Thay Đổi Biểu Hiện Mrna Của Các Gen Liên Quan Tổng Hợp Eps Dưới Tác Động Của Các Thách Thức Môi Trường So Với Điều Kiện Không Gây Stress

tác động của các thách thức môi trường so với điều kiện không gây stress như mô tả ở bảng 3.4.

Bảng 3.4. Thay đổi biểu hiện mRNA của các gen liên quan tổng hợp EPS dưới tác động của các thách thức môi trường so với điều kiện không gây stress

Xử lý

	Biểu hiện mRNA a
glmU	pgmB1	cps4E	cps4F	cps4H	cps4J
42 oC	̶	̶			̶	
47 oC	̶	̶			̶	
pH 3				̶		̶
pH 8	̶	̶			̶	̶
NaCl						
Sục CO2 (4 h)						
Sục CO2 (8 h)						
Sục CO2 (24 h)						

Có thể bạn quan tâm!

• Mật Số Vi Khuẩn Probiotic Được Nuôi Cấy Trong Môi Trường Mrs Không Đường Có Bổ Sung Eps Của L. Plantarum Val6
• Tỷ Lệ Các Monosaccharide: (A) Mannose; (B) Glucose; (C) Galactose; (D) Arabinose; (E) Rhamnose Và (F) Xylose Trong Eps Được Sản Xuất Bởi L. Plantarum Val6 Dưới Điều
• Điện Di Trên Gel Agarose Sản Phẩm Pcr Mrna Của Các Gen Liên Quan Tổng Hợp Eps Dưới Điều Kiện Stress Ph
• Nghiên cứu các điều kiện stress môi trường đến khả năng tổng hợp exopolysaccharides của vi khuẩn Lactobacillus plantarum - 15
• Nghiên cứu các điều kiện stress môi trường đến khả năng tổng hợp exopolysaccharides của vi khuẩn Lactobacillus plantarum - 16
• Nghiên cứu các điều kiện stress môi trường đến khả năng tổng hợp exopolysaccharides của vi khuẩn Lactobacillus plantarum - 17

Xem toàn bộ 169 trang tài liệu này.

a Biểu hiện tăng so với không gây stress;  Biểu hiện giảm giảm so với không gây stress; ̶ Không thay đổi so với không gây stress. CO2 được cung cấp liên tục với tốc độ 50 cm3/lít môi trường/phút.

3.5. Thảo luận chung

3.5.1. Sự hình thành EPS

EPS là một trong những thành phần chính tham gia cấu tạo vách tế bào và được sản xuất bởi nhiều vi sinh vật khác nhau bao gồm LAB [30]. Nhờ những đặc điểm cấu trúc độc đáo đã khiến cho EPS của LAB có được sự quan tâm đặc biệt trong các lĩnh vực hóa học, y học, dược phẩm và công nghiệp thực phẩm [3]. Nhu cầu sử dụng EPS cho các ứng dụng công nghiệp đã thúc đẩy các chiến lược nghiên cứu tăng cường sản xuất EPS. Trong những năm qua, các báo cáo mở rộng đã tập trung vào EPS của LAB ở nhiều khía cạnh khác nhau, liên quan đến cơ chế sinh tổng hợp hay nghiên cứu sản xuất EPS bằng việc tối ưu hóa các điều kiện lên men, sử dụng các công cụ công nghệ sinh học liên quan đến kỹ thuật di truyền, sử dụng các cơ chất lên men giá rẻ [235]. Nhưng ở nghiên cứu hiện tại, kết quả cho thấy stress môi trường như nhiệt độ, pH, NaCl và tăng nồng độ CO2 được chứng minh là phương pháp hữu ích giúp cải thiện năng suất và làm thay đổi tích cực quá trình sinh tổng hợp EPS ở LAB. Năng suất EPS cao nhất đạt 50,44 g/L (cao hơn 6 lần so với điều kiện không gây stress) dưới điều stress pH 3. Đây là năng suất HePS cao nhất được ghi nhận ở LAB. So với kết quả nghiên cứu gần đây thì năng suất HePS tối đa được ghi nhận ở L. fermentum chỉ khoảng 44,5 g/L [236].

3.5.2. Đáp ứng biểu hiện mRNA của các gen liên quan tổng hợp EPS

Các nghiên cứu trước đây về EPS ở LAB thường tập trung vào phân tích cụm gen eps, xác định thành phần cấu trúc và tính chất sinh học của EPS [115,237]. Như chúng ta biết thì quá trình sinh tổng hợp EPS được qui định bởi các gen eps [115]. Tuy nhiên, mặc dù vi khuẩn có chứa cả hai cụm gen qui định sản xuất HePS và HoPS, nhưng ở điều kiện nuôi cấy bình thường chỉ sản xuất một loại HoPS [238]. Điều này có nghĩa là sự tác động của yếu tố di truyền (gen) lên tính chất của EPS phụ thuộc vào điều kiện môi trường. Nghiên cứu hiện tại cũng đã chứng minh stress môi trường tác động lên sự biểu hiện của các gen liên quan kết quả làm thay đổi thành phần EPS thu được.

Hình 3.34. Sự biểu hiện của các gen liên quan tổng hợp EPS dưới tác động của stress môi trường

Qua phân tích biểu hiện mRNA, kết quả cho thấy các điều kiện stress môi trường khác nhau có thể làm thay đổi mức độ biểu hiện của các gen này. Bên cạnh đó, nghiên cứu còn tìm thấy sự thay đổi trong mức độ biểu hiện gen chịu trách nhiệm cho những thay đổi trong năng suất và thành phần monosaccharide của EPS thu được (Hình 3.34). Chẳng hạn như sự tăng biểu hiện của gen cps4E và cps4F làm

tăng hàm lượng galactose trong thành phần EPS. Như vậy có thể thấy stress môi trường làm thay đổi tác động của gen lên thành phần EPS thông qua sự biểu hiện mRNA. Tương tự như ở nghiên cứu hiện tại, các yếu tố môi trường như pH và nhiệt độ đã được chứng minh làm thay đổi mức độ biểu biện cua các gen epsNMLKJ ở S. thermophilus ASCC 1275 [175]. Một nghiên cứu trên L. rhamnosus cũng cho thấy có mối tương quan giữa sự biểu hiện của các gen liên quan đến operon EPS, chuyển hóa đường và stress trong quá trình sản xuất EPS [239].

Nghiên cứu hiện tại không phân tích sản phẩm enzyme của các gen được kiểm tra. Các enzyme tạo thành sau khi dịch mã mRNA sẽ trực tiếp xúc tác cho quá trình tổng hợp EPS, cho nên cũng cần nghiên cứu phân tích các enzyme này để hiểu rõ hơn mối quan hệ giữa điều hoà biểu hiện gen và stress môi trường.

3.5.3. Khả năng hình thành đường hiếm trong thành phần EPS

Thành phần monosaccharide của EPS có liên quan đến chức năng và hoạt tính sinh học của nó. EPS với thành phần monosaccharide khác nhau sẽ khác nhau trong hiệu quả điều trị bệnh [240]. Trong nghiên cứu hiện tại, thành phần monosaccharide được tìm thấy có sự thay đổi khác nhau trong những điều kiện gây stress khác nhau. Do đó, phương pháp tiếp cận của nghiên cứu mở đường cho việc sản xuất EPS với các đặc tính sinh học nâng cao cho các mục đích cụ thể. Dựa trên kết quả đạt được, có thể đề xuất một mô hình nâng cao EPS bằng cách áp dụng thách thức môi trường cho các ứng dụng công nghiệp (Hình 3.35). Cụ thể, việc gây stress ở các điều kiện nhiệt độ cao, pH, NaCl và tăng nồng độ CO2 có thể làm thay đổi phản ứng của tế bào đối với con đường sinh tổng hợp EPS, dẫn đến những thay đổi về thành phần và đặc điểm EPS do sự tích tụ với tỷ lệ nhiều hơn của một số loại đường phổ biến và đường hiếm.

Điều kiện bình thường

Stress môi trường

Nhiệt độ, pH, CO2…

Phản ứng của tế bào đối với con đường sinh tổng hợp EPS

Thay đổi thành phần và đặc điểm EPS

Ví dụ: Hình thành đường phổ biến và đường hiếm

Hình 3.35. Mô hình đề xuất để nâng cao EPS được sản xuất bởi L. plantarum VAL6

Điều thú vị đó là trong một số điều kiện gây stress nhất định, các loại đường hiếm như fucose được tìm thấy trong thành phần monosaccharide của EPS. Các nghiên cứu trước đây ở LAB không có báo cáo nào về sự hiện diện của fucose trong thành phần đường của EPS. Hầu hết các đường hiện diện trong thành phần monosaccharide của EPS được sản xuất bởi LAB là đường 6 carbon (hexose) như glucose, galactose, mannose,….[241]. Sự xuất hiện của đường 5 carbon (pentose) như fucose cho thấy khả năng có một con đường chuyển hoá khác trong quá trình sinh tổng hợp EPS ở LAB dưới tác động của stress môi trường. Các loại đường hiếm như fucose, rhamnose, xylose hoặc acid uranic trong thành phần EPS có thể cung cấp các đặc tính tốt hơn được ứng dụng cho các mục đích khác nhau. EPS giàu đường hiếm với hoạt tính sinh học cao đã được ứng dụng rộng rãi trong ngành thực phẩm, mỹ phẩm cũng như các ứng dụng lâm sàng [242]. Một nghiên cứu gần đây cho thấy sự vượt trội của thành phần xylose trong EPS được sản xuất bởi L. plantarum WLPL04 làm tăng khả năng ức chế sự hình thành biofilm của một số vi khuẩn gây bệnh và hoạt động kháng u đối với tế bào HT-29 [243]. Kết quả này cung cấp bằng chứng thuyết phục rằng có thể điều khiển sinh tổng hợp EPS giàu đường hiếm bằng cách áp dụng stress môi trường.

3.5.4. Mối quan hệ giữa biểu hiện gen với năng suất và thành phần monosaccharide của EPS

Cụm gen eps ở vi sinh vật chứa các gen chịu trách nhiệm cho một số bước của quá trình tổng hợp biopolymer như điều hòa, hình thành tiền chất nucleotide- đường, trùng hợp các đường monomer và phóng thích ra khỏi bề mặt tế bào. Sự biểu hiện và biểu hiện quá mức của các gen đơn hoặc toàn bộ cụm gen eps có thể làm thay đổi trong quá trình sinh tổng hợp EPS. Trong nghiên cứu hiện tại, kết quả cũng chứng minh rằng sự thay đổi trong biểu hiện mRNA của các gen liên quan tổng hợp EPS dưới tác động của stress môi trường chịu trách nhiệm cho các thay đổi trong thành phần monosaccharide của EPS. Cụ thể sự tăng biểu hiện của hai gen cps4E và cps4F kết quả tăng hàm lượng galactose trong thành phần đường của EPS. Tương tự, sự tăng biểu hiện của gen glmU khả năng dẫn đến tăng tổng thành phần N-acetyl-D-glucosamine. N-acetyl-D-glucosamine là một trong những thành phần tham gia cấu tạo nên vách tế bào vi khuẩn cũng như tham gia vào thành phần cấu tạo EPS. Mặc dù nghiên cứu hiện tại không phân tích hàm lượng N-acetyl-D-

glucosamine nhưng đây có thể là nguyên nhân dẫn đến sự tăng hàm lượng protein trong thành phần EPS dưới stress môi trường nhờ khả năng tạo liên kết với protein của nó. Như vậy có thể thấy stress môi trường không chỉ dẫn đến việc điều hòa cụm gen sinh tổng hợp EPS mà còn ảnh hưởng đến mức độ biểu hiện tương đối của chúng, kết quả tái tổ chức các nhóm đơn phân trong EPS và quy định tỷ lệ của các monosaccharide trong chất chuyển hóa cuối cùng [244].

Những thay đổi trong biểu hiện gen là đặc điểm điển hình của vi khuẩn trong phản ứng với stress môi trường và liên quan đến vô số các cơ chế khác nhau [245]. Hơn nữa, sự điều hòa biểu hiện gen eps cho phép kiểm soát sự hình thành EPS ở vi khuẩn [246]. Nhiều nghiên cứu cũng chỉ ra rằng năng suất của EPS được cải thiện bằng cách biểu hiện quá mức các gen hoặc cụm gen đặc hiệu. Nghiên cứu hiện tại đã làm sáng tỏ mối liên quan giữa sự tăng sản xuất EPS, stress môi trường và sự biểu hiện của gen eps. Năng suất EPS cao nhất thu được ở xử lý pH 3 cùng với sự biểu hiện tăng mạnh của gen cps4H (một gen liên quan đến quá trình trùng hợp EPS) trong cùng điều kiện là minh chứng rõ ràng cho mối liên quan này. Một nghiên cứu trước đây cũng đã chứng minh sự tăng biểu hiện của cụm gen eps làm tăng sản xuất EPS [128]. Đây là những thông tin có giá trị để làm rõ hơn mối quan hệ giữa sự điều hoà biểu hiện gen và sinh tổng hợp EPS ở LAB.

3.5.5. Tác động của stress môi trường với khả năng sống sót của L. plantarum VAL6

Sự thích nghi với stress môi trường có thể cải thiện khả năng sống sót của vi khuẩn probiotic trong quá trình sấy đông khô. Để giải thích cho điều này, các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng có sự tăng cường tổng hợp những yếu tố kháng bên trong tế bào như các protein kháng stress (DnaK, GroEL, Csp,..) và các chất điều hoà (HrcA, CtsR,…) [247]. Tuy nhiên, việc tăng sản xuất EPS bên ngoài tế bào dưới tác động của stress môi trường cũng là một yếu tố giúp cải thiện sống sót của vi khuẩn.

Trong suốt quá trình sấy đông khô, EPS hoạt động như một chất bảo vệ lạnh giúp bảo vệ tế bào khỏi bị đóng băng và các ảnh hưởng gây stress của sự mất nước. Ngoài ra, sự oxy hóa lipid màng trong quá trình sấy sẽ làm hư hỏng cấu trúc vách tế bào của vi khuẩn [248]. Dưới các điều kiện stress môi trường, EPS được tổng hợp với hoạt tính chống oxy hóa cao có thể ức chế hiệu quả quá trình oxy hóa màng, kết

quả tăng khả năng sống sót. Thực tế nghiên cứu đã chứng minh EPS được sản xuất trong điều kiện nuôi cấy có bổ sung stress môi trường thể hiện hoạt tính bắt gốc tự do DPPH cao hơn so với EPS được sản xuất trong điều kiện nuôi cấy thông thường. Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy hàm lượng EPS và khả năng sống sót của

EPS tổng (g/L)

Hệ số sống sót

L. plantarum VAL6 có mối tương quan với nhau. Chuyển đổi từ các số liệu có được về hàm lượng EPS và tỷ lệ sống sót sau sấy đông khô của vi khuẩn, sử dụng phương pháp phân tích hồi quy, mô hình cho mối quan hệ thực nghiệm giữa lượng EPS tổng hợp và hệ số sống sót sau sấy đông khô của L. plantarum VAL6 được biểu diễn bằng phương trình: y = -0,0057x2 + 0,1849x – 0,5405 với R² = 0,9544 (Hình 3.36). Theo phương trình này, có thể xác định khả năng sống sót sau đông khô của các chủng giống LAB khởi động dựa trên hàm lượng EPS đo được.

Hình 3.36. Mối tương quan giữa tổng EPS và khả năng sống sót của L. plantarum

VAL6 trong quá trình sấy đông khô

Sự tăng tổng hợp EPS giúp tạo thành lớp vi bao xung quanh tế bào một cách chắc chắn hơn. Lớp vi bao này không chỉ bảo vệ làm tăng khả năng sống sót của L. plantarum VAL6 trong quá trình sấy đông mà còn bảo vệ nó khỏi các điều kiện môi trường khắc nghiệt của đường tiêu hóa một khi được sử dụng như một vi khuẩn probiotic. EPS giúp tăng cường sự kết dính của tế bào vi khuẩn vào niêm mạc ruột để thúc đẩy tác dụng điều hòa miễn dịch cũng như kích thích các chức năng trao đổi chất [249-251]. Fedorová và cs. (2018) cũng đã chứng minh mối tương quan tích cực giữa sản xuất EPS và khả năng kháng của L. reuteri đối với các điều kiện stress của đường tiêu hóa [143]. Do đó, stress môi trường có thể là một cách tiếp cận mới trong việc cải thiện khả năng sống sót của các chủng probiotic cho các ứng dụng khác nhau.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

1. Kết luận

Từ các kết quả nghiên cứu, có thể rút ra được các kết luận sau:

- Lactiplantibacillus plantarum VAL6 được phân lập từ thực phẩm lên men tại An Giang (Việt Nam) là chủng vi khuẩn có khả năng sản xuất EPS cao.

- Các yếu tố stress môi trường nuôi như nhiệt độ, pH, NaCl và sục tăng cường CO2 có tác động kích thích làm tăng sản xuất EPS ở L. plantarum VAL6. Năng suất EPS cao nhất (50,44 g/L) thu được ở điều kiện stress pH 3 trong 3 giờ.

- Sự tăng sản xuất EPS dưới các điều kiện stress môi trường làm tăng rõ rệt sự sống sót của vi khuẩn sau quá trình sấy đông khô. Tương ứng với lượng EPS thu được nhiều nhất, tỷ lệ sống sót sau đông khô của L. plantarum VAL6 ở điều kiện stress pH 3 cũng đạt cao nhất (30,72%), cao hơn 1.536 lần so với điều kiện không gây stress.

- Stress môi trường làm thay đổi thành phần monosaccharide của EPS với sự tích tụ nhiều hơn của một số loại đường phổ biến và đường hiếm. EPS được sản xuất bởi L. plantarum VAL6 ở điều kiện nuôi cấy bình thường là HePS bao gồm các loại đường mannose (83,44%), glucose (14,01%), galactose (1,15%), arabinose (0,00%), rhamnose (0,71%) và xylose (0,67%). Sau khi gây stress, thành phần monosaccharide thay đổi bao gồm mannose (69,13-80,34%), glucose (12,55- 23,60%) và galactose (1,87-6,50%), arabinose (0,00-8,96%), rhamnose (0,38-

8,00%) và xylose (0,00-6,55%).

- Stress môi trường có tác động làm tăng hoặc giảm sự biểu hiện của các gen liên quan đến quá trình sinh tổng hợp EPS (glmU, pgmB1, cps4E, cps4F, cps4J và cps4H), kết quả dẫn đến những thay đổi trong năng suất cũng như thành phần monosacchride của EPS.

2. Kiến nghị

Để hiểu rõ hơn mối quan hệ giữa stress môi trường và sinh tổng hợp EPS, một số hướng nghiên cứu có thể được kiến nghị như sau:

- Đánh giá quá trình sinh tổng hợp EPS ở vi khuẩn L. plantarum VAL6 dưới sự tác động đồng thời của nhiều yếu tố môi trường cũng như khảo sát tối ưu thời gian gây stress.

- Đánh giá tổng thể thành phần cấu tạo, cấu trúc và chức năng của EPS được sản xuất bởi vi khuẩn L. plantarum VAL6 dưới các điều kiện gây stress môi trường khác nhau.

- Đánh giá quá trình dịch mã tạo ra protein hoặc các enzyme chức năng để hoàn chỉnh quá trình tổng hợp EPS dưới các điều kiện gây stress đã khảo sát.

- Khảo sát các điều kiện gây stress môi trường nuôi thích hợp để tăng tỷ lệ đường hiếm trong thành phần EPS được sản xuất từ vi khuẩn L. plantarum VAL6.