Tỷ Lệ Các Monosaccharide: (A) Mannose; (B) Glucose; (C) Galactose; (D) Arabinose; (E) Rhamnose

gây sốc

cao hơn 6,6 lần so với đối chứng. Đối với xử lý pH 8, tỷ lệ rhamnose dao động khoảng 2% và không được phát hiện khi thời gian gây stress lớn hơn 3 giờ.

(A)

Không stress

pH 3 pH 8

Tỷ lệ mannose (%)

(B)

gây sốc

Không stress

pH 3

pH 8

Tỷ lệ glucose (%)

(C)

Không stress

pH 3 pH 8

Tỷ lệ galactose (%)

0 1 3 5 7

gây sốc

Thời gian (giờ)

0 1 3 5 7

Thời gian (giờ)

Không stress

pH 3 pH 8

(D)

Tỷ lệ arabinose (%)

0 1 3 5 7

gây sốc

Thời gian (giờ)

0 1 3 5 7

Thời gian (giờ)

Tỷ lệ rhamnose (%)

(E)

gây sốc

6 Không stress

pH 3 pH 8

0,8

Tỷ lệ xylose (%)

0,6

0,4

0,2

0,0

(F)

gây sốc

Không stress

pH 3 pH 8

0 1 3 5 7

Thời gian (giờ)

0 1 3 5 7

Thời gian (giờ)

Hình 3.23. Tỷ lệ các monosaccharide: (A) mannose; (B) glucose; (C) galactose; (D) arabinose; (E) rhamnose và (F) xylose trong EPS được sản xuất bởi L. plantarum VAL6 dưới điều kiện stress pH

Arabinose không được phát hiện trong thành phần EPS ở điều kiện nuôi cấy bình thường, nhưng nó được tìm thấy ở các điều kiện stress pH được thử nghiệm (Hình 3.23D). Ngoài ra, ở xử lý stress ở pH 3 có hàm lượng arabinose cao hơn so với ở pH 8. Tỷ lệ arabinose cao nhất khi L. plantarum VAL6 được gây stress với pH 3 trong 3 giờ, đạt cao nhất 4,25% so với chỉ khoảng 1% trong điều kiện stress

pH 8. Ngược lại, xylose được tìm thấy trong thành phần EPS của các đối chứng mặc dù với lượng khá nhỏ, nhưng nó không được phát hiện trong EPS dưới các điều kiện stress pH được kiểm tra (Hình 3.23F).

3.3.3. Stress NaCl

NaCl với nồng độ cao có thể gây stress thẩm thấu và là một trong những yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của LAB. Để đối phó với stress thẩm thấu, LAB tăng cường tổng hợp EPS nhằm ngăn chặn sự mất nước [222]. Ngoài ra, thành phần EPS có thể thay đổi dưới tác động của stress thẩm thấu [168]. Do đó, nghiên cứu đã chứng minh ảnh hưởng của stress NaCl lên thành phần monosaccharide của EPS được sản xuất bởi L. plantarum VAL6 bằng cách bổ sung NaCl ở nồng độ 10%.

(A)

Không stress

NaCl

(B)

gây sốc

Tỷ lệ mannose (%)

Tỷ lệ glucose (%)

90 20 Không stress

85 15

70 5

65 0

NaCl

(C)

Tỷ lệ galactose (%)

(E)

0 1 3 5 7

gây sốc

Không stress

NaCl

Thời gian (giờ)

0 1 3 5 7

Thời gian (giờ)

(D)

Tỷ lệ arabinose (%)

gây sốc

Không stress

NaCl

Không stress

NaCl

Tỷ lệ xylose (%)

(F)

0 1 3 5 7

gây sốc

Không stress

NaCl

Thời gian (giờ)

0 1 3 5 7

Thời gian (giờ)

gây sốc

Tỷ lệ rhamnose (%)

1,5

0,8

0,6

1 0,4

0,5 0,2

0 1 3 5 7

Thời gian (giờ)

0,0

0 1 3 5 7

Thời gian (giờ)

Hình 3.24. Tỷ lệ các monosaccharide: (A) mannose; (B) glucose; (C) galactose; (D) arabinose; (E) rhamnose và (F) xylose trong EPS được sản xuất bởi L. plantarum VAL6 dưới điều kiện stress NaCl

Kết quả nghiên cứu cho thấy có sự thay đổi thành phần các đường trong EPS theo một xu hướng nhất định như là phản ứng chung của L. plantarum VAL6 trong sự đáp ứng với các yếu tố stress môi trường. Dưới sự tác động của stress NaCl, tỷ lệ mannose dao động trong khoảng 81% suốt thời gian gây stress và thấp hơn so với đối chứng (84,33%) (Hình 3.24A và Bảng 3.3.1 phụ lục trang 132). Hàm lượng glucose tăng nhẹ từ 13,88% sau 1 giờ lên mức tối đa, xấp xỉ 14,7% sau 3 giờ và sau đó giảm dần theo thời gian gây stress (Hình 3.24B). Kết quả cũng ghi nhận tỷ lệ galactose trong thành phần monosaccharide của EPS tăng nhẹ và dao động từ 2,7- 3% (Hình 3.24C). Arabinose xuất hiện khi L. plantarum VAL6 được gây stress NaCl và đạt giá trị cao nhất khoảng 1% sau 5 giờ xử lý, nhưng ở 7 giờ xử lý thì không phát hiện loại đường này (Hình 3.24D). Rhamnose thay đổi không đáng kể trong suốt quá trình gây stress (Hình 3.24E). Trong khi đó, xylose không được phát hiện trong thành phần EPS dưới điều kiện stress NaCl (Hình 3.24F).

3.3.4. Tăng nồng độ CO2

Để xác định rõ hơn liệu những thay đổi trong thành phần monosaccharide của EPS được sản xuất bởi L. plantarum VAL6 dưới ảnh hường của nhiệt độ, pH và NaCl có phải là phản ứng chung của vi khuẩn này với các yếu tố môi trường hay không, nghiên cứu đã phân tích thành phần EPS dưới điều kiện nuôi cấy tăng cường CO2. Nhìn chung sau khi xử lý CO2, những thay đổi trong thành phần monosaccharide của EPS bao gồm mannose, glucose, galactose và rhamnose là mô hình tương tự với những trường hợp gây stress khác (Hình 3.25).

Cụ thể, hàm lượng mannose của EPS trong điều kiện tăng nồng độ CO2 (dao động khoảng 71 đến 76%) thấp hơn đáng kể so với đối chứng (khoảng 83,5%) (Hình 3.25A). Ngược lại, tỷ lệ glucose trong EPS dưới điều kiện tăng nồng độ CO2 cao hơn so với đối chứng, đặc biệt là ở nghiệm thức xử lý CO2 24 giờ (Hình 3.25B). Tương tự như glucose, L. plantarum VAL6 sản xuất EPS chứa nhiều galactose và rhamnose hơn để phản ứng với sự tăng nồng độ CO2. Tỷ lệ galactose cao hơn 2 lần và rhamnose cao hơn 8,2 lần so với đối chứng (Hình 3.25C & D).

Đáng chú ý hơn, kết quả cho thấy trong khi hàm lượng xylose được ghi nhận ở mức 0,61% ở điều kiện nuôi cấy bình thường, thì loại đường này không được phát hiện dưới điều kiện nuôi cấy tăng cường CO2 (dữ liệu không được hiển thị). Điều này cho thấy CO2 cũng có thể kích hoạt một số cơ chế cụ thể trong con đường sinh

tổng hợp EPS, cuối cùng dẫn đến sự tăng cường hoặc ức chế sự hình thành của một số loại đường cụ thể trong thành phần EPS.

Tỷ lệ mannose (%)

100

Không 4 8 24

(A)

(B)

Tỷ lệ glucose (%)

Không 4 8 24

gây sốc

stress

(C)

Tỷ lệ galactose (%)

Thời gian (giờ)

stress

gây sốc

Tỷ lệ rhamnose (%)

Thời gian (giờ)

(D)

gây sốc

Không 4 8 24

gây sốc

stress

Thời gian (giờ)

stress

Thời gian (giờ)

Hình 3.25. Tỷ lệ các monosaccharide: (A) mannose; (B) glucose; (C) galactose và

(D) rhamnose trong EPS được sản xuất bởi L. plantarum VAL6 dưới điều kiện nuôi cấy tăng cường CO2

3.3.5. Đánh giá ảnh hưởng của yếu tố môi trường lên thành phần monosaccharide của EPS

Việc xác định thành phần monosaccharide là cần thiết để hiểu rõ hơn vai trò bảo vệ của EPS đối với vi khuẩn bởi vì thành phần và tỷ lệ các đường trong EPS có ảnh hưởng đến khả năng chịu stress của LAB [168]. Theo kết quả phân tích thành phần monosaccharide, EPS được sản xuất bởi L. plantarum VAL6 là HePS bao gồm chủ yếu các loại đường mannose (83,44%), glucose (14,01%) và galactose (1,15%). Một tỷ lệ tương tự của các loại đường này cũng được ghi nhận trong EPS được sản xuất bởi L. plantarum 70810 (Mannose 78,76%; glucose 18,21% và galactose 3,03%) [68]. Mannose, glucose và galactose (theo tỷ lệ mol 12,94 : 7,26 : 3,31) cũng là các loại đường chính trong EPS của L. plantarum KX041 [8].

Sau khi được gây stress với các thách thức môi trường như nhiệt độ cao, pH acid và kiềm, NaCl và tăng nồng độ CO2, tỷ lệ các loại đường này đã thay đổi khác nhau. EPS thu được dưới các điều kiện stress môi trường có thành phần monosaccharide thay đổi bao gồm mannose (69,13-80,34%), glucose (12,55- 23,60%) và galactose (1,87-6,50%). Ở LAB, có rất ít nghiên cứu báo cáo ảnh hưởng của stress môi trường lên thành phần monosaccharide của EPS, nhưng một nghiên cứu trên L. delbrueckii subsp. bulgaricus CNRZ 1187 và L. delbrueckii subsp. bulgaricus CNRZ 416 cho thấy có sự thay đổi trong thành phần monosaccharide khi các vi khuẩn này được nuôi cấy ở hai điều kiện pH được kiểm soát và không kiểm soát [12].

EPS do L. plantarum sản xuất được báo cáo là có các hoạt tính sinh học đặc trưng như tác dụng giảm cholesterol, chống oxy hóa [223], hoạt động chống khối u

[89] và chống virus [90]. Ngoài ra, L. plantarum sản xuất EPS với sự khác biệt về hàm lượng của các loại đường phổ biến và đường hiếm tùy thuộc vào nền tảng di truyền và điều kiện môi trường nuôi cấy hoặc cả hai [115]. Thực tế trên L. plantarum VAL6 đã chứng minh việc điều khiển sinh tổng hợp EPS bằng cách áp dụng các thách thức môi trường là hoàn toàn khả thi. Kết quả nghiên cứu cho thấy stress môi trường có thể cải thiện đặc trưng của EPS.

Dưới tác động của các điều kiện gây stress được kiểm tra, hàm lượng galactose trong EPS tăng mạnh, đặc biệt trong điều kiện stress ở pH 8 và ở 42 oC trong 5 giờ. Hàm lượng galactose tăng giúp cải thiện hoạt tính sinh học của EPS như hoạt tính chống viêm [7]. Ngoài ra, các loại đường hiếm như rhamnose và fucose được tìm thấy trong thành phần monosaccharide của EPS dưới điều kiện stress nhiệt. Các EPS giàu fucose và rhamnose thể hiện hoạt tính sinh học thú vị khiến chúng có tiềm năng cho các ứng dụng khác nhau, đặc biệt trong các sản phẩm giá trị gia tăng như mỹ phẩm, dược phẩm, y tế và các sản phẩm thực phẩm chức năng [224,225]. Người ta cũng quan tâm đến việc sản xuất EPS giàu fucose và rhamnose bởi vì nó có liên quan đến hoạt động chống lão hóa [226].

Một phát hiện thú vị khác là sự hiện diện của arabinose trong EPS được sản xuất bởi L. plantarum VAL6 dưới tác động của stress môi trường trong khi nó không được phát hiện ở điều kiện nuôi cấy bình thường. Ngoài arabinose, stress môi trường cũng làm thay đổi các thành phần đường khác như làm tăng hàm lượng

rhamnose cũng như sự không phát hiện xylose ở các trường hợp xử lý pH, NaCl và tăng nồng độ CO2. Điều này cho thấy arabinose và rhamnose có liên quan đến khả năng kháng stress của vi khuẩn. Một nghiên cứu trước đây cũng đã chứng minh hàm lượng arabinose trong EPS đóng một vai trò quan trọng trong việc tập hợp tế bào để đối phó với các điều kiện môi trường thù địch [227]. Tương tự, sự tăng hàm lượng rhamnose được chứng minh có liên quan đến tính kháng stress khô hạn, stress nhiệt và NaCl [228]. Các kết quả này chỉ ra rằng sự khác biệt về thành phần monosaccharide của EPS có thể ảnh hưởng đến khả năng chịu stress của vi khuẩn.

Nói tóm lại, kết quả nghiên cứu đã chứng minh thành phần monosaccharide trong EPS thay đổi đáng kể dưới ảnh hưởng của yếu tố môi trường. Điều này gợi ra tiềm năng áp dụng stress môi trường để điều khiển tổng hợp EPS cho các yêu cầu cụ thể. Tuy nhiên, hoạt tính sinh học của EPS được sản xuất dưới các điều kiện stress môi trường cần được chứng minh xa hơn để xác nhận tiềm năng ứng dụng của chúng.

3.4. Ảnh hưởng của stress môi trường lên sự biểu hiện mRNA của các gen liên quan tổng hợp EPS

3.4.1. Stress nhiệt

Tác động của stress nhiệt độ cao (42 và 47 oC) lên sự biểu hiện của các gen liên quan đến quá trình sinh tổng hợp EPS ở L. plantarum VAL6 được đánh giá thông qua xác định mRNA (Hình 3.26). Quan sát ảnh chụp điện di hình 3.26 thấy sự xuất hiện các band màu sáng chứng tỏ có sự biểu hiện của các gen mục tiêu được kiểm tra.

Qua phân tích và so sánh mức độ biểu hiện tương đối của các gen glmU, pgmB1, cps4E, cps4F, cps4J, và cps4H ở L. plantarum VAL6 được gây stress và đối chứng không gây stress (37 oC), kết quả cho thấy mức độ biểu hiện của các gen cps4E, cps4F và cps4J được điều chỉnh tăng mạnh (p <0,05, Bảng 4.1.5, 4.1.7 và

4.1.9 phụ lục trang 134) dưới điều kiện stress nhiệt (Hình 3.27). Ngoài ra, thời gian tiếp xúc với nhiệt cũng ảnh hưởng đáng kể đến sự điều hòa biểu hiện của các gen này.

Gen

M	N	0	1	3	5	7	0	1	3	5	7	0	1	3	5	7
glmU
pgmB1
cps4E
cps4F
cps4J
cps4H
			Không gây stress							42 oC				47 oC