3.4.2. Stress pH
Để tồn tại và thích nghi với stress acid hoặc kiềm, vi sinh vật phản ứng bằng cách phát triển các cơ chế sinh lý và phân tử phức tạp khác nhau [229]. Do đó, để làm rõ phản ứng của L. plantarum VAL6 với các stress acid và kiềm trong việc đáp ứng sinh tổng hợp EPS, nghiên cứu đã phân tích biểu hiện mRNA tương đối của các gen liên quan dưới các điều kiện gây stress này (Hình 3.28).
Gen | M | N | 0 | 1 | 3 | 5 | 7 | 0 | 1 | 3 | 5 | 7 | 0 | 1 | 3 | 5 | 7 |
glmU |
|
|
| ||||||||||||||
pgmB1 |
|
|
| ||||||||||||||
cps4E |
|
|
| ||||||||||||||
cps4F |
|
|
| ||||||||||||||
cps4J |
|
|
| ||||||||||||||
cps4H |
|
|
| ||||||||||||||
Không gây stress | pH 3 | pH 8 | |||||||||||||||
Có thể bạn quan tâm!
-
Sự Thay Đổi Mật Số L. Plantarum Val6 Dưới Điều Kiện Stress Ph Cùng Với Kiểm Tra Mật Số, Sự Sống Sót Sau Sấy Đông Khô Của L. Plantarum -
Mật Số Vi Khuẩn Probiotic Được Nuôi Cấy Trong Môi Trường Mrs Không Đường Có Bổ Sung Eps Của L. Plantarum Val6 -
Tỷ Lệ Các Monosaccharide: (A) Mannose; (B) Glucose; (C) Galactose; (D) Arabinose; (E) Rhamnose Và (F) Xylose Trong Eps Được Sản Xuất Bởi L. Plantarum Val6 Dưới Điều -
Thay Đổi Biểu Hiện Mrna Của Các Gen Liên Quan Tổng Hợp Eps Dưới Tác Động Của Các Thách Thức Môi Trường So Với Điều Kiện Không Gây Stress -
Nghiên cứu các điều kiện stress môi trường đến khả năng tổng hợp exopolysaccharides của vi khuẩn Lactobacillus plantarum - 15 -
Nghiên cứu các điều kiện stress môi trường đến khả năng tổng hợp exopolysaccharides của vi khuẩn Lactobacillus plantarum - 16
Xem toàn bộ 169 trang tài liệu này.
Hình 3.28. Điện di trên gel agarose sản phẩm PCR mRNA của các gen liên quan tổng hợp EPS dưới điều kiện stress pH
Kết quả phân tích cho thấy sự biểu hiện của gen cps4H được điều chỉnh tăng mạnh khi L. plantarum VAL6 tiếp xúc với stress acid ở pH 3. Trong khi đó, stress ở pH 8 lại kích thích sự biểu hiện của hai gen cps4E và cps4F (Hình 3.29, Bảng 4.2.5 và 4.2.7 phụ lục trang 135-136). Cụ thể dưới tác động của stress pH 3, tìm thấy sự gia tăng đáng kể mức độ biểu hiện của cps4H (~ 4 lần) (Hình 3.29F), nhưng mức độ biểu hiện của các gen glmU, pgmB1 và cps4E được điều chỉnh giảm (Hình 3.29A, B & E).
gây sốc
(A) Không stress
Biểu hiện mRNA tương đối (lần)
1,5
pH 3 pH 8
(B) Không pH 3 pH 8
gây sốc
stress
1,5
Biểu hiện mRNA tương đối (lần)
1 1
0,5 0,5
0
0 1 3 5 7
Thời gian (giờ)
0
0 1 3 5 7
Thời gian (giờ)
gây sốc
(C) Không stress
Biểu hiện mRNA tương đối (lần)
5
4
3
2
1
0
pH 3 pH 8
(D) Không stress
gây sốc
Biểu hiện mRNA tương đối (lần)
4
3
2
1
0
pH 3 pH 8
0 1 3 5 7
Thời gian (giờ)
0 1 3 5 7
Thời gian (giờ)
gây sốc
(E) Không stress
Biểu hiện mRNA tương đối (lần)
1,5
1
0,5
0
pH 3 pH 8
(F) Không stress
gây sốc
Biểu hiện mRNA tương đối (lần)
5
4
3
2
1
0
pH 3 pH 8
0 1 3 5 7
Thời gian (giờ)
0 1 3 5 7
Thời gian (giờ)
Hình 3.29. Biểu hiện mRNA của các gen liên quan tổng hợp EPS dưới điều kiện stress pH: (A) glmU, (B) pgmB1, (C) cps4E, (D) cps4F, (E) cps4J, (F) cps4H
Trong trường hợp của stress pH 8, mức độ biểu hiện của gen cps4E được điều chỉnh tăng gấp 3,2 lần sau 1 giờ xử lý, và tiếp tục tăng lên 3,9 lần sau 7 giờ xử
lý (Hình 3.29C). Giống như sự thay đổi của cps4E, mức độ biểu hiện của cps4F cũng được điều chỉnh tăng đều đặn từ 2 lên 3,3 lần trong suốt thời gian gây stress được kiểm tra từ 1 đến 7 giờ (Hình 3.29D).
3.4.3. Stress NaCl
Thay đổi trong biểu hiện gen dưới tác động của stress thẩm thấu cũng là để điều chỉnh sự trao đổi chất của tế bào [230]. Vì vậy, nghiên cứu đã đánh giá ảnh hưởng của stress thẩm thấu lên sự biểu hiện của các gen liên quan đến tổng hợp EPS ở L. plantarum VAL6 bằng cách bổ sung NaCl ở nồng độ 10% (Hình 3.30).
Gen | M | N | 0 | 1 | 3 | 5 | 7 | 0 | 1 | 3 | 5 | 7 |
glmU |
|
| ||||||||||
pgmB1 |
|
| ||||||||||
cps4E |
|
| ||||||||||
cps4F |
|
| ||||||||||
cps4J |
| |||||||||||
cps4H |
|
| ||||||||||
Không gây stress | NaCl | |||||||||||
Hình 3.30. Điện di trên gel agarose sản phẩm PCR mRNA của các gen liên quan tổng hợp EPS dưới điều kiện stress NaCl
Kết quả phân tích Real-time qPCR cho thấy stress NaCl có thể kích hoạt sự
biểu hiện của các gen cps4E và cps4F ở một giờ xử lý. Hơn nữa, sự biểu hiện của các gen được kiểm tra bị ảnh hưởng mạnh bởi thời gian gây stress (Hình 3.31).
gây sốc
stress
(A)
Không NaCl
Biểu hiện mRNA tương đối (lần)
1,5
(B)
gây sốc
Không stress
Biểu hiện mRNA tương đối (lần)
1,5
NaCl
1 1
0,5 0,5
0
0 1 3 5 7
Thời gian (giờ)
0
0 1 3 5 7
Thời gian (giờ)
gây sốc
(C)
Không stress
Biểu hiện mRNA tương đối (lần)
1,5
NaCl
(D)
gây sốc
Không stress
Biểu hiện mRNA tương đối (lần)
1,5
NaCl
1 1
0,5 0,5
0
0 1 3 5 7
Thời gian (giờ)
0
0 1 3 5 7
Thời gian (giờ)
(E)
gây sốc
Không stress
Biểu hiện mRNA tương đối (lần)
1,5
NaCl
(F)
gây sốc
Không stress
Biểu hiện mRNA tương đối (lần)
1,5
NaCl
1 1
0,5 0,5
0
0 1 3 5 7
Thời gian (giờ)
0
0 1 3 5 7
Thời gian (giờ)
Hình 3.31. Biểu hiện mRNA của các gen liên quan tổng hợp EPS dưới điều kiện stress NaCl: (A) glmU, (B) pgmB1, (C) cps4E, (D) cps4F, (E) cps4J, (F) cps4H
Sự biểu hiện của cps4E được điều chỉnh tăng 1,27 lần sau 1 giờ tiếp xúc với stress NaCl ở nồng độ 10%. Tuy nhiên, khi kéo dài thời gian xử lý thì mức độ biểu hiện lại giảm. Cụ thể, mức độ biểu hiện giảm về giá trị ban đầu (1 lần) sau 7 giờ xử lý (Hình 3.31C).
Một quá trình điều hoà tương tự cũng được phát hiện ở cps4F. Sự điều chỉnh tăng trong biểu hiện của cps4F được ghi nhận sau 1 giờ tiếp xúc với stress NaCl (1,23 lần). Giá trị này sau đó giảm xuống còn 1,02 lần sau 7 giờ xử lý (Hình 3.31D).
Đối với các gen glmU, pgmB1, cps4J và cps4H, sự biểu hiện được tìm thấy giảm có ý nghĩa (p<0,05) khi thời gian gây stress kéo dài (Bảng 4.3.2, 4.3.4, 4.3.10 và 4.3.12 phụ lục trang 136-138). Sau 7 giờ gây stress, mức độ biểu hiện của các gen này dao động từ 0,3 đến 0,6 lần.
3.4.4. Tăng nồng độ CO2
Không giống như các xử lý gây stress, nuôi cấy tăng cường CO2 kích thích sự biểu hiện của tất cả các gen được kiểm tra từ 1,2 đến 2,5 lần (Hình 3.32 và Hình 3.33).
Gen | M | N | 0 | 4 | 8 | 24 | M | N | 0 | 4 | 8 | 24 | |
glmU |
| pgmB1 |
| ||||||||||
cps4E |
| cps4F |
| ||||||||||
cps4J |
| cps4H |
| ||||||||||
Hình 3.32. Điện di trên gel agarose sản phẩm PCR mRNA của các gen liên quan tổng hợp EPS dưới điều kiện nuôi cấy tăng cường CO2
Ngoại trừ cps4E có mức độ biểu hiện cao nhất là 1,81 lần khi xử lý CO2 trong 8 giờ, nhưng sự biểu hiện của nó giảm còn 1,5 lần khi xử lý CO2 trong 24 giờ (Hình 3.33C). Sự biểu hiện của các gen còn lại được ghi nhận tăng tỷ lệ thuận với thời gian xử lý CO2.
(A)
Biểu hiện mRNA tương đối (lần)
2,5
2
1,5
1
0,5
0
gây sốc
Không 4 8 24
(B)
Biểu hiện mRNA tương đối (lần)
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
gây sốc
Không 4 8 24
(C)
Biểu hiện mRNA
tương đối (lần)
2,5
2
1,5
1
0,5
gây sốc
0
stress
Thời gian (giờ)
(D)
Biểu hiện mRNA tương đối (lần)
2
1,5
1
0,5
0
stress
Thời gian (giờ)
gây sốc
Không 4 8 24
Không 4 8 24
(E)
Biểu hiện mRNA tương đối (lần)
2
1,5
1
0,5
0
stress
Thời gian (giờ)
(F)
Biểu hiện mRNA tương đối (lần)
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
stress
Thời gian (giờ)
gây sốc
gây sốc
Không 4 8 24 Không 4 8 24
stress
Thời gian (giờ)
stress
Thời gian (giờ)
Hình 3.33. Biểu hiện mRNA của các gen liên quan tổng hợp EPS dưới điều kiện tăng nồng độ CO2: (A) glmU, (B) pgmB1, (C) cps4E, (D) cps4F, (E) cps4J,
(F) cps4H
3.4.5. Đánh giá ảnh hưởng của yếu tố môi trường lên sự biểu hiện mRNA của các gen liên quan tổng hợp EPS
Những thay đổi trong điều kiện môi trường có thể làm thay đổi sản xuất EPS và tổng hợp loại EPS mới ở vi khuẩn. Ngoài ra, sự biểu hiện quá mức của một gen eps nhất định có thể ảnh hưởng đến năng suất và làm tăng hoặc giảm hàm lượng của
một đường cụ thể trong thành phần EPS [231]. Do đó, dựa trên mức độ biểu hiện của các gen có liên quan, có thể giải thích cho những thay đổi trong năng suất và thành phần monosaccharide của các EPS thu được.
Trong nghiên cứu này, sự biểu hiện của gen glmU được điều chỉnh tăng trong điều kiện nuôi cấy tăng cường CO2 và điều chỉnh giảm khi L. plantarum VAL6 tiếp xúc với stress pH 3 và NaCl ở nồng độ cao. Kết quả này giống với một nghiên cứu trước đây trên Lactobacillus vini, sự biểu hiện của glmU cũng được điều chỉnh giảm trong dưới tác động của stress acid [232]. Các enzyme được mã hoá bởi glmU bao gồm glucosamine-1-phosphate N-acetyltransferase (xúc tác chuyển đổi glucosamine-1-phosphate thành N-acetylglucosamine-1- phosphate) và N- acetylglucosamine-1-phosphate uridyltransferase (xúc tác sự hình thành UDP-N- acetyl-D-glucosamine từ N-acetylglucosamine-1- phosphate) [233]. UDP-N-acetyl- D-glucosamine là một trong những tiền chất thiết yếu tham gia vào cấu trúc lớp PG của vách tế bào [25] và sự tổng hợp các đơn vị lặp lại của EPS [115]. Từ đó cho thấy sự tăng nồng độ CO2 trong môi trường nuôi cấy kích thích sự biểu hiện gen glmU ở L. plantarum VAL6, kết quả có thể dẫn đến gia tăng tổng hợp thành phần chính của vách tế bào và hàm lượng N-acetyl-D-glucosamine trong EPS. Tuy nhiên, nghiên cứu không có phân tích thành phần N-acetyl-D-glucosamine để làm chắc chắn hơn cho giả thuyết này.
Gen pgmB1 mã hoá cho β-phosphoglucomutase, một enzyme xúc tác chuyển đổi qua lại giữa D-glucose 6-phosphate và D-glucose 1-phosphate với sự hình thành β-D-glucose 1,6-(bis) phosphate như một hợp chất trung gian. pgmB1 có vai trò quan trọng trong quá trình tổng hợp UDP-glucose [234]. Do đó, sự biểu hiện quá mức của pgmB1 có thể làm tăng hàm lượng glucose trong thành phần EPS. Tương tự như glmU, sự biểu hiện của pgmB1 tăng khi L. plantarum VAL6 được nuôi cấy trong điều kiện tăng cường CO2 nhưng giảm khi vi khuẩn tiếp xúc với stress ở pH 3 và NaCl. Kết quả này không tương đồng với nghiên cứu của Li và cs. (2019) trên L. plantarum FS5-5. Theo nghiên cứu của Li thì sự biểu hiện của pgmB tăng dưới tác động của nồng độ muối cao (> 6%) nhưng không thay đổi ở nồng độ muối thấp hơn [234]. Khác biệt trong phương pháp gây stress có thể là nguyên nhân cho sự không giống nhau này. Trong khi Li và cs. (2019) bổ sung NaCl ngay khi chủng giống thì
nghiên cứu hiện tại thực hiện gây stress khi bắt đầu của pha ổn định (sau 24 giờ chủng giống).
Trong số các gen được điều chỉnh tăng, cps4E và cps4F mã hóa cho các glycosyltransferase vận chuyển nucleotide-đường đến C55-P để tổng hợp các đơn vị lặp lại [115]. Ở Streptococcus thermophilus Sfi6, epsE (cps4E) mã hóa cho enzyme galactosyl-1-phosphate transferase và epsF (cps4F) mã hóa cho galactosyltransferase bổ sung nhánh α-1,6-galactose. Trong khi đó ở L. johnsonii FI9785, epsE (cps4E) mã hóa cho một glycosyltransferase vận chuyển galactose-1- phosphate tới C55-P [44]. Trong nghiên cứu hiện tại, ngoại trừ xử lý stress ở pH 3, các điều kiện xử lý khác làm tăng sự biểu hiện của hai gen này. Đồng thời, kết quả phân tích thành phần monosaccharide của EPS dưới các điều kiện stress môi trường được ghi nhận giàu galactose. Như vậy có thể kết luận sự tăng biểu hiện của cps4E và cps4F là nguyên nhân dẫn đến tăng hàm lượng galactose trong thành phần EPS. Ngoài ra, những thay đổi đồng thời trong biểu hiện của cps4E và cps4F dưới tác động của các thách thức môi trường khác nhau cho thấy khả năng có sự liên kết giữa hai gen này. Tuy nhiên, cần có nghiên cứu xa hơn để chứng minh sự liên kết giữa hai gen này.
Gen cps4J (wzx) mã hóa cho flippase, một enzyme có chức năng nhận các phức hợp C55-P-đơn vị lặp lại và vận chuyển chúng qua màng tế bào chất [115]. cps4J được điều chỉnh tăng dưới tác động của stress nhiệt và sự tăng nồng độ CO2. Trong khi đó, sự biểu hiện quá mức của cps4H (wzy) (mã hóa cho các enzyme liên quan đến việc lắp ráp các đơn vị lặp lại [115]) được phát hiện dưới điều kiện stress ở pH 3 và nuôi cấy tăng cường CO2. Như vậy các enzyme được mã hóa bởi cps4J và cps4H tham gia tích cực vào quá trình phóng thích EPS ra bên ngoài, có nghĩa là sự tăng biểu hiện của hai gen này không làm thay đổi thành phần monosaccharide của EPS thu được, nhưng nó có liên quan đến tăng năng suất EPS cuối cùng. Điều này có thể giải thích cho kết quả năng suất EPS cao hơn dưới các xử lý gây stress ở pH 3 và sự tăng nồng độ CO2.
Tóm lại, kết quả nghiên cứu đã chứng minh yếu tố môi trường có thể làm thay đổi mức độ biểu hiện của các gen ở bên trong, kết quả làm thay đổi thành phần và năng suất EPS thu được. Tổng hợp lại các kết quả có thể tóm tắt những thay đổi trong sự biểu hiện của các gen liên quan tổng hợp EPS ở L. plantarum VAL6 dưới