một số chủng có thể sống sót trong điều kiện muối mật 1% và pH 8 trong 24 giờ [157,158]. Những nghiên cứu này cho thấy Lactobacillus có khả năng sống sót cao trong các điều kiện môi trường khắc nghiệt.

Không giống với các điều kiện gây stress khác, một số bằng chứng cho thấy CO2 giúp cải thiện khả năng sống sót ở vi khuẩn LAB. CO2 giúp điều hòa sinh lý và chuyển hóa năng lượng của tế bào thông qua tác động của các enzyme liên quan đến quá trình glycolysis [159]. CO2 không chỉ duy trì điều kiện tăng trưởng yếm khí mà còn kích thích gia tăng mật số và sản xuất EPS ở B. longum JBL05 [160]. Ngoài ra, nghiên cứu về vai trò của enzyme phosphoenolpyruvate carboxylase (PpC) và carbamoyl-phosphate synthase trên vi khuẩn probiotic cho thấy các enzyme này đã xúc tác cố định CO2 để sinh tổng hợp aspartate, arginine và uracil [159].

1.9.3. Sự thích nghi với stress môi trường làm tăng khả năng sống sót của LAB

Khả năng sống sót của vi khuẩn được cải thiện đáng kể sau khi đáp ứng thích nghi với các stress môi trường. Trong cơ chế đáp ứng thích nghi với các điều kiện stress môi trường. Tế bào phản ứng bằng cách tăng cường tổng hợp nhân tố sigma (RpoS) làm thay đổi biểu hiện của các gen có liên quan đến tính kháng của tế bào (trong đó có sự tăng cường tổng hợp EPS). Đã có bằng chứng cho thấy sự thích ghi với stress nhiệt làm tăng khả năng sống sót của LAB trong quá trình sấy phun [161]. Tương tự, stress nhiệt dưới ngưỡng gây chết giúp cải thiện khả năng sống sót của B. bifidum nhờ sự bao phủ của lớp EPS xung quanh tế bào [162].

Giống như stress nhiệt, sự thích nghi với pH thấp cũng giúp LAB cải thiện khả năng sống sót. Sau khi thích nghi với stress acid, B. longum và B. catenulatum cho thấy khả năng phát triển tốt hơn trong môi trường có muối mật (1-3%) và NaCl (6-10%) và có sức đề kháng tốt hơn ở nhiệt độ cao (60-70 oC, 10 phút) [163]. Khả năng tồn tại của B. longum subsp. longum BBMN68 tăng gấp 70 lần sau khi gây

stress ở pH 4,5 trong 2 giờ trước khi đưa tới pH gây chết (pH 3,5) trong 120 phút [164].

Cũng như các điều kiện stress môi trường khác, sau khi thích nghi với stress thẩm thấu, khả năng sống của vi khuẩn probiotic (thuộc nhóm LAB) cao hơn 0,83 đơn vị Log (CFU/g) so với các tế bào không được gây stress [165]. L. paracasei NFBC 338 thích nghi với stress NaCl có khả năng chống chịu nhiệt cao hơn đáng kể so với đối chứng không thích nghi [166]. Tương tự, L. rhamnosus HN001 đã cải thiện đáng kể khả năng tồn tại khi tồn trữ ở 30 oC sau khi được gây stress với NaCl nồng độ 0,6 M [156].

Qua các nghiên cứu cho thấy việc tăng khả năng sống sót sau khi thích nghi với stress môi trường có thể liên quan đế sự hình thành lớp vỏ EPS bao quanh tế bào. Điều này gợi ra tiềm năng sử dụng stress môi trường để kích thích tạo thành lớp EPS vi bao xung quanh tế bào nhằm cải thiện khả năng chịu đựng của các chủng giống LAB.

1.9.4. Stress môi trường và sự thay đổi thành phần monosaccharide của EPS

Thành phần và điều kiện môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng mạnh mẽ đến năng suất, thành phần cũng như hoạt tính sinh học của EPS được tổng hợp bởi vi khuẩn. Những thay đổi trong điều kiện môi trường là nguyên nhân làm thay đổi sản xuất EPS và định hướng cho sự tổng hợp một loại EPS mới [167]. Nhưng đối với hầu hết các vi khuẩn, thành phần monosaccharide trong EPS được xác định về mặt di truyền và thay đổi không đáng kể bởi điều kiện nuôi cấy bình thường. Tuy nhiên, một nghiên cứu trên L. delbrueckii subsp. bulgaricus CNRZ 1187 và L. delbrueckii subsp. bulgaricus CNRZ 416 cho thấy có sự khác nhau trong tỷ lệ các monosaccharide của EPS khi hai chủng này được nuôi cấy ở hai điều kiện pH có kiểm soát và không kiểm soát [12]. Có thể điều kiện không kiểm soát đã làm thay đổi pH môi trường, đó như một yếu tố gây stress tác động lên thành phần monosaccharide của EPS. Mặc dù có rất ít nghiên cứu ở LAB báo cáo về sự thay đổi thành phần EPS dưới tác động của stress môi trường, nhưng nhiều nghiên cứu trước đây trên vi khuẩn lam và nấm chứng minh rằng thành phần và tỷ lệ monosaccharide trong EPS thay đổi khi có sự hiện diện của yếu tố gây stress là NaCl. Tỷ lệ glucose trên các monosaccharide khác giảm sau khi Synechocystis sp. BASO444 được gây stress với NaCl nhưng ở Synechocystis sp. BASO507 và

BASO511 thì tỷ lệ này lại tăng [168]. Người ta cũng phát hiện sự khác biệt về thành phần monosaccharide trong EPS khi Phellinus linteus tiếp xúc với NaCl [169].

Ở chiều ngược lại, một nghiên cứu đã chứng minh rằng có mối tương quan giữa thành phần monosaccharide với khả năng kháng stress của LAB. L. mucosae DPC 6426 (sản xuất EPS giàu mannose) thể hiện lợi thế vượt trội về công nghệ và sinh học, đây là lý do mà chủng này phản ứng tốt hơn với stress thẩm thấu và có sức đề kháng tốt hơn với sự phá vỡ cơ học [11].

2.9.5. Stress môi trường và sự biểu hiện của các gen liên quan tổng hợp EPS

Vi khuẩn phản ứng để thích nghi với các stress môi trường bằng cách kích hoạt các cơ chế điều hòa khác nhau, bao gồm: tình trạng liên quan đến các hoạt động chuyển hóa năng lượng; các hoạt động liên quan đến phiên mã và dịch mã; tình trạng liên quan đến chuyển hóa nucleotide và hoạt động sinh tổng hợp acid amin; và các hoạt động liên quan đến vách tế bào [170]. Quá trình thích ứng này chủ yếu được thực hiện qua trung gian bởi sự kết hợp của mạng lưới điều hòa phiên mã, cho phép vi khuẩn cảm nhận và chuyển đổi các kích thích ngoại bào (stress môi trường) thành một phản ứng tế bào cụ thể, dẫn đến thay đổi biểu hiện gen và hoạt động của các enzyme (truyền tín hiệu) (Hình 1.13).

Các thay đổi môi trường: Nhiệt độ, pH, áp suất thẩm thấu, kháng sinh

Những thành phần chống lại điều kiện môi trường khắc nghiệt

mRNA

DNA

Sự biểu hiện của

những gen đặc biệt

Tồn tại & phát triển

Hình 1.13. Cơ chế điều hòa phiên mã chống lại stress môi trường ở vi khuẩn Hüfner và cs. (2008) đã nghiên cứu đáp ứng phiên mã của L. reuteri với môi

trường bột chua, kết quả cho thấy có những thay đổi đáng kể mức độ biểu hiện

mRNA của 101 gen liên quan đến các quá trình đa dạng tế bào, từ chuyển hóa carbohydrate và năng lượng đến sinh tổng hợp vách tế bào, sản xuất EPS, phản ứng stress, truyền tín hiệu và sinh tổng hợp cobalamin [171]. Tương tự, khi phân tích cơ chế phản ứng dung nạp acid của B. longum BBMN68, sau khi thích nghi với acid ở pH 4,5 trong 2 giờ, 293 gen của BBMN68 biểu hiện điều chỉnh tăng hơn 2 lần và 245 gen được điều chỉnh giảm hơn 2 lần ở pH gây chết (pH 3,5) trong 120 phút [172]. Wallet và cs. (2007) cũng tìm thấy sự khác biệt trong biểu hiện gen ở L. Reuteri ATCC55730 khi thay đổi pH môi trường gần với pH dạ dày của người [173].

Mối liên quan giữa stress môi trường với sự biểu hiện của các gen liên quan đến quá trình sinh tổng hợp EPS ở LAB cũng được ghi nhận ở một vài nghiên cứu. Sự tăng biểu hiện của gen gtf 01207, một gen mã hóa cho priming glycosyltransferase, được quan sát thấy trong B. animalis subsp. lactis sau khi tiếp xúc với stress acid, muối mật và thẩm thấu [139,174]. Tương tự, một nghiên cứu cho thấy khi pH môi trường giảm từ 6,5 xuống 5,5 đã làm tăng mức độ biểu hiện của gen epsNMLKJ ở S. thermophilus ASCC 1275. Tuy nhiên, các gen liên quan tổng hợp nucleotide-đường như dTDP-rhamnose và UDP-GlcNAc lại biểu hiện giảm [175]. Tuy nhiên, khi nhiệt độ tăng từ 37 lên 40 oC, không làm thay đổi mức độ biểu hiện của epsNMLKJ nhưng sự biểu hiện của gen eps1C và eps1D tăng lên, trong khi sự biểu hiện của gen eps2C và eps2D lại giảm [175].

Đánh giá sự biểu hiện của gen không chỉ dựa trên mRNA mà còn dựa vào biểu hiện protein. Enzyme glyceraldehyd-3-phosphate dehydrogenase (được chứng minh cần thiết cho sản xuất EPS của Xanthomonas campestris pv. [176]) được biểu hiện dị hợp trong L. rhamnosus HN001 tăng nhẹ khi stress nhiệt. Trái lại, mức độ biểu hiện dị hợp của glyceraldehyd-3-phosphate dehydrogenase và phosphoglycerate kinase (liên quan đến sinh tổng hợp EPS của Xanthomonas axonopodis pv. Glycines [177]) giảm sau khi stress thẩm thấu [156].

Từ những đánh giá tổng quan có thể thấy rằng EPS từ LAB đa dạng về cấu trúc cũng như thành phần và tính chất của chúng. Các yếu tố môi trường có ảnh hưởng lớn đến hàm lượng, thành phần monosaccharide cũng như tính chất của các EPS thu được. Trong luận án này, chủng L. plantarum được phân lập từ thực phẩm lên men và khảo sát ảnh hưởng của stress nhiệt, pH, NaCl và nuôi cấy tăng cường

CO2 đến quá trình tổng hợp EPS ở vi khuẩn này. Bên cạnh đó nghiên cứu cũng phân tích sự thay đổi thành phần monosaccharide và sự biểu hiện mRNA của các gen liên quan tổng hợp EPS nhằm làm sáng tỏ đáp ứng sinh tổng hợp EPS ở L. plantarum dưới điều kiện nuôi cấy có bổ sung stress môi trường.

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng nghiên cứu

Phạm vi của nghiên cứu được thực hiện trên chủng L. plantarum VAL6 tự phân lập.

Chủng vi khuẩn probiotic: L. acidophilus và B. longum được mua từ nhà sản xuất THT (Gembloux, Bỉ), trong khi L. plantarum được sử dụng là chủng L. plantarum VAL6 tự phân lập.

2.2. Hóa chất

Thành phần môi trường Man Rogosa Sharpe (MRS) nuôi cấy vi khuẩn [178]: Yeast extract 2%, Peptone 1%, Glucose 2%, NaCl 0,5%, K2HPO4 0,2%, MgSO4

0,02%, MnSO4 0,004%, Tween 80 0,1%.

Hóa chất khác: NaOH, H3PO4, CaCO3, (CH3CO)2O, ethanol 96%, DPPH, Trolox, Bovine serum albumin, Coomassie Brilliant Blue G250, Acid trifluoroacetic, hydroxylamin, pyridine, TRIzol, Bromochloropropane, Isopropanol.

2.3. Phương pháp nghiên cứu