Thử Nghiệm Sinh Vật Học Gián Tiếp

trong nhiều loại thức ăn khác nhau như ngô, đậu, lúa mì, lúa mạch, lúa miến, kê ,… [97], [205]. Gà được cho ăn bằng thức ăn thí nghiệm trong 7-11 ngày. Chất thải được thu trong 3-4 ngày cuối của thí nghiệm. Lượng thức ăn ăn vào và lượng chất thải đào thải được theo dõi để tính toán giá trị AME [97], [205].

1.3.1.2. Thử nghiệm sinh vật học gián tiếp

Phương pháp này được Yoshida và Morimoto (1970) tiến hành lần đầu tiên trên gà 1 hoặc 2 tuần tuổi nhằm đánh giá năng lượng sinh học sẵn có trong thức ăn [255]. Đặc biệt, phương pháp này có thể thực hiện với lượng mẫu thức ăn chỉ từ 5- 50g. Gà thí nghiệm được cho nhịn đói để giữ khối lượng cơ thể ở mức thấp nhất. Sau đó, gà được cho ăn bằng các khẩu phần chuẩn hoặc khẩu phần kiểm tra có chứa 5% mẫu thức ăn thí nghiệm trong 6 ngày. Lượng ăn vào và tăng trọng của gà thí nghiệm trong 6 ngày thí nghiệm được theo dõi. Đường chuẩn được xây dựng dựa trên tương quan giữa tốc độ sinh trưởng của gà và các mức năng lượng trong các khẩu phần chuẩn. Giá trị năng lượng sẵn có trong mẫu thức ăn thí nghiệm được tính toán dựa trên đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ tuyến tính giữa mức năng lượng của khẩu phần và tăng trọng của gà [255]. Phương pháp này cũng đã được Squibb (1971) sử dụng và cải tiến để tính toán giá trị ME ở ngô và lúa mì [225].

Phương pháp này không được các nhà sản xuất thức ăn quan tâm do kết quả có độ biến động cao và chi phí cho công lao động lớn [215]. Mặt khác, thời gian để thực hiện phương pháp này dài tương đương với thời gian triển khai thử nghiệm sinh vật học trực tiếp [215]. Ưu điểm duy nhất của phương pháp này chính là nó không đòi hỏi các thiết bị phòng thí nghiệm phức tạp [215].

1.3.1.3. Thử nghiệm vật lý học gián tiếp

Hầu hết các nỗ lực nhằm tìm ra mối quan hệ gần gũi giữa giá trị ME và các tính chất vật lý của thức ăn đều thất bại. Tuy nhiên, Lockhart và cs. (1961) đã nhận thấy rằng các giá trị ME của yến mạch gia tăng cùng với mật độ khối [130]. Tuy nhiên, Sibbald và Price (1976), Coates và cs. (1977) không tìm thấy mối quan hệ tương tự giữa giá trị ME và mật độ khối ở lúa mạch và lúa mì [45], [216]. Vì vậy, việc sử dụng thử nghiệm vật lý để đánh giá giá trị ME ít có giá trị trong xây dựng công thức thức ăn do độ chính xác thấp [215].

1.3.1.4. Thử nghiệm hóa học gián tiếp

Từ năm 1940, Fraps và cs. đã tuyên bố rằng có thể dự đoán giá trị AME trong thức ăn từ các giá trị protein thô tiêu hóa, lipid tiêu hóa và dẫn xuất không nitơ tiêu hóa [70]. Titus (1955) đã tìm thấy một loạt các hệ số tiêu hóa cho phép tính toán giá trị AME của từng loại thức ăn [234]. Sau đó, nhiều nhóm nghiên cứu khác đã phát triển các phương trình dự đoán giá trị ME dựa trên protein, lipid và carbohydrate sẵn có [27], [40], [217]. Janssen và cs. (1979 tdt [160]) đã tiến hành một loạt nghiên cứu về tương quan giữa thành phần hóa học của các loại thức ăn khác nhau và giá trị năng lượng trao đổi. Bằng phân tích hồi quy, các nhà khoa học đã thiết lập được các phương trình ước tính giá trị năng lượng trao đổi có hiệu chỉnh nitơ (kcal/kg chất khô) [160]. Tuy nhiên, NRC không đề cập đến phương trình nào cho kết quả ước tính giá trị năng lượng trao đổi từ thành phần hóa học tốt nhất. Cho đến nay vẫn chưa có nghiên cứu so sánh các phương trình khác nhau với một giá trị xác định [160].

Thử nghiệm hóa học gián tiếp được các nhà sản xuất thức ăn chăn nuôi sử dụng để ước tính giá trị ME của các nguyên liệu và kiểm tra chất lượng sản phẩm cuối cùng. Thử nghiệm này có thể hoàn tất trong 24 giờ với chi phí tương đối thấp. Tuy nhiên, phương pháp này cũng tồn tại một số hạn chế. Giá trị ước tính từ các phương trình dự đoán không thể chính xác hơn so với khi sử dụng phương pháp thử nghiệm sinh vật học trực tiếp. Ngoài ra, sự biến động về thành phần hóa học của thức ăn cũng ảnh hưởng lớn đến độ chính xác của giá trị AME ước tính. Các giá trị AME của một số nguyên liệu, đặc biệt là các nguyên liệu có hàm lượng xơ thô cao, thường khó dự đoán chính xác bằng phương trình [215].

Cho đến nay, xác định giá trị năng lượng trao đổi bằng thí nghiệm nuôi động vật trong cũi trao đổi chất là phương pháp được sử dụng phổ biến [202], [208], [237]. Các thí nghiệm ME thường chỉ được thực hiện trong một khoảng thời gian ngắn. Trong khoảng thời gian đó, lượng nitơ tích lũy sẽ không thay đổi ở gia cầm giai đoạn đang phát triển. Tuy nhiên, trong cùng một thí nghiệm, lượng nitơ tích lũy ở các cá thể là không giống nhau. Qua thời gian, tất cả protein trong cơ thể sẽ được chuyển hóa và cuối cùng lượng nitơ tích lũy sẽ bị đào thải ra ngoài. Do thời gian

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 166 trang tài liệu này.

hạn chế của thí nghiệm ME, quá trình chuyển hóa protein sẽ được tính qua công thức toán học bằng cách sử dụng hiệu số hiệu chỉnh [133]. Hiện có 2 hệ số tích lũy nitơ được sử dụng rộng rãi để hiệu chỉnh giá trị năng lượng trao đổi là 8,22 kcal/g và 8,73 kcal/g [159]. Việc hiệu chỉnh giá trị năng lượng trao đổi bằng lượng nitơ tích lũy được thực hiện dựa trên giả định rằng sự oxy hóa protein ở mô bào sẽ sản sinh uric acid có năng lượng thô là 8,22 kcal/g nitơ [91]. Tuy nhiên, nghiên cứu của Coulson và Huges (1930) cho thấy chỉ có 60 đến 80% nitơ trong nước tiểu của gà tồn tại dưới dạng uric acid ([160], tdt [212],). Ngoài ra, Titus và cs. (1959 tdt [212]) cũng đã nhận thấy trong nước tiểu của gà, ngoài uric acid còn có các hợp chất khác chứa nitơ. Do đó theo các tác giả, hệ số hiệu chỉnh nitơ tích lũy là 8,73 kcal/g. Giá trị hiệu chỉnh được cộng thêm vào giá trị năng lượng đào thải cho mỗi gam nitơ tích lũy. Hiệu chỉnh về trạng thái cân bằng nitơ là rất cần thiết khi so sánh giá trị năng lượng trao đổi xác định trên gia cầm ở các giai đoạn phát triển khác nhau.

1.3.2. Các phương pháp đánh giá tỉ lệ tiêu hóa

1.3.2.1. Phương pháp in vitro

Phương pháp sử dụng để đánh giá tiêu hóa protein trong thức ăn được chia thành 2 nhóm: phương pháp in vitro và phương pháp in vivo. Các kỹ thuật in vitro được nhiều nhà nghiên cứu quan tâm do những ưu điểm như đơn giản, chi phí thấp và không cần sử dụng động vật thí nghiệm. Tuy nhiên, các kết quả in vitro đến nay vẫn chưa được chấp nhận để ứng dụng trong lập khẩu phần. Các phương pháp in vitro bao gồm thử nghiệm hóa học, thử nghiệm enzyme, thử nghiệm vi sinh vật, kỹ thuật quang phổ cận hồng ngoại (NIRS) và xét nghiệm miễn dịch.

Thử nghiệm hóa học

Các phương pháp hóa học sử dụng để đánh giá tính sẵn có của các amino acid hầu hết đều liên quan đến lysine do lysine là amino acid giới hạn thứ 2 trong ngũ cốc và hầu hết các khẩu phần cho gia cầm. Carpenter (1960) đã phát triển phương pháp dựa trên phản ứng của nhóm –amino của lysine với fluorodinitrobenzene (FDNB) để đánh giá hàm lượng lysine sẵn có [39]. Phương pháp này dựa trên cơ sở chỉ có các phân tử lysine với gốc –amino tự do là sẵn có về mặt dinh dưỡng đối với động vật. Phương pháp liên quan đến phản ứng giữa nhóm –amino tự do của lysine

trong protein thử nghiệm và FDNB để hình thành –dinitrophenyl-lysine (–DNPL) được giải phóng sau khi thủy phân và được đo bằng phương pháp so màu. Đối với các thức ăn giàu carbohydrate và nghèo protein, –DPNL không bền vững trong quá trình thủy phân acid. Do đó, trong trường hợp này, –DPNL được tính toán dựa trên sự chênh lệch giữa hàm lượng lysine tổng số và lysine phục hồi sau quá trình thủy phân acid của dinitrophenylated protein [195]. Một số phương pháp hóa học khác có thể sử dụng để định lượng lysine phản ứng bao gồm phương pháp sử dụng 2,4,6- trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS) [108], O-methylisourea (OMIU) hay phản ứng guanidinate hóa [138], furosine (Erbersdobler và Zucker, 1966 tdt [98]), gắn với thuốc nhuộm sulfonate hóa như acid orange 12 [98] và xác định lysine tổng số sau phản ứng khử với borihydrite (NaBH4) (Thomas, 1972 tdt [98]).

Thử nghiệm enzyme

Việc đánh giá chất lượng protein có thể được thực hiện thông qua thử nghiệm enzyme ở mức độ in vitro với một enzyme (thông thường là pepsin) hay một hỗn hợp các enzyme dạ dày, tụy và ruột [113]. Hỗn hợp enzyme có thể ở dạng tương đối tinh hoặc là dịch tiêu hóa ở ruột non [140]. Trong các phương pháp phân giải protein bằng 1 loại enzyme duy nhất, phương pháp thủy phân pepsin được sử dụng để đánh giá tỉ lệ tiêu hóa nitơ ở các nguồn nguyên liệu protein động vật trong nhiều năm qua [144]. Thử nghiệm pepsin được chấp nhận rộng rãi trong ngành công nghiệp thức ăn do nó tương đối đơn giản, không đắt tiền, nhanh và có thể tiến hành so sánh nhiều mẫu trong cùng thời gian. Việc sử dụng phương pháp đơn enzyme có thể hữu hiệu trong đánh giá tỉ lệ tiêu hóa một chất dinh dưỡng, chẳng hạn như đánh giá tiêu hóa protein bằng cách sử dụng pepsin, đánh giá tiêu hóa tinh bột bằng enzyme amylase, … Tuy nhiên, do sự tiêu hóa 1 chất dinh dưỡng bị ảnh hưởng bởi tiêu hóa các chất dinh dưỡng khác, các phương pháp đa enzyme được cho là đáng tin cậy hơn trong việc đánh giá chất lượng dinh dưỡng của thức ăn ở mức độ in vitro [26].

So với thử nghiệm pepsin, việc sử dụng 2 hoặc nhiều enzyme với các peptide đặc trưng khác nhau dẫn đến phân giải protein tốt hơn. Trong thử nghiệm đa enzyme, phương pháp thay đổi pH [93] đã được chứng minh là đầy triển vọng đối với việc đánh giá phân hủy nhiệt ở enzyme và được ứng dụng rộng rãi trong công

nghiệp thức ăn và thực phẩm. Tuy nhiên, phương pháp này bị chỉ trích do tính nhạy cảm của nó đối với khả năng đệm của dịch huyền phù protein, các phenolic acid và các hợp chất ion hóa khác. Để khắc phục các vấn đề trên, Pedersen và Eggum (1983) đã đưa ra phương pháp pH-stat, trong đó giá trị pH được giữ không đổi bằng cách chuẩn độ với dung dịch 0,1M NaOH và ghi nhận lượng NaOH sử dụng [173].

Thử nghiệm vi sinh vật

Trước khi kỹ thuật sắc ký trao đổi ion được phát minh, thử nghiệm vi sinh vật thường được sử dụng để xác định hàm lượng amino acid tổng số trong protein. Sau đó, thử nghiệm vi sinh vật được sử dụng để đánh giá tính sẵn có của protein [134]. Các vi sinh vật thường được sử dụng trong phương pháp này bao gồm Streptoccocus faecalis, Streptococcus durens, Lactobacullus arabinosus ([69], [56]), Streptococcus zymogenes [146] và Tetrahymea pyriformis [228]. Mối quan hệ giữa thử nghiệm trên vi sinh vật và thử nghiệm trên gà đối với các amino acid sẵn có thay đổi phụ thuộc vào bản chất của nguyên liệu thí nghiệm nhưng nhìn chung là khá chặt chẽ [28], [42].

Quang phổ cận hồng ngoại (NIRS)

NIRS là kỹ thuật có tiềm năng phát triển thành phương pháp đáng tin cậy để dự đoán tiêu hóa amino acid in vivo [86], [103], [241]. Sử dụng phương pháp này cho kết quả nhanh hơn nhiều so với các phương pháp in vitro. Tuy nhiên, phương pháp này phụ thuộc vào việc hiệu chuẩn của thiết bị bằng số lượng mẫu tương đối lớn với các giá trị in vivo đã biết trước. Đây chính là lý do chính làm chậm sự phát triển của phương pháp NIRS. Thêm vào đó, các dữ liệu được hiệu chỉnh cần phải được kiểm chứng bằng so sánh thống kê với các dữ liệu độc lập [184]. Hiện nay, nhiều nhà máy thức ăn chăn nuôi sử dụng công nghệ NIRS để dự đoán hàm lượng protein, độ ẩm, lipid và khoáng tổng số nhằm có những thông tin cần thiết trong một loại thức ăn.

Xét nghiệm miễn dịch

Việc sử dụng kỹ thuật xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme (ELISA) làm công cụ phân tích trong ngành công nghiệp thực phẩm cho con người đang được quan tâm [220]. Cho đến nay, kỹ thuật này chưa được áp dụng vào lĩnh

vực dinh dưỡng động vật. Tuy nhiên, kỹ thuật ELISA có thể được sử dụng để đánh giá tiêu hóa protein ở mức độ in vitro [184].

1.3.2.2. Phương pháp in vivo

Các phương pháp in vivo được sử dụng trong đánh giá tỉ lệ tiêu hóa các chất dinh dưỡng của thức ăn và được chia thành 2 nhóm: phương pháp in vivo gián tiếp và in vivo trực tiếp.

Phương pháp in vivo gián tiếp (thử nghiệm amino acid huyết tương)

Thử nghiệm amino acid huyết tương dựa trên nguyên tắc máu vận chuyển các sản phẩm của quá trình tiêu hóa và hấp thu protein trong thức ăn (các peptide và amino acid tự do) đến các mô của cơ thể phục vụ cho các quá trình đồng hóa tiếp theo. Chính vì vậy, mức độ các amino acid tự do trong máu có thể phản ánh tính sẵn có của protein trong thức ăn [184]. Trong phương pháp này, nồng độ các amino acid tự do xác định được trong huyết tương của con vật bị cho nhịn đói được sử dụng làm đối chứng và được so sánh với nồng độ amino acid tự do trong huyết tương sau khi cho con vật ăn [155].

Thử nghiệm amino acid huyết tương có ưu điểm là nhanh chóng, thuận tiện và đơn giản. Tuy nhiên, phương pháp này còn nhiều hạn chế. Mức độ các amino acid tự do trong máu không chỉ phụ thuộc vào protein tiêu hóa mà còn phụ thuộc vào trạng thái dinh dưỡng của con vật. Ở trạng thái cân bằng nitơ dương, các amino acid tự do bị loại bỏ khỏi vòng lưu thông để sinh tổng hợp protein. Ngược lại, khi quá trình trao đổi chất cao, các amino acid dư thừa sẽ được giải phóng vào huyết tương. Ngoài ra, nồng độ các amino acid tự do ở huyết tương còn phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố như nhịp sinh học, tuổi, loài, trạng thái sinh lý, lượng thức ăn, vị trí và thời gian lấy máu, tần suất cho ăn, việc cung cấp các chất dinh dưỡng sinh năng lượng trong thời gian con vật bị cho nhịn đói, cân bằng amino acid và nhiệt độ phòng [134], [214]. Do đó, việc giải thích những thay đổi trong hàm lượng các amino acid huyết tương khi xác định tỉ lệ amino acid tiêu hóa là rất khó khăn [165]. Vì những hạn chế trên, thử nghiệm amino acid huyết tương không được chấp nhận rộng rãi. Tuy nhiên, hàm lượng các amino acid tự do trong huyết tương có thể được sử dụng để nhận biết amino acid giới hạn trong thức ăn gia cầm và biểu thị điểm mà ở đó nhu cầu amino acid được đáp ứng [65], [89].

Phương pháp in vivo trực tiếp

Việc đánh giá trực tiếp tỉ lệ tiêu hóa amino acid có thể thực hiện thông qua 2 phương pháp là thử nghiệm sinh trưởng và thử nghiệm tiêu hóa.

Thử nghiệm sinh trưởng

Đây là phương pháp được phát triển nhằm xác định lượng amino acid trong thức ăn được tiêu hóa, hấp thu, chuyển thành protein của cơ thể hay các chất chuyển hóa phục vụ cho các mục đích sử dụng khác trong cơ thể [184]. Nguyên tắc của phương pháp này là xác định khả năng của protein đối với việc thay thế một amino acid đặc biệt trong hỗ trợ sinh trưởng. Trong thử nghiệm sinh trưởng đánh giá tỉ lệ tiêu hóa một amino acid, amino acid đó được đưa vào khẩu phần cơ sở thiếu hụt chính amino acid đó với nồng độ tăng dần nhằm thiết lập mối quan hệ giữa phản ứng sinh trưởng và hàm lượng amino acid trong khẩu phần [41].

Thử nghiệm sinh trưởng trên gà đã được sử dụng để đánh giá hàm lượng lysine sẵn có sinh học ([136], [157], [166], [169]), lysine tiêu hóa [66], methionine [41], valine tiêu hóa [66] và tryptophan tiêu hóa [87] ở các nồng độ protein khác nhau. Việc sử dụng thử nghiệm sinh trưởng để đánh giá hàm lượng các amino acid sẵn có về mặt sinh học được quan tâm do các thử nghiệm sinh trưởng đánh giá phản ứng sinh trưởng bao gồm tất cả các yếu tố ảnh hưởng đến tính sẵn có về mặt sinh học (tiêu hóa, hấp thu và sử dụng). Mặt khác, thử nghiệm sinh trưởng có nhiều hạn chế nghiêm trọng. Phương pháp này tốn nhiều thời gian, chi phí cao, đặc biệt mỗi lần chỉ cho phép đánh giá tỉ lệ tiêu hóa của duy nhất một amino acid. Ngoài ra, biến dị di truyền ở các động vật cũng là yếu tố ảnh hưởng đến độ chính xác của nghiên cứu. Phương pháp thiết kế và tiến hành thí nghiệm sinh trưởng có ảnh hưởng lớn đến kết quả nghiên cứu [125]. Ngoài các amino acid sẵn có, phản ứng sinh trưởng chịu tác động bởi nhiều yếu tố dinh dưỡng như lượng ăn vào, hàm lượng protein trong khẩu phần, tương tác giữa các amino acid. Do đó vấn đề được đặt ra là liệu phương pháp thử nghiệm sinh trưởng có thích hợp để đánh giá tỉ lệ tiêu hóa hay không [184]. Cho đến nay đã có nhiều ý kiến về nhiều khía cạnh khác nhau trong phương pháp luận của thử nghiệm sinh trưởng đã được công bố [21], [38], [125], [167], [214].

Thử nghiệm tiêu hóa

Đây là kỹ thuật được sử dụng nhiều nhất trong đánh giá tỉ lệ tiêu hóa. Với phương pháp này, tỉ lệ tiêu hóa của các amino acid đều được xác định chỉ trong một thí nghiệm. Về cơ bản, các thí nghiệm tiêu hóa xác định sự sai khác giữa amino acid ăn vào và amino acid đào thải. Các thí nghiệm tiêu hóa được chia thành 2 nhóm dựa trên cách thu mẫu, đó là tiêu hóa chất thải (toàn phần) và tiêu hóa hồi tràng [20], [184]. Tiêu hóa chất thải được đánh giá thông qua việc thu mẫu chất thải từ gia cầm nguyên vẹn hoặc đã bị phẫu thuật manh tràng hoặc làm hậu môn giả tùy theo mục tiêu của thí nghiệm. Tiêu hóa hồi tràng có thể được chia thành 2 kỹ thuật thu mẫu là thu dịch tiêu hóa ở hồi tràng của con vật sau khi chết hay thu từ cannula được gắn vào phần cuối của hồi [184].

Tiêu hóa chất thải

Kuiken và Lyman (1948) lần đầu tiên đã phát triển phương pháp phân tích nhằm đánh giá tỉ lệ các amino acid trong protein ăn vào đã biến mất trong đường tiêu hóa [117]. Phương pháp này dựa trên cơ sở tính sẵn có của amino acid được xác định thông qua đánh giá tỉ lệ tiêu hóa bằng cách lấy lượng amino acid ăn vào trừ đi lượng amino acid “không được hấp thu” ở trong phân. Trong phương pháp này, kỹ thuật thu chất thải tổng số hoặc chất chỉ thị như chromic oxide [111], AIA [139], ytterbrium nitrate [121] hoặc ferric oxide [29] được sử dụng.

Đối với gia cầm, việc thu chất thải có thể không chính xác do phân bị tạp nhiễm bởi nước tiểu, lông vũ, vảy và các vật liệu khác từ bên ngoài [102]. Vì vậy, thử nghiệm này không đánh giá “tiêu hóa” như định nghĩa truyền thống mà là “có thể chuyển hóa” do phân và nước tiểu được thải ra đồng thời ở gia cầm [184]. Các phương pháp đã được phát triển để tách phân và nước tiểu ở gia cầm trước khi bị đào thải ra ngoài bao gồm lắp hậu môn giả [99] và thông niệu quản ra ngoài [50]. Tuy nhiên, lượng amino acid trong chất thải có nguồn gốc từ nước tiểu thường được bỏ qua do hàm lượng amino acid trong nước tiểu rất thấp, ảnh hưởng không đáng kể đến việc tính toán tỉ lệ tiêu hóa [231]. Kết quả nghiên cứu của Yamazaki (1983) cũng cho thấy không có sai khác giữa các tỉ lệ tiêu hóa thực xác định được trên gà mái được lắp hậu môn giả và gà trống trưởng thành không phẫu thuật [254]. Tuy