Giải Trình Tự Gen Sử Dụng Phương Pháp Thông Thường (Sanger) Nguyên Lý

Sơ đồ 2.2. Quá trình thực hiện xác định mức độ kháng oseltamivir của vi-rút cúm

Chủng chuẩn làm chứng

- Bộ chứng chuẩn được cung cấp bởi phòng thí nghiệm tham chiếu của TCYTTG tại Melbourne –Úc

Vi rút

Phân típ	Giá trị IC50 (nM)
A/Mississippi/03/2001	A(H1N1)	0,5
A/Mississippi/03/2001	A(H1N1)	3455
A/Perth/265/2009	A(H1N1pdm09)	0,6
A/Perth/261/2009	A(H1N1pdm09)	2179
A/Fukui/20/2004	A(H3N2)	0,2
A/Fukui/45/2004	A(H3N2)	42,3

Có thể bạn quan tâm!

• Tình Hình Kháng Thuốc Của Vi Rút Cúm A Với Thuốc Kháng Vi Rút
• Kỹ Thuật Xác Định Mức Độ Kháng Oseltamivir Dựa Trên Hoạt Động Của Neuraminidase
• Xác Định Mức Độ Kháng Thuốc Của Vi Rút Cúm Với Oseltamivir Nguyên Lý
• Xác Định Giá Trị Ic50 Ngưỡng Của Các Phân Típ Vi Rút Cúm A
• Sự Tương Tác Của Oseltamivir Với Các Vi Rút Cúm A/h3N2
• Sự Tương Đồng Về Phân Đoạn Gen Mã Hóa Ha Và Na Giữa Các Vi Rút Cúm A Có Biểu Hiện Giảm Độ Nhạy Osletamir Với Các Vi Rút Cùng Phân Típ Lưu Hành Trong

Xem toàn bộ 147 trang tài liệu này.

Nhận định kết quả

Kết quả sau khi xác định giá trị IC50 được nhận định dựa theo bảng nhận định kết quả của Tổ chức Y tế Thế giới.

Nhận định giá trị IC50 của vi rút cúm

Kết quả Cúm A Cúm B

Từ ngưỡng ức chế bình thường

Thuốc ức chế vi rút mức bình thường

< 10 lần	< 5 lần
Giảm hiệu quả ức chế vi rút của thuốc kháng vi	10-100 lần	5 - 50 lần
rút

Giảm mạnh hiệu quả ức chế vi rút của thuốc kháng vi rút

>100 lần > 50 lần

Nguồn: WHO Weekly epidemiological record, Sep 2012

Ngưỡng ức chế bình thường của thuốc kháng vi rút (oseltamivir) được xác định trong quá trình thực hiện dựa trên các giá trị IC50 của các vi rút cúm. Mỗi típ/phân típ vi rút cúm khác nhau có ngưỡng ức chế bình thường khác nhau.

2.3.2.3. Giải trình tự gen sử dụng phương pháp thông thường (Sanger) Nguyên lý

Sự xuất hiện của các di-deoxynucleotide (các nucleotide mất gốc -OH ở vị trí Cac-bon 3' và được thay bằng -H, đã được đánh dấu huỳnh quang với các màu khác nhau) trong quá trình tổng hợp DNA bổ sung (mẫu gen cần giải trình tự ở dạng DNA sợi đơn) tạo ra những đoạn DNA có độ dài khác nhau. Khi nucleotide gắn huỳnh quang được gắn vào đoạn DNA bổ sung, quá trình tổng hợp DNA bổ sung sẽ bị dừng lại.Mỗi đoạn DNA mang một nucleotide gắn huỳnh quang ở điểm cuối. này được điện di qua mao quản từ kích thước nhỏ đến lớn và các dideoxynucleotide được phát hiện bởi đầu đọc laser. Trình tự gen của mẫu chính là trình tự bổ sung các dideoxynucleotide được phát hiện bởi đầu đọc laser.

Quá trình thực hiện nói chung bao gồm:

- Tạo sản phẩm PCR

- Tinh sạch sản phẩm PCR

- Chu trình nhiệt tạo đoạn DNA đơn gắn các dideoxynucleotide

- Tinh sạch sản phẩm đã gắn các dideoxynucleotide

- Điện di qua mao quản và đọc trình tự bởi đầu đọc laser.

Tạo đoạn DNA bổ sung

* Các bước tiến hành

Tạo hỗn hợp 1

Sinh phẩm 1 phản ứng Mồi Uni 12 (10nM) 5µl

dNTPs 1µl

RNA 10µl

Ủ 65oC/ 5phút, giữ lạnh

Tạo hỗn hợp 2

Sinh phẩm 1 phản ứng

Đệm x5 5µl

DTT 1µl

RNase inhibitor 1µl

SuperscriptIII RT enzyme 1µl Giữ lạnh

Trộn hỗn hợp 1 và 2 ủ tại nhiệt độ 50oC/45phút và 70oC/15 phút; sau đó lưu giữ tại

-20oC làm mẫu cho phản ứng PCR khuếch đại phân đoạn gen mã hóa NA.

Khuếch đại phân đoạn gen mã hóa NA

*Tạo hỗn hợp sinh phẩm cho phản ứng PCR

Sinh phẩm 1 phản ứng

Đệm 10x 10 µl

Mồi xuôi (100nM) 0.5 µl

Mồi ngược (100 nM) 0.5 µl

HotStar Taq 2 µl

Nước tinh sạch 29µl

cDNA 8 µl

Tổng 50 µl

Mồi sử dụng cho phân đoạn gen mã hóa NA: Ba-NA-1F, Ba-NA-1413 R

* Chu trình chạy

Nhiệt độ/ Thời gian Chu kỳ

95oC/5phút 1 vòng

94oC/15 giây 48oC/1 phút 68oC/2 phút

35 vòng

68oC/10 phút 1 vòng

4oC Giữ cho tới bước tinh sạch tiếp theo

Tinh sạch sản phẩm PCR

Mục đích: Loại bỏ những đoạn mồi thừa và sinh phẩm sẽ gây nhiễu trong quá trình giải trình tự phân đoạn gen mã hóa HA và NA. Sản phẩm PCR sau khi điện di cho nhiều băng, trong đó có băng sản phẩm cần giải trình tự gen, cần tiến hành tinh sạch sản phẩm trên thạch.

* Các bước tiến hành:

- Cắt băng DNA đặc hiệu trên thạch. Cho thạch vào tuýp 1,5ml hoặc 4,5ml.

- Xác định trọng lượng của miếng thạch. Trộn 3 thể tích đệm QG với 1 thể tích miếng thạch chứa DNA có độ dài từ 70bp - 10kb. Ủ tại 50oC trong 10 phút cho tới khi thạch hoà tan hết. Lắc tuýp mỗi 2 phút trong quá trình ủ. Kiểm tra dung dịch có màu vàng trong trước khi tiến hành bước tiếp theo.

- Nhỏ dung dịch nói trên vào cột lọc. Ly tâm 13.000vòng/1 phút. Loại bỏ nước thu được. Quá trình được lặp lại cho tới khi hết dung dịch.

- Lần ly tâm cuối cùng cho 500µl QG vào cột lọc, ly tâm 13.000vòng/1 phút.

- Rửa DNA bằng 750µl đệm PE, ly tâm 13.000vòng/1 phút. Ly tâm thêm 1 lần nữa sau khi loại bỏ nước thu được.

- Chuyển cột lọc sang tuýp 1,5ml sạch, cho 30µl đệm EB vào chính giữa cột, ủ

tại nhiệt độ phòng trong vòng 1 phút sau đó ly tâm 13.000vòng/1 phút.

- DNA tinh sạch giữ ở -20oC đến -80oC.

Chu trình nhiệt tạo đoạn DNA gắn các dideoxynucleotide

* Tạo hỗn hợp sinh phẩm cho phản ứng

Sinh phẩm Thể tích

Terminator Ready Reaction Mix 8µl

Tuỳ theo chất lượng mà lấy thể tích

Mẫu

khác nhau

Mồi (3,2 pmol) xuôi hoặc ngược 1µl

Nước tinh sạch X µl

Tổng 20µl

* Xác định hàm lượng DNA trong mẫu theo thang DNA chuẩn

* Lượng DNA được tính theo bảng sau:

Mẫu

(sản phẩm PCR)

Số lượng

Hình 2.1. Thang chỉ thị phân tử chuẩn 1 kb Invitrogen

100-200bp 1-3ng

200-500bp 3-10ng

500-1000bp 10-40ng

>2000bp 20-50ng

* Chu trình nhiệt:

Nhiệt độ/ Thời gian Chu kỳ

96oC/ 1 phút 1 vòng

96 oC/ 10giây 25 vòng

50 oC/ 5 giây

60 oC/ 4 phút

4 oC Giữ cho tới bước tinh sạch tiếp theo

Sinh phẩm được trộn trong từng tuýp 0,2 ml riêng rẽ, ly tâm ngắn trước khi cho vào máy.

Tinh sạch sản phẩm sau khi chạy chu trình nhiệt gắn dideoxynucleotide

Mục đích: Loại bỏ những dideoxynucleotide thừa và sinh phẩm sẽ gây nhiễu trong quá trình giải trình tự phân đoạn gen mã hóa NA.

* Các bước tiến hành:

- Lắc nhẹ nhàng cột DyeEx 2.0 Spin

- Nới lỏng nắp cột

- Loại bỏ phần dưới cột DyeEx 2.0 Spin, đặt cột vào tuýp thu 2ml

- Ly tâm 8000 vòng / 2- 3 phút loại bỏ dung dịch bảo quản gel

- Chuyển cột DyeEx 2.0 Spin sang tuýp 1,5ml sạch.

- Dùng pipet cho toàn bộ sản phẩm vào cột gel

- Ly tâm 8000 vòng / 2-3 phút

- Loại bỏ cột DyeEx 2.0 Spin

- Làm khô và chuẩn bị đưa vào máy giải trình tự gen. Trong trường hợp không

đưa vào máy ngay, có thể giữ mẫu đã làm khô ở -20oC không quá 24h.

Điện di qua mao quản và đọc trình tự bởi đầu đọc laser

* Chuẩn bị mẫu điện di:

- Cho 10µl HiDi Formamide vào tuýp 1,5ml chứa DNA sau khi tinh sạch ở bước 2 (khi cho vào trộn nhẹ nhàng bằng pipet)

* Chuyển mẫu vào máy:

- Chuyển toàn bộ sản phẩm sang đĩa 96 giếng (dành riêng cho máy ABI 3130)

- Ủ tại nhiệt 96oC/5 phút

- Sau đó chuyển ngay vào giá giữ lạnh.

- Chuyển đĩa 96 giếng vào máy ABI 3130

2.4. Phân tích số liệu

2.4.1. Phân tích kết quả, xác định ngưỡng và mức độ kháng oseltamivir của vi rút cúm

Các giá trị IC50 thu được sau khi thực hiện thí nghiệm được xử lý bằng phần mềm JASPR được cung cấp bởi CDC-Altanta Hoa Kỳ. Giá trị ngưỡng và mức độ kháng oseltamivir của vi rút cúm được xác định và phân tích thông qua phần mềm Graphpad Prism 6.0.2, Hoa Kỳ.

2.4.2. Phân tích kết quả giải trình tự gen

Trình tự nucleotide phân đoạn gen mã hóa NA và HA của các vi rút sau khi được giải trình tự được phân tích sự tương đồng và các điểm đột biến liên quan đến kháng thuốc bởi phần mềm DNASTAR, Winscosin, USA, Bioedit phiên bản 7.2.3; cây gia hệ phân đoạn gen mã hóa HA và NA được xây dựng bằng phần mềm MEGA5 sử dụng phương pháp Maximum Likelihood [59]. Các trình tự phân đoạn gen HA và NA tham chiếu thuộc các phân típ vi rút tương ứng được thu thập từ ngân hàng dữ liệu DNA (www.ncbi.com).

CHƯƠNG III - KẾT QUẢ

3.1. Các vi rút cúm A thu thập trong giai đoạn từ 2001 - 2012

Từ năm 2001 đến 2012, tổng số 342 vi rút cúm A được thu thập với các phân típ A/H1N1, A/H1N1 đại dịch 09 (A/H1N1pdm09), A/H3N2 và A/H5N1. Số lượng và tỷ lệ của các phân típ vi rút cúm A thay đổi theo từng năm và phụ thuộc vào sự lưu hành của vi rút cúm trong giai đoạn nghiên cứu [1, 5]. Trong các năm 2001, 2002 và 2006, chỉ thu thập được vi rút cúm thuộc phân típ A/H1N1; năm 2012 chỉ thu thập được vi rút A/H3N2. Trong khi năm 2003, có cả 3 phân típ vi rút cúm bao gồm H1N1 (74%), H3N2 (21%) và H5N1 (5%) được thu thập. Tương tự, phân típ H3N2 và H5N1 là hai phân típ cúm thu được trong năm 2004, 2005và 2007.

Bảng 3.1. Phân bố theo năm các phân típ vi rút cúm A sử dụng trong nghiên cứu

Năm

A/H1N1		A/H1N1pdm09		A/H3N2		A/H5N1		Tổng (N)
N	(n/N)%	n	(n/N)%	n	(n/N)%	n	(n/N)%
2001	8	100	-	-	-	-	-	-	8
2002	4	100	-	-	-	-	-	-	4
2003	14	74	-	-	4	21	1	5	19
2004	-	-	-	-	13	76,4	4	23,6	17
2005	-	-	-	-	2	40	3	60	5
2006	3	100	-	-	-	-	-	-	3
2007	-	-	-	-	16	66,7	8	33,3	24
2008	7	54	-	-	1	7,7	5	38,3	13
2009	6	4,5	86	65,1	36	27,3	4	3,1	132
2010	-	-	13	46,4	12	42,9	3	10,7	28
2011	-	-	58	98,3	1	1,7	-	-	59
2012	-	-	0	0	30	100	-	-	30
Tổng	42		157		115		28		342

n: Số lượng vi rút thu được theo từng năm của mỗi phân típ N:Số lượng vi rút thu được theo năm

Xem tất cả 147 trang.