Phương Pháp Sắc Ký Lỏng Hiệu Năng Cao Hplc (High Performance Liquid Chromatography)

2.3.11. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC (High Performance Liquid Chromatography)

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (viết tắt là HPLC) là một kỹ thuật sắc ký dùng để phân tách các cấu tử trong hỗn hợp và định tính cũng như định lượng các cấu tử đó. Sắc ký có thể mô tả như là một quá trình truyền khối liên quan đến hấp phụ. HPLC dựa trên bơm cao áp để đẩy hỗn hợp chất cần phân tích qua cột sắc ký chứa đầy các chất hấp phụ có thể hấp phụ và phân tách các cấu tử trong hỗn hợp đó. Các chất hấp phụ trong cột là các cấu tử hoạt tính (thường là silica hay một số polyme nào đó) có kích thước từ 2 - 50 micromet. Các cấu tử trong hỗn bị phân tách do tương tác khác nhau giữa nó với chất hấp phụ. Chất lỏng đi qua cột sắt ký dưới áp suất cao thường là hỗn hợp dung môi (đó là nước, acetonitrile hay methanol), và thường được gọi là pha động (mobile phase). Thành phần và nhiệt độ đóng vai trò quan trọng trong quá trình tách chất và bị ảnh hưởng bởi tương tác xảy ra giữa chất cần tách với chất hấp phụ. Dựa vào sự khác nhau về cơ chế tách chiết sử dụng trong HPLC, người ta chia HPLC thành 4 loại: (a) Sắc ký hấp phụ hay sắc ký lỏng rắn (adsorption/liquid chromatography), (b) Sắc ký phân bố (partition chromatography); (b) Sắc ký ion (ion chromatography); (d) Sắc ký rây phân tử (size exclusion/gel permeation chromatography). Trong đó, sắc ký phân bố (SKPB) được ứng dụng nhiều nhất vì có thể phân tích được những hợp chất từ không phân cực đến những hợp chất rất phân cực, hợp chất ion có khối lượng phân tử không quá lớn (<3000). SKPB được chia thành hai loại dựa trên độ phân cực tương đối giữa pha tĩnh và pha động: sắc ký pha thường – SKPT (normal phase chromatography) và sắc ký pha đảo – SKPĐ (reversed phase chromatography). Trong SKPT, pha tĩnh sử dụng có độ phân cực cao hơn pha động. Pha tĩnh loại này sẽ có ái lực với các hợp chất phân cực. SKPT dùng để tách và phân tích các hợp chất có độ phân cực cao với phân tử lượng không lớn lắm. SKPĐ là thuật ngữ để chỉ một loại sắc ký trong đó pha tĩnh ít phân cực hơn pha động. Phương pháp này dùng phân tích các hợp chất từ không phân cực đến phân cực. Hầu hết các hợp chất hữu cơ có mạch carbon dài (ít phân cực) rất thích hợp cho phân tích bằng SKPĐ. Dung môi sử dụng trong SKPĐ là các dung môi phân cực, trong đó môi nước đóng vai trò quan trọng mà lại rẻ tiền. Do đó, SKPĐ được ứng dụng nhiều và phổ biến hơn SKPT. Trong sắc ký phân bố nói chung, pha tĩnh là những hợp chất hữu cơ được gắn lên chất mang rắn silica hoặc cấu thành từ silica theo

hai kiểu: (i) Pha tĩnh được giữ lại trên chất mang rắn bằng cơ chế hấp phụ vật lý → sắc ký lỏng-lỏng (liquid-liquid chromatography). (ii) Pha tĩnh liên kết hóa học với chất nền

→ sắc ký pha liên kết (bonded phase chromatography).

Trong luận án này thiết bị đo HPLC được trang bị cột C8, thành phần pha động sử dụng hỗn hợp nước/acetonitril (65:35 về thể tích) với tốc độ dòng 1,0 ml/phút và được đo detector có bước sóng λ = 280 nm.

2.3.12. Phương pháp von - ampe hòa tan anot [35, 52, 142, 149]

Năm 1922, J. Heyrovsky đã công bố công trình mô tả một phương pháp điện hóa mới – phép phân tích cực phổ và nó đã đặt cơ sở cho nhiều phương pháp phân tích điện hóa hiện đại, trong đó có phương pháp von – ampe hòa tan (SV), von - ampe hòa tan anot (ASV) là phương pháp đầu tiên và được phát triển mạnh mẽ vào những năm 1950.

Những năm sau đó, cùng với tiến bộ về công nghệ điện tử, phương pháp SV với kỹ thuật xung vi phân đã bắt đầu ứng dụng vào thực tiễn. Trong thập niên 1980, với thiết bị máy vi tính và phần mềm điều khiển đã được thương mại hóa rộng rãi và đến thập niên 1990, phương pháp von - ampe hòa tan anot xung vi phân (DP-ASV) và von - ampe hòa tan anot sóng vuông (SW-ASV) đã được ứng dụng rộng rãi ở một số quốc gia trên thế giới và được xem là một trong những phương pháp phân tích tiêu chuẩn để xác định đồng thời một số kim loại như: kẽm (Zn), cadimi (Cd), chì (Pb),… khi sử dụng điện cực giọt thủy ngân treo (HMDE) hoặc điện cực màng thủy ngân (MFE) [35, 142].

Tuy nhiên, tùy thuộc vào phương pháp SV và đối tượng phân tích mà nguyên tắc của phương pháp có khác nhau. Sau đây sẽ trình bày nguyên tắc chung của phương pháp von - ampe hòa tan anot.

Phương pháp von - ampe hòa tan anot (ASV) là một trong các phương pháp von

– ampe hòa tan và vì vậy, quá trình phân tích cũng bao gồm hai giai đoạn: giai đoạn làm giàu và giai đoạn hòa tan.

a. Giai đoạn làm giàu:

Bản chất của giai đoạn làm giàu là tập trung chất cần phân tích trong dung dịch lên trên bề mặt điện cực làm việc (WE) ở một thế và thời gian xác định. Trong giai

đoạn làm giàu, dung dịch được khuấy trộn đều bằng khuấy từ hoặc dùng điện cực rắn

đĩa quay. Quá trình tập trung chất phân tích lên trên bề mặt WE có thể bằng hai cách:

- Điện phân làm giàu: cách này thường được sử dụng để xác định trực tiếp các kim loại như Zn, Cd, Pb, Cu và Asen (As),… với các WE khác nhau [52, 149].

Khi đó phản ứng có thể xảy ra như sau:

+ Với điện cực rắn đĩa:

Men+ + ne–  Meo/WE (2.16)

+ Với điện cực giọt thủy ngân treo (HMDE):

Men+ + ne– + Hg  Meo/Hg (2.17)

+ Với điện cực màng thủy ngân (MFE):

Men+ + ne– + Hg2+ + 2 e–  Meo/MFE (2.18)

- Hấp phụ làm giàu: theo cách này thường được sử dụng để xác định trực tiếp các hợp chất hữu cơ. Các hợp chất hữu cơ có thể hấp phụ trực tiếp hoặc có thể tạo phức với ion kim loại rồi hấp phụ lên trên bề mặt WE [52]. Phản ứng trên điện cực có thể xảy ra như sau:

L(khử)  L(khử) (Ads) (2.19) Trong đó, L là chất hữu cơ và Ads là hấp phụ (Adsorptive)

Hoặc Men+ + L  MeLn+ + MeLn+ (Ads) (2.20)

Sau giai đoạn này, thế trên WE được giữ nguyên nhưng ngừng khuấy hoặc ngừng quay điện cực trong khoảng thời gian từ 2 s đến 30 s để chất phân tích phân bố đều và ổn định trên bề mặt điện cực làm việc.

b. Giai đoạn hòa tan:

Thực chất của giai đoạn hòa tan là hòa tan chất phân tích ra khỏi bề mặt WE bằng cách quét thế về phía dương hơn (gọi là quét anot). Trong giai đoạn này, quá trình xảy ra trên điện cực là ngược với giai đoạn làm giàu. Chẳng hạn với điện cực HMDE [35, 149]:

Meo/Hg  Men+ + ne– + Hg (2.21)

Hoặc tương ứng với giai đoạn hấp phụ làm giàu [52]:

L(khử) (Ads)  L(oxy hóa) + ne– (2.22)

MeLn+ (Ads)  Men+ + L(oxy hóa) + ne– (2.23)

Đồng thời với quá trình quét thế anot, tiến hành ghi tín hiệu hòa tan bằng một kỹ thuật von–ampe nào đó. Trong giai đoạn này, không khuấy dung dịch phân tích.

Nếu sử dụng kỹ thuật xung vi phân thì gọi là phương pháp DP-ASV, còn nếu dùng kỹ thuật sóng vuông thì gọi là SW-ASV đối với việc xác định kim loại [52, 149]. Riêng đối với quá trình làm giàu là hấp phụ thì được gọi là von – ampe hòa tan anot hấp phụ xung vi phân (DP-ASV) hoặc sóng vuông (SW-AdASV).

Trong phương pháp ASV, chọn thế điện phân làm giàu (Edep), người ta dựa vào phương trình Nernst hoặc một cách gần đúng có thể dựa vào giá trị thế bán sóng (E1/2) trên sóng cực phổ của chất phân tích.

Đường von – ampe hòa tan thu được có dạng đỉnh (peak). Thế đỉnh (Ep hay Up) và độ lớn của dòng đỉnh hòa tan (Ip) phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: thành phần nền (chất điện ly nền, pH, chất tạo phức,...), bản chất của điện cực làm việc, thế và thời gian điện phân làm giàu, điều kiện thủy động học (sự khuấy trộn hoặc quay điện cực,...) trong giai đoạn làm giàu, tốc độ quét thế trong giai đoạn hòa tan, kỹ thuật ghi đường von – ampe hòa tan [149]. Trong đó, Ep dùng để định tính và Ip dùng để định lượng chất phân tích.

Trong phương pháp ASV, có nhiều kỹ thuật khác nhau để ghi đường hòa tan như: kỹ thuật xung vi phân (DP), sóng vuông (SW), xung biến đổi đều (NP), dòng xoay chiều (AC),… Tùy theo đối tượng phân tích và điều kiện đo, mỗi kỹ thuật đều có các ưu điểm và hạn chế khác nhau.

Kỹ thuật von – ampe xung vi phân

Kỹ thuật von – ampe xung vi phân (DP) được dùng phổ biến nhất để ghi đường von – ampe hòa tan. Theo kỹ thuật này, những xung thế có biên độ như nhau khoảng từ 10 đến 100 mV và bề rộng xung không đổi khoảng từ 30 đến 100 ms được đặt chồng lên mỗi bước thế (hình 1.1).

Dòng được đo hai lần: trước khi nạp xung (I1) và trước khi ngắt xung (I2), khoảng thời gian đo dòng thông thường là từ 10 đến 30 ms. Dòng thu được là hiệu của hai giá trị dòng đó (Ip = I2 – I1) và Ip được ghi là hàm của thế đặt lên điện cực làm việc. Khi xung thế được áp vào, dòng tổng cộng trong hệ sẽ tăng lên do sự tăng dòng Faraday (If) và dòng tụ điện (Ic). Dòng tụ điện giảm nhanh hơn nhiều so với dòng Faraday vì:

0 -t/RC* -1/2

Ic ≈ Ic .e và If ≈ t ;

Ở đây, t - thời gian, R - điện trở, C* - điện dung vi phân của lớp kép.

I = I2 – I1

Ip

(b)

U

tmeas1 tmeas2

tmeas1 tmeas2

(I1)

(I2)

(I1) (I2)

U.am Ustart

Ustep

(a)

tpulse tstep

I

t Up U

Hình 2.7. a. Sự biến thiên thế theo thời gian và b. Đường von – ampe hoà tan

trong phương pháp DP-ASV

Trong đó, Uampl (mV): biên độ xung; Ustep (mV): bước thế; tpulse (ms): bề rộng xung; Ustart (mV): thế đầu; tstep (s): thời gian mỗi bước thế; Ip (nA): dòng đỉnh hòa tan; tmeas (ms): thời gian đo dòng; Up (mV): thế đỉnh hòa tan.

Theo cách ghi dòng như trên, dòng tụ điện ghi được trước lúc nạp xung và trước lúc ngắt xung là gần như nhau và do đó, hiệu số dòng ghi được chủ yếu là dòng Faraday. Như vậy, kỹ thuật von – ampe xung vi phân cho phép loại trừ tối đa ảnh hưởng của dòng tụ điện.

Kỹ thuật von – ampe sóng vuông

Theo kỹ thuật này, những xung sóng vuông đối xứng có biên độ nhỏ và không

đổi (khoảng 50/n mV) được đặt chồng lên mỗi bước thế (hình 2.8).

Trong mỗi chu kỳ xung, dòng được đo ở 2 thời điểm: thời điểm 1 (dòng dương I1) và thời điểm 2 (dòng âm I2). Dòng thu được là hiệu của hai giá trị dòng đó (Ip = I1 - I2) và Ip được ghi là hàm của thế đặt lên điện cực làm việc. Theo cách ghi dòng như vậy, kỹ thuật này loại trừ được tối đa ảnh hưởng của dòng tụ điện. Trong một số trường hợp, kỹ thuật von – ampe sóng vuông có độ nhạy cao hơn so với kỹ thuật von – ampe xung vi phân, nhưng LOD tương đương nhau.

U

tstep

tmeas (I1)

tmeas I

(I2)

I = I2 -

I1

Ustep

Uampl

Ip

Có thể bạn quan tâm!

• Tổng Quan Một Số Kết Quả Nghiên Cứu Cảm Biến Khí H2, Nh3 Và C2H5Oh Bằng Vật Liệu Bán Dẫn Trong Những Năm Gần Đây
• Một Số Công Trình Đã Được Công Bố Ứng Dụng Zno Để Xác Định Một Số Hợp Chất Hữu Cơ Bằng Phương Pháp Điện Hóa
• Giản Đồ Mức Năng Lượng Chỉ Ra Những Trạng Thái Liên Quan Đến Phổ Raman
• Sơ Đồ Tổng Hợp Nano La - Zno Dạng Que Bằng Phương Pháp Thủy Nhiệt
• Tổng Hợp Kiểm Soát Hình Thái Micro/nano Zno Từ Dạng Đĩa Đến Dạng Que Trong Hệ Kẽm Acetate – Ethanol – Nước Dùng Chất Hexamethylenetetramine (Hm) Tạo Môi
• A. Chỉ Số Hướng Mặt Phẳng Của Cấu Trúc Lục Lăng; B. Cấu Trúc Tinh Thể Lục Lăng

Xem toàn bộ 207 trang tài liệu này.

(b)

Ustart

(a)

tmodul = 1/Frequency

t

Up U

Hình 2.8. a. Sự biến thiên thế theo thời gian và b. Đường von – ampe hòa tan trong phương pháp SW-ASV

Trong đó, Uampl (mV): biên độ sóng vuông; Ustep (mV): bước thế; tmodul (ms): bề rộng sóng vuông; Ustart (mV): thế đầu; tstep (s): thời gian mỗi bước thế; Ip (nA): dòng đỉnh hòa tan; tmeas (ms): thời gian đo dòng; Up (mV): thế đỉnh hòa tan.

Để tiến hành phân tích bằng phương pháp von – ampe hòa tan nói chung và von

– ampe hòa tan anot nói riêng, người ta dùng hệ thiết bị gồm một máy cực phổ và một bình điện phân gồm 3 điện cực:

- Điện cực làm việc (WE) như điện cực rắn đĩa quay bằng kim loại hoặc vật liệu nền là cacbon, điện cực giọt thủy ngân tĩnh (SMDE), điện cực giọt thủy ngân treo (HMDE), điện cực màng kim loại (MeFE) hoặc điện cực biến tính,…

- Điện cực so sánh, thường là điện cực calomen hoặc bạc clorua.

- Điện cực phụ trợ, thường dùng là một điện cực platin (Pt).

Nắp bình điện phân còn có lỗ hổng để dẫn luồng khí trơ (N2, Ar ...) vào dung dịch phân tích để đuổi và loại oxy hòa tan trong dung dịch.

Các nghiên cứu bằng phương pháp DP-ASV sử dụng hệ thiết bị 693 VA Processor (Metrohm, Thụy Sỹ).

2.3.13. Phương pháp phân tích thống kê

2

Trong luận án này các phép phân tích kiểm định cặp t (paired sample t-test), kiểm định t một số (one sample-t-test), kiểm định t độc lập (independent t test), phân tích phương sai một chiều (one-way ANOVA) và hồi qui tuyến tính sử dụng phần mền SPSS-19 (Statistical Parkage of Social Sciences- Version 19). Hồi qui phi tuyến sử dụng để xác định các tham số của phương trình động học phản ứng bằng phương pháp bình phương tối thiểu. Điều này được thực hiện bằng cực tiểu hoá tổng bình phương sai lệch (Sum of the squares errors, SSE) bằng kỹ thuật tối ưu hoá. Hàm SSE cho cực tiểu hoá như sau:

N

SSE ( y

i1

exp

Yest )

(2.24)

Trong đó, yexp là giá trị thực nghiệm, yest là giá trị tính theo mô hình.

Hàm Solver trong Microsoft Excel được sử dụng để cực tiểu hoá. Để quá trình cực tiểu hoá được chính xác một số thông số của chương trình được mở rộng bằng cách nhấn nút Option trong hộp thoại Solver. Các thông số thay đổi như sau:

Interations=1x104, precision =1x10-7, tolerance = 5x10-4% và convergence =

1x10-9.

2.4. THỰC NGHIỆM

2.4.1. Hóa chất

Các loại hoá chất sau đây được sử dụng trong luận án này:

Bảng 2.1. Các loại hoá chất dùng trong luận án này

				khiết
1	Zinc acetate dihydrate	(CH3COO)2Zn. 2H2O	Merck, Đức	99,5%
2	Lanthanum nitrate hexahydrate	La(NO3)3.6H2O	Merck, Đức	99,5%
3	Sodium hydroxide	NaOH	Guang zhou, Trung Quốc	98%
4	Potassium hydroxide	KOH	Guang zhou, Trung Quốc	98%
5	Hydrochloric acid	HCl	Guang zhou, Trung Quốc	98%
6	Ethanol	C2H5OH	Merck, Đức	98%
7	Methanol	CH3OH	Merck, Đức	98%
8	Propanol	C3H7OH	Guang zhou, Trung Quốc	98%
9	Butanol	C4H9OH	Guang zhou, Trung Quốc	98%
10	Acetone	C3H6O	Guang zhou, Trung Quốc	98%
13	Acetonitrile	C2H3N	Guang zhou, Trung Quốc	98%
11	Hexamethylenetetramine	C6H12N4	Merck, Đức	99,9%
	Potassium dihydrogen		Kanto chemical Co,	99,9%

STT Tên hoá chất Công thức hoá học Công ty sản xuất

Độ tinh

12

phosphate

KH2PO4

Nhật Bản

14 Uric acid C5H4N4O3 Merck, Đức 99,9%

15 Dimethyl formamide C3H7ON Guang zhou, Trung Quốc 99%

16 Methyl blue C37H27N3Na2O9S3 Merck, Đức 99,9%

2.4.2. Phương pháp thực nghiệm

2.4.2.1. Phương pháp tổng hợp ZnO trong hệ kẽm acetate – dung dịch ethanol dùng hexamethylenetetramine (HM) làm chất tạo môi trường kiềm

Quy trình tổng hợp ZnO theo tài liệu tham khảo [154]. Quy trình tổng hợp nano ZnO trong dung môi có tỉ lệ 50 : 50 ethanol - nước như sau: Lấy 50 mL cồn tuyệt đối và 50 mL nước cất vào bình tam giác. Sau đó cho 0,2195 g kẽm acetate và 0,1402 g C6H12N4 vào, dùng đũa thủy tinh khuấy đều đến khi dung dịch đồng nhất. Lắp bình tam

giác chứa hỗn hợp trên vào sinh hàn rồi ổn nhiệt (bằng glyxerin) ở 90oC trong vòng 1

giờ 30 phút. Thu hồi kết tủa bằng cách lọc. Kết tủa được rửa nhiều lần bằng nước cất.