Sự Thay Đổi Mật Số L. Plantarum Val6 Dưới Điều Kiện Stress Ph Cùng Với Kiểm

Mật số (Log CFU/mL)

10 Không stress pH 3 pH 8

0 1 2 3 4 5 6 7

Thời gian (giờ)

Hình 3.11. Sự thay đổi mật số L. plantarum VAL6 dưới điều kiện stress pH Cùng với kiểm tra mật số, sự sống sót sau sấy đông khô của L. plantarum

VAL6 sau khi stress pH cũng được xác định. Tương tự như stress nhiệt, kết quả cho thấy stress pH cải thiện đáng kể tỷ lệ sống sót của vi khuẩn này trong quá trình sấy đông khô (Hình 3.12). Đối với vi khuẩn không được gây stress, tỷ lệ sống sót sau đông khô chỉ đạt khoảng 0,01%. Trái lại, với vi khuẩn được gây stress, tỷ lệ sống sót sau đông khô tăng dần theo thời gian và sau 7 giờ xử lý, tỷ lệ sống sót đạt khoảng 21 và 32% tương ứng stress ở pH 8 và pH 3.

Không stress pH 3 pH 8

Tỷ lệ sống sót (%)

0 1 2 3 4 5 6 7

Thời gian (giờ)

Hình 3.12. Tỷ lệ sống sót sau đông khô của L. plantarum VAL6 được gây stress pH Sự giảm pH nhất thời có thể làm tăng sản xuất EPS ở LAB [142]. Kết quả nghiên cứu hiện tại cho thấy stress ở pH thấp kích thích L. plantarum VAL6 tổng hợp EPS nhiều hơn. Điều này có thể là do EPS làm giảm tính nhạy cảm của tế bào đối với acid. Các nhóm chức mang điện tích âm được liên kết với EPS có thể hạn

chế sự tiếp cận của acid với tế bào vi khuẩn [194]. Hơn nữa, trong quá trình nuôi cấy và gây stress, H3PO4 được sử dụng để kiểm soát pH. Rất có thể sau khi được tổng hợp, EPS bị phosphoryl hóa bằng cách liên kết với các nhóm phosphate từ H3PO4 để tạo thành EPS-phosphate, kết quả tăng đáng kể khối lượng EPS thu được. Sự hiện diện của nhóm phosphate trong thành phần EPS cũng được báo cáo ở một vài nghiên cứu. EPS-b và EPS-r được sản xuất bởi L. plantarum EP56 có chứa nhóm phosphate và các nhóm phosphate này chi phối khả năng tích điện âm của EPS [195]. Đối với stress ở pH 8, mặc dù năng suất EPS thấp hơn so với xử lý ở pH 3 nhưng vẫn cao hơn so với điều kiện không gây stress. Kết quả này chỉ ra rằng L. plantarum VAL6 cũng tăng cường tổng hợp EPS để đối phó với ảnh hưởng của pH kiềm. Không có nhiều nghiên cứu báo cáo mối liên quan giữa pH kiềm và sản xuất EPS. Tuy nhiên, người ta giải thích rằng EPS liên quan đến sự hình thành khối huyền phù, bao gồm một hỗn hợp phức tạp của EPS, cung cấp khả năng bảo vệ vi khuẩn chống lại pH kiềm [147].

Trong nghiên cứu này, mối tương quan giữa sự tăng cường sản xuất EPS dưới các điều kiện stress pH và cải thiện khả năng sống sót sau sấy đông khô của L. plantarum VAL6 cũng đã được chứng minh. Sự kích thích sản xuất EPS giúp L. plantarum VAL6 kháng tốt hơn với điều kiện môi trường bất lợi, mà trong trường hợp này là sự mất nước do quá trình sấy đông khô. Mối tương quan giữa sản xuất EPS và tính kháng của LAB cũng được báo cáo ở một số nghiên cứu. Chủng L. mucosae DPC 6426 sản xuất EPS tăng 5 lần khả năng sống sót trong suốt 60 phút tiếp xúc với HCl so với chủng L. mucosae DPC 6420 không sản xuất EPS [196]. Hay chủng L. reuteri sản xuất nhiều EPS hơn cho thấy khả năng kháng với pH thấp tốt hơn [143].

3.2.3. Stress NaCl

Sự tăng cường sản xuất EPS không chỉ được tìm thấy khi xử lý stress nhiệt và pH, mà còn được ghi nhận khi xử lý gây stress NaCl ở nồng độ cao. Ảnh hưởng của stress NaCl đến khả năng sản xuất EPS của L. plantarum VAL6 được thực hiện ở nồng độ NaCl 10% và kết quả được thể hiện ở hình 3.13.

Hàm lượng EPS (g/L)

10,5

9,5

8,5

7,5

Không stress NaCl

0 1 2 3 4 5 6 7

Thời gian (giờ)

Hình 3.13. Năng suất EPS được sản xuất bởi L. plantarum VAL6 dưới điều kiện stress NaCl

Quan sát đồ thị hình 3.13 thấy rằng hàm lượng EPS được sản xuất bởi L. plantarum VAL6 dưới điều kiện stress NaCl cao hơn so với không gây stress. Năng suất EPS đạt được ở điều kiện gây stress NaCl dao động khoảng 10 g/L.

Khi quan sát sự thay đổi mật số trong quá trình stress NaCl (Hình 3.14), kết quả cho thấy mật số L. plantarum VAL6 gần như không thay đổi trong suốt thời gian gây stress được kiểm tra. Ngoài ra, kết quả phân tích thống kê cho thấy sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05) về mật số khi so sánh giữa hai điều kiện stress NaCl và không gây stress (Bảng 2.3.3 phụ lục trang 128). Kết quả này cho thấy L. plantarum VAL6 có khả năng chịu mặn rất tốt.

Không stress NaCl

Mật số (Log10 CFU/ml)

9,2

8,8

8,6

8,4

0 1 2 3 4 5 6 7

Thời gian (giờ)

Hình 3.14. Sự thay đổi mật số L. plantarum VAL6 dưới điều kiện stress NaCl

Khả năng sống sót sau sấy đông khô của L. plantarum VAL6 cũng được đánh giá (Hình 3.15). Dữ liệu cho thấy tỷ lệ sống sót sau đông khô của L. plantarum VAL6 đạt khoảng 5,5% sau 1 giờ gây stress và được duy trì ổn định trong suốt thời gian gây stress.

Không stress NaCl

Tỷ lệ sống sót (%)

0 1 2 3 4 5 6 7

Thời gian (giờ)

Hình 3.15. Tỷ lệ sống sót sau đông khô của L. plantarum VAL6 được stress NaCl Kết quả nghiên cứu cho thấy NaCl ở nồng độ cao có ảnh hưởng tích cực đến

quá trình tổng hợp EPS của L. plantarum VAL6. Sự tăng sản xuất EPS giúp vi khuẩn kháng lại tốt hơn với áp suất thẩm thấu do NaCl tạo ra [168] nhờ khả năng giữ nước cao của EPS [197]. Nhiều nghiên cứu trước đây cũng chứng minh NaCl giúp tăng cường sản xuất EPS ở LAB. Leuconostoc mesenteroides/pseudomesenteroides 406 đạt năng suất EPS tối đa dưới sự hiện diện của 5% NaCl [148]. Seesuriyachan và cs. (2012) báo cáo rằng sản xuất EPS tăng khi L. confusus được gây stress dưới nồng độ muối cao [149]. Một nghiên cứu khác cũng chứng minh rằng quá trình sinh tổng hợp EPS của L. confusus TISTR 1498 không phụ thuộc vào sinh khối và stress NaCl nồng độ cao có thể tăng cường sản xuất EPS ở vi khuẩn này [150]. Trái lại, bằng chứng ức chế sản xuất EPS bởi NaCl được báo cáo trong nuôi cấy L. helveticus ATCC 15807 [151]. Những bằng chứng này cho thấy đáp ứng tổng hợp EPS ở LAB dưới tác động của stress NaCl phụ thuộc vào loài khác nhau.

Phân tích mật số cho thấy L. plantarum VAL6 có khả năng chịu mặn rất tốt. Bằng chứng là mật số L. plantarum VAL6 khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05) so với đối chứng trong suốt thời gian gây stress được kiểm tra. Tương tự như L.plantarum VAL6, các chủng Lactobacilii chịu muối cao được phân lập từ phô

mai chiapas và chủng L. plantarum 299v thương mại có thể phát triển trong điều kiện tối ưu lên đến 6% NaCl [198].

3.2.4. Tăng nồng độ CO2

Tương tư như các điều kiện gây stress, khả năng sản xuất EPS của L. plantarum VAL6 được tăng cường dưới điều kiện nuôi cấy có bổ sung CO2 (Hình 3.16).

Hàm lượng EPS (g/L)

Không stress 4 8 24

Thời gian (giờ)

Hình 3.16. Năng suất EPS được sản xuất bởi L. plantarum VAL6 dưới điều kiện nuôi cấy tăng cường CO2. Các chữ cái khác nhau trên đầu cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p<0,05

Ở điều kiện sục CO2 4 giờ, hàm lượng EPS được ghi nhận là 14,85 g/L và tiếp tục tăng lên 16,78 g/L ở điều kiện sục CO2 8 giờ. Với điều kiện sục CO2 24 giờ, (tức là cung cấp CO2 liên tục) năng suất EPS đạt cao nhất (17,32 g/L), cao hơn 2,2 lần so với điều kiện nuôi cấy bình thường.

Không giống như những yếu tố gây stress, tăng nồng độ CO2 lại kích thích làm tăng mật số L. plantarum VAL6 (Hình 3.17). Dưới điều kiện tăng cường CO2, mật số L. plantarum VAL6 dao động trong khoảng 9,25 đến 9,4 Log CFU/mL. Trong khi đó, giá trị này chỉ đạt khoảng 9 Log CFU/mL ở điều kiện nuôi cấy bình thường. Tuy nhiên, kết quả không tìm thấy sự khác biệt (p>0,05) về mật số vi khuẩn ở hai điều kiện sục CO2 trong 8 giờ và 24 giờ (Bảng 2.4.2 phụ lục trang 129).

Mật số (Log CFU/mL)

10,0

9,5

9,0

8,5

8,0

7,5

7,0

Không stress

4 8 24

Thời gian (giờ)

Hình 3.17. Sự thay đổi mật số L. plantarum VAL6 dưới điều kiện nuôi cấy tăng cường CO2. Các chữ cái khác nhau trên đầu cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p<0,05

Sự sống sót sau sấy đông khô của L. plantarum VAL6 được xử lý CO2 cũng tăng dần theo thời gian sục khí. Ở điều kiện 4 giờ sục CO2, tỷ lệ sống sót là 11,57%. Tỷ lệ này tiếp tục tăng lên 18,48% ở điều kiện sục CO2 8 giờ và đạt 25,19% ở điều kiện sục CO2 24 giờ (Hình 3.18).

Tỷ lệ sống sót (%)

Không stress

4 8 24

Thời gian (giờ)

Hình 3.18. Tỷ lệ sống sót sau đông khô của L. plantarum VAL6 được nuôi cấy tăng cường CO2. Các chữ cái khác nhau trên đầu cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p<0,05

CO2 không chỉ duy trì điều kiện sinh trưởng yếm khí mà còn kích thích tăng cường tổng hợp EPS ở LAB [160]. Giống như nghiên cứu này, nồng độ CO2 được chứng minh có ảnh hưởng tích cực đến khả năng tổng hợp EPS của B. longum

JBL05 và năng suất EPS cuối cùng tăng tỷ lệ thuận nồng độ CO2 từ 0 đến 20% [154]. Tương tự, L. casei được bao quanh bởi một lớp polymer bao gồm hợp phần của EPS khi nuôi cấy trong môi trường giàu CO2 [155].

Nồng độ CO2 cao có thể làm thay đổi hình thái và tính chất của màng tế bào [159]. Các nguồn carbon vô cơ như HCO3- hoặc CO2 có liên quan đến các đặc điểm sinh lý và kích thích sự phát triển của L. plantarum [199]. Giống như nghiên cứu hiện tại, tốc độ phát triển của L. plantarum WCFS1 theo thời gian có thể được kích thích bằng cách tăng mức độ cung cấp CO2 [200]. Thực tế nghiên cứu này cũng đã chứng minh L. plantarum VAL6 có thể phát triển tốt hơn khi tăng thời gian sục khí CO2. Nồng độ CO2 có thể khuếch tán vào carboxysome của tế bào. Mức độ cao của CO2 trong carboxysome cho phép enzyme Rubisco chuyển nó thành sinh khối hiệu quả hơn [201].

CO2 thường được sử dụng để khử oxy môi trường trước khi nuôi cấy vi khuẩn probiotic [202]. Một số nghiên cứu đã chứng minh rằng CO2 có thể điều hòa sinh lý và chuyển hóa năng lượng của tế bào bằng cách điều tiết hoạt động của các enzyme liên quan đến quá trình glycolysis. Ngoài ra, các enzyme phosphoenolpyruvate carboxylase và carbamoyl-phosphate synthase trên vi khuẩn probiotic có vai trò xúc tác cố định CO2 để sinh tổng hợp aspartate, arginine và uracil [159]. Cùng với khả năng bảo vệ do EPS tạo ra, các yếu tố này cũng có thể giải thích cho sự cải thiện khả năng sống sót sau đông khô của L. plantarum VAL6.

3.2.5. So sánh ảnh hưởng của các điều kiện stress môi trường khác nhau lên khả năng sản xuất EPS, hoạt tính sinh học của EPS thu được

Sự sống sót và phát triển của vi sinh vật phụ thuộc vào khả năng cảm nhận và phản ứng của chúng với các điều kiện môi trường như nhiệt độ, pH, khả năng cung cấp chất dinh dưỡng và mật số tế bào [203]. Trong nghiên cứu này, kết quả đã chứng minh vi khuẩn L. plantarum VAL6 phản ứng với các điều kiện stress môi trường bằng cách tăng cường sinh tổng hợp EPS. Các điều kiện stress khác nhau có thể kích thích tổng hợp EPS ở các mức độ khác nhau (Bảng 3.2).

Theo dữ liệu bảng 3.2, các điều kiện stress ở pH 3, pH 8 và tăng nồng độ CO2 giúp tăng cường mạnh mẽ khả năng sinh tổng hợp EPS ở L. plantarum VAL6. Năng suất EPS đạt cao nhất (50,44 g/L) trong trường hợp stress ở pH 3. Năng suất EPS đạt 17,32 và 16,50 g/L tương ứng với điều kiện nuôi cấy tăng cường CO2 và

stress pH 8, nhưng khác biệt này không có ý nghĩa thống kê (p> 0,05). Các điều kiện stress NaCl, ở 42 và 47 oC mặc dù thu được năng suất EPS thấp hơn, dao động trong khoảng 10-13,5 g/L, nhưng vẫn cao hơn có ý nghĩa (p<0,05) so với đối chứng không gây stress (chỉ khoảng 8 g/L).

Bảng 3.2. Ảnh hưởng của các điều kiện stress môi trường khác nhau lên năng suất EPS, mật số và tỷ lệ sống sót sau sấy đông khô của L. plantarum VAL6

Điều kiện xử lý gây stress*

Mật số còn lại sau khi gây stress (Log CFU/mL)	Hàm lượng EPS (g/L)	Tỷ lệ sống sót sau sấy đông khô (%)
Không stress	9,09  0,08a	8,08  0,10e	0,02  0,00f
42 oC	9,07  0,04a	13,27  0,26c	6,67  0,70e
47 oC	9,01  0,11a	13,48  0,16c	8,84  0,74d
pH 3	6,24  0,05c	50,44  2,14a	30,72  2,58a
pH 8	9,04  0,03a	16,50  0,28b	22,79  0,79c
NaCl	9,06  0,05a	9,92  0,26d	5,79  0,41e
CO2	9,40  0,06b	17,32  0,29b	25,19  0,59b