Khảo Sát Các Yếu Tố Ảnh Hưởng Đến Điều Kiện Sản Xuất Của Các Chủng

rhodochrous T9 được xác định trong mô hình như sau: glucose 7,93 g/L, pepton 6,1 g/L và NaCl 2,95 g/L, kết quả dự đoán mật độ vi khuẩn trong phần mềm DX11 tối đa đạt 2,93x 1010 CFU/mL (10,467Log.CFU/mL). Thử nghiệm nuôi cấy vi khuẩn

theo môi trường mà mô hình đề xuất, cho kết quả mật độ vi khuẩn Rhodococcus rhodochrous T9 sau 36 giờ nuôi cấy, nhiệt độ 33 oC, tỷ lệ nạp giống là 2,5% là 2,52 x 1010 CFU/mL (10,40 Log.CFU/mL) khá tương thích với mật độ vi khuẩn mà mô hình đã dự đoán.

Vậy, ba chủng vi khuẩn được nhân sinh khối trong môi trường sản xuất lỏng có thành phần môi trường đã được tối ưu hóa, kết quả cho thấy mật độ vi khuẩn B. licheniformics B85 là 3,14 x 1011 CFU/mL, mật độ vi khuẩn P. stutzeri KL15 là 2,37 x 1011 CFU/mL, R. rhodochrous T9 là 2,52 x 1010 CFU/mL.

3.2.2. Tạo chế phẩm vi sinh dạng bột

3.2.2.1. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến điều kiện sản xuất của các chủng vi khuẩn trên môi trường bán rắn

Khảo sát môi trường ảnh hưởng đến sinh khối các chủng vi khuẩn

Ba chủng vi khuẩn được pha loãng mật độ vi khuẩn về 108 CFU/mL, cấy vào các môi trường như cám gạo, cám bắp, cám mì và bã đậu nành trong thời gian 48 giờ, nhiệt độ phòng, độ ẩm 50% với tỷ lệ nạp giống là 5%.

Hình 3.26. Khảo sát các môi trường

Hình 3.26 ( phụ lục 2.6.1 - bảng 2.17) cho kết quả chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis B85 phát triển tốt nhất trên môi trường là bã đậu nành với mật độ 2,9 x109 CFU/gam, mật độ vi khuẩn phát triển tốt hơn so với các môi trường còn lại.

Chủng vi khuẩn P. stutzeri KL15 phát triển tốt nhất trên môi trường có chất mang là cám bắp có mật độ 1,27 x109 CFU/mL, chủng Rhodococcus rhodochrous T9 phát triển tốt nhất trên môi trường là cám gạo với mật độ 1x109 CFU/gam. Trong sản xuất chế phẩm vi sinh, thường sẽ chuyển qua dạng bột vì dễ dàng vận chuyển và bảo quản lâu hơn. Do đó, vi khuẩn Bacillus licheniformis B85 sẽ nuôi cấy trên môi trường chứa chất mang là bã đậu nành, Pseudomonas stutzeri KL15 là cám bắp và Rhodococcus rhodochrous T9 là cám gạo.

Theo xử lý thống kê, các chủng vi khuẩn trên môi trường chứa chất mang tốt nhất đều có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với các môi trường còn lại. Đây là phương pháp lên men bề mặt của nhóm vi khuẩn hiếu khí, thành phần môi trường thường chứa cả tinh bột và protein và trộn thêm các khoáng chất nhằm hỗ trợ thêm chất dinh dưỡng cho vi khuẩn phát triển (Trần Thị Thanh, 2000).

Khảo sát tỷ lệ nạp giống ảnh hưởng đến sinh khối các chủng vi khuẩn

Từ các môi trường phù hợp đã nghiên cứu ở nội dung trên, các chủng vi khuẩn được nuôi cấy trong thời gian 48 giờ, nhiệt độ phòng, độ ẩm 50% với tỷ lệ nạp giống là 2,5%, 5%, 7,5% và 10%. Ở môi trường bán rắn, không khảo sát mật độ vi khuẩn bổ sung mà chỉ khảo sát tỷ lệ giống vì thừa kế từ môi trường tăng sinh và môi trường sản xuất lỏng (mật độ vi khuẩn là 108 CFU/mL). Do đó, chọn mật độ 108 CFU/mL cho các chủng vi khuẩn và chỉ khảo sát các tỷ lệ giống bổ sung vào môi trường bán rắn.

Hình 3.27. Khảo sát tỷ lệ nạp giống

Hình 3.27 (phụ lục 2.6.1 – bảng 2.18), chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis

B85 phát triển tốt nhất với tỷ lệ giống là 7,5 % có mật độ 3,4x109 CFU/gam tuy

nhiên theo xử lý thống kê thì mật độ vi khuẩn ở 3 nồng độ 5%, 7,5% và 10% của chủng vi khuẩn B.licheniformis B85 không có sự khác biệt có ý nghĩa, do đó để có hiệu quả kinh tế, chọn tỷ lệ giống là 5% bổ sung vào môi trường bán rắn cho vi khuẩn B.licheniformis B85. Chủng vi khuẩn Pseudomonas stutzeri KL15 phát triển tốt nhất với tỷ lệ giống là 10% có mật độ 2 x 109 CFU/mL, tuy nhiên mật độ vi khuẩn KL 15 ở tỷ lệ giống 7,5% là 2 x 109 CFU/mL. Xét ý nghĩa thống kê, giữa hai nghiệm thức này không có sự khác biệt nên chọn tỷ lệ giống cho chủng vi khuẩn P. stutzeri KL15 là 7,5%. Tương tự chủng Rhodococcus rhodochrous T9 phát triển tốt nhất với mật độ 10% (1,8x109 CFU/gam), tuy nhiên mật độ vi khuẩn giữa các tỷ lệ 5%, 7,5% và 10% không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê, nên chọn mật độ vi khuẩn cho môi trường bán rắn là 5%. Trong môi trường sản xuất, thành phần là các nguồn nitơ thô còn gọi là nguồn nitơ kỹ thuật, thường những môi trường này thì vi sinh vật phải cần một thời gian dài để thích nghi và sử dụng các thành phần trong môi trường, do đó để việc lên men bán rắn với thời gian nhanh hơn thì sẽ cần lượng giống nhiều hơn môi trường lỏng (Trần Thị Thanh, 2000).

Tóm lại, tỷ lệ giống để bổ sung vào môi trường bán rắn cho vi khuẩn Bacillus licheniformis B85, Rhodococcus rhodochrous T9 là 5% và vi khuẩn Pseudomonas stutzeri KL15 là 7,5%.

Khảo sát độ ẩm ảnh hưởng đến sinh khối các chủng vi khuẩn

Các chủng vi khuẩn sau khi được nhân sinh khối trong môi trường sản xuất lỏng đã được tối ưu hóa, cấy vào các môi trường phù hợp đã nghiên cứu ở nội dung 4.9.1, 4.9.2, ủ trong thời gian 48 giờ, nhiệt độ phòng, khảo sát độ ẩm 45%, 50%, 55% và 60%.

Hình 3.28. Khảo sát độ ẩm nuôi cấy

Chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis B85 phát triển tốt nhất độ ẩm 55% có mật độ vi khuẩn là 3,6 x 109 CFU/gam tuy nhiên theo xử lý thống kê thì mật độ vi khuẩn ở hai độ ẩm 50, 55% không có sự khác biệt có ý nghĩa, do đó chọn độ ẩm 55% để có mật độ cao nhất. Chủng vi khuẩn Pseudomonas stutzeri KL15 phát triển tốt nhất ở độ ẩm 55% có mật độ 2 x 109 CFU/mL, nghiệm thức độ ẩm 55% có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với các nghiệm thức còn lại, do đó chọn độ ẩm 55% cho môi trường nuôi cấy chủng vi khuẩn này. Tương tự Rhodococcus rhodochrous T9 phát triển tốt nhất ở độ ẩm 55% với mật độ 1,42 x 109 CFU/gam, mật độ vi khuẩn Rhodococcus rhodochrous T9 ở độ ẩm 50% là 1x109 CFU/mL. Xét ý nghĩa thống kê, giữa hai nghiệm thức này không có sự khác biệt nên có thể chọn một trong hai độ ẩm để nhân sinh khối. Trong lên men bán rắn, độ ẩm cũng ảnh hưởng đến quá trình nhân sinh khối của vi khuẩn, nếu độ ẩm quá thấp hay quá cao thì quá trình nhân sinh khối đều bị ảnh hưởng, môi trường lên men bán rắn độ ẩm của nguyên liệu môi trường phải từ 60-75%. Sự có mặt của nước giúp vi sinh vật hấp thu chất dinh dưỡng từ môi trường dễ dàng hơn (Trần Thị Thanh, 2000).

Tóm lại, độ ẩm để bổ sung vào môi trường bán rắn cho vi khuẩn Bacillus licheniformis B85, Rhodococcus rhodochrous T9, vi khuẩn Pseudomonas stutzeri KL15 là 55%.

Khảo sát thời gian ảnh hưởng đến sinh khối các chủng vi khuẩn

Thí nghiệm khảo sát thời gian nuôi cấy từ 36, 48, 60, 72, 84, 96 giờ cho 3 chủng vi khuẩn trên môi trường bán rắn cho thấy khoảng thời gian nuôi cấy tốt nhất trong khoảng 48 – 84 giờ. Kết quả thể hiện ở phụ lục 2.6.1 – bảng 2.20

Chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis B85 phát triển tốt nhất với thời gian là 60 giờ có mật độ 9,2 x109 CFU/gam, theo xử lý thống kê thì mật độ vi khuẩn ở thời gian 60 giờ của chủng vi khuẩn B85 không có sự khác biệt có ý nghĩa với nghiệm thức thời gian 72 giờ (mật độ vi khuẩn là 8,5 x 109 CFU/gam), do đó để có hiệu quả kinh tế, chọn thời gian là 60 giờ để thu nhận mật độ vi khuẩn trong môi trường bán rắn cho vi khuẩn Bacillus licheniformis B85.

Chủng vi khuẩn Pseudomonas stutzeri KL15 phát triển tốt nhất với thời gian 72 giờ có mật độ 5,1 x 109 CFU/mL. Xét thống kê, nghiệm thức 72 giờ này có sự

khác biệt có ý nghĩa với các nghiệm thức còn lại nên chọn thời gian cho chủng vi khuẩn P. stutzeri KL15 là 72 giờ. Tương tự chủng Rhodococcus rhodochrous T9 phát triển tốt nhất với thời gian 72 giờ có mật độ 4,9 x 109 CFU/mL. Xét thống kê, nghiệm thức 72 giờ này có sự khác biệt có ý nghĩa với các nghiệm thức còn lại nên chọn thời gian cho chủng vi khuẩn Rhodococcus rhodochrous T9 là 72 giờ. Tóm lại, thời gian nuôi cấy cho chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis B85 là 60 giờ và chủng vi khuẩn Pseudomonas stutzeri KL15, Rhodococcus rhodochrous T9 là 72 giờ.

Hình 3.29. Khảo sát thời gian nuôi cấy

Tác giả Trần Hữu Tâm (2014), đã nghiên cứu qui trình pilot sản xuất sinh khối 3 chủng vi khuẩn Bacillus sp. để tạo probiotic cung cấp carotenoid với nguồn cơ chất là đậu nành trong môi trường có agar với thời gian 48h, sau đó đông khô tế bào vi khuẩn để tạo probiotic, thử nghiệm trên chuột. Do ứng dụng chế phẩm vi sinh cho hai mục đích khác nhau, nên thành phần và phương pháp làm khác nhau nên không thể so sánh kết quả.

3.2.2.2. Tạo chế phẩm vi khuẩn dạng bột

Ba chủng vi khuẩn được nhân lên từ môi trường bán rắn theo điều kiện đã khảo sát, đem đi sấy ở điều kiện nhiệt độ 40o C – 45o C trong thời gian 2 -3 ngày. Các sản phẩm được sấy khô về độ ẩm 10 - 15%, sau đó nghiền mịn, được đếm lại mật độ vi khuẩn để có thể tiến hành trộn với các chất phụ gia. Mật độ vi khuẩn được đếm lại sau khi sấy khô và nghiền mịn. Sau khi sấy khô thì tế bào vi khuẩn mất nước nên sẽ có một số tế bào vi khuẩn bị chết đi. Nhóm vi khuẩn nào có khả năng tạo bào tử sẽ chuyển thành bào tử và khi có điều kiện dinh dưỡng và độ ẩm, nhiệt độ

phù hợp thì nhóm vi khuẩn sẽ phát triển, còn những chủng vi khuẩn không có khả năng tạo bào tử, tế bào sinh dưỡng khi qua giai đoạn sấy, một phần tế bào chết đi và mật độ vi khuẩn giảm. Giai đoạn nghiền cũng là một yếu tố ảnh hưởng đến mật độ vi khuẩn vì có sử dụng nhiệt độ cao trong một thời gian ngắn. Các chế phẩm vi khuẩn dạng bột được tính toán trộn với nhau theo tỷ lệ phù hợp để đưa ra mật độ vi khuẩn cho hỗn hợp chế phẩm là 1x109 CFU/gam cho từng chủng vi khuẩn.

Bảng 3.17. Mật độ vi khuẩn sau khi nghiền và sấy

Stt

Chủng vi khuẩn	Mật độ vi khuẩn (CFU/gam)
1	Bacillus licheniformis B85	5,1 x 109
2	Pseudomonas stutzeri KL15	3,3 x 109
3	Rhodococcus rhodochrous T9	1,8 x 109

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 247 trang tài liệu này.

Theo tính toán lý thuyết, số lượng vi khuẩn Bacillus licheniformis B85 là 200 gam, Pseudomonas stutzeri KL15 là 300 gam và Rhodococcus rhodochrous T9 là 500 gam, trộn với nhau thành 1 kg sẽ cho mật độ 109 CFU/gam cho mỗi con vi khuẩn. Hỗn hợp chế phẩm vi sinh cũng được pha loãng theo các nồng độ và tiến hành đo OD600mm, từ đường cong tăng trưởng chuyển ra mật độ vi khuẩn là 1,2 x 109 CFU/gam. Hỗn hợp chế phẩm vi sinh tiếp tục được phối với chất phụ gia là dextrose, với tỷ lệ 150 gam hỗn hợp vi sinh với 850 gam dextrose, dùng phương pháp đo OD600nm, kết quả cho tổng mật độ vi khuẩn cho kết quả 1,5 x 108 CFU/gam, đem sử dụng cho nội dung 3.

Khảo sát điều kiện bảo quản chế phẩm vi sinh

Hình 3.30. Khảo sát điều kiện bảo quản của vi khuẩn B.licheniformis

Hình 3.30, cho thấy vi khuẩn B. licheniformis B85, khi bảo quản ở nhiệt độ 4 - 8oC

trong 180 ngày, mật độ vi khuẩn giảm nhẹ, ban đầu từ 5,1 x 109 CFU/g xuống còn 7 x108 CFU/g. Sau 360 ngày, mật độ vi khuẩn giảm còn 3,5 x 107 CFU/g. Ở nhiệt độ 28-32o C, mật số vi khuẩn B. licheniformics B85 sau 120 ngày giảm xuống còn 8,3.108 CFU/g, sau 270 ngày mật số vi khuẩn tiếp tục giảm xuống còn 107 CFU/g và sau 360 ngày, mật số vi khuẩn giảm xuống còn 3,5 x 106 CFU/g.

Hình 3.31. Khảo sát điều kiện bảo quản của vi khuẩn P. stutzeri KL15

Đối với vi khuẩn P. stutzeri KL15 ở hình 3.31, bảo quản ở mức nhiệt độ 4 - 8o C, 120 ngày thì mật độ vi khuẩn giảm xuống còn 108 CFU/g, sau 360 ngày mật độ vi khuẩn giảm xuống 106 CFU/g. Còn ở mức nhiệt độ 28-32oC, thì sau 90 ngày mật độ vi khuẩn của 2 chủng P. stutzeri KL15 giảm từ 109 CFU/g xuống còn 108 CFU/g và sau 360 ngày bảo quản, mật độ vi khuẩn giảm còn 105 CFU/g

Hình 3.32. Khảo sát điều kiện bảo quản của vi khuẩn R.rhodochrous T9

Đối với vi khuẩn R.rhodochrous T9 ở hình 3.32 cho thấy bảo quản ở mức nhiệt độ 4

– 8oC, 120 ngày thì mật độ vi khuẩn giảm xuống còn 108 CFU/gam, sau 360 ngày mật độ vi khuẩn giảm xuống 106 CFU/g. Còn ở mức nhiệt độ 28-32oC, thì sau 90 ngày mật độ vi khuẩn của R.rhodochrous T9 giảm từ 109 CFU/g xuống còn 108 CFU/g và sau 360 ngày bảo quản, mật độ vi khuẩn giảm còn 105 CFU/g.

Tóm lại, bảo quản ở điều kiện nhiệt độ từ 4 – 8oC, vi khuẩn được bảo quản tốt

hơn, mật độ vi khuẩn có giảm nhẹ sau 120 ngày bảo quản và sau 360 ngày, chủng vi khuẩn B. licheniformis B85 giảm còn 107 CFU/g, còn 2 chủng vi khuẩn còn lại là 106 CFU/g. Đối với bảo quản ở nhiệt độ 28-32oC, mật độ vi khuẩn giảm nhẹ sau 180 ngày và sau 360 ngày, mật số vi khuẩn B. licheniformis B85 giảm còn 106 CFU/g, hai chủng vi khuẩn giảm xuống còn 105 CFU/g. Đặc biệt, chủng vi khuẩn B. licheniformics B85 là nhóm vi khuẩn sinh bào tử nên sau thời gian bảo quản 360 ngày, có mật số vi khuẩn cao hơn so với 2 chủng vi khuẩn còn lại.

3.3. Nội dung 3: Đánh giá chuyển hóa nitơ của các chủng vi khuẩn trong nuôi trồng thủy sản.

3.3.1. Đánh giá sự chuyển hóa N của các chủng vi khuẩn trong nước nuôi tôm thẻ chân trắng (không có tôm) ở qui mô phòng thí nghiệm.

3.3.1.1. Đánh giá sự chuyển hóa N của các chủng vi khuẩn.

Theo dõi pH môi trường nước ao nuôi tôm thẻ chân trắng (không có tôm)

Nước nuôi tôm thẻ chân trắng được đem về từ Cần Giờ là 400L, chứa vào can 20L, có sụt khí oxy. Tiến hành bổ sung chế phẩm vi sinh theo các tỷ lệ 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4% và 0,5% với mật độ vi sinh vật là 108 CFU/gam.

Hình 3.33. Chỉ tiêu pH theo dõi hàng ngày

Theo dõi các chỉ tiêu pH, hàm lượng ammonia, nitrite, nitrate và tổng vi khuẩn hiếu khí, mật độ vi khuẩn AOB, NOB trong thời gian 5 ngày ở nhiệt độ phòng. Nhiệt độ nước trong can được đo vào các buổi sáng, do động từ 28 - 30oC và chiều trong khoàng 30 - 32oC. Tất cả các NT có bổ sung vi khuẩn sau 5 ngày đều có xu hướng pH giảm nhưng giảm rất ít, sau 5 ngày vẫn duy trì ở mức pH = 7,3 - 7,8.

Nhìn chung, pH ở Hình 3.33 dù có giảm nhưng vẫn duy trì ở mức độ cho phép