Năm 2008, vi rút H1N1 có mặt với chủng đại diện chiếm 54% số chủng trong năm, 38,3% thuộc vi rút H5N1 và 7,7% là vi rút H3N2. Với sự có mặt của H1N1pdm09 từ cuối tháng 5 năm 2009, năm 2009 có số chủng thu được thuộc bốn phân típ tương đương bốn phân típ cúm lưu hành với tỉ lệ 4,5% H1N1, 65,1%H1N1pdm09, 27,3% H3N2 và 3,1% H5N1. Số chủng thu được năm 2010 bao gồm ba phân típ 46,4% H1N1pdm09, 42,9% H3N2 và 10,7% H5N1. Với sự vắng mặt của H5N1 năm 2011, số chủng cúm thu được trong năm này chỉ gồm hai phân típ H1N1pdm09 với tỉ lệ 98,3% và 1,7% H3N2 (Bảng 3.1). Theo thời gian thực hiện nghiên cứu, số lượng các vi rút lưu hành trong năm cũng như ưu thế của từng phân típ vi rút thể hiện sự khác nhau. Phân típ vi rút A/H1N1 chiếm tỷ lệ tuyệt đối (100%) trong các năm 2001, 2002 và 2006, và giảm trong năm 2003 (74%), 2008 (54%). 2009 (4,5%) và hoàn toàn không xuất hiện trong các năm sau (Bảng 3.1). Sự xuất hiện lần đầu tiên của phân típ A/H1N1pdm09 vào năm 2009 với tỷ lệ 65,1% (2009), 46,4% năm 2010, 98,3% năm 2011 và không phát hiện trong năm 2012. Phân típ A/H3N2 không có đại diện trong nghiên cứu tại các năm 2001, 2002, 2006 (0%) nhưng là phân típ vi rút có mặt hầu hết trong các năm nghiên cứu (9/12 năm) với tỷ lệ dao động từ 1,7% (2011) đến 100% (2012). Với vi rút cúm gia cầm A/H5N1, lần đầu tiên được ghi nhận gây bệnh cho người vào năm 2003 [115] cũng có mặt trong nghiên cứu (5%) và tiếp tục xuất hiện với tỷ lệ dao động từ 3,1% (2009) đến 60% (2005). Vi rút A/H5N1 không xuất hiện tại miền Bắc Việt Nam vào các năm 2006, 2011 và 2012 (Bảng 3.1)
3.2. Xác định giá trị IC50 ngưỡng của các phân típ vi rút cúm A
Sử dụng phần mềm JASPR và Graphpad prism chúng tôi xác định giá trị IC50 trung bình và sự phân bố của các giá trị qua biểu đồ hình hộp và tia (box&whiskers), biểu đồ phân bố độ tập trung. Biểu đồ 1 dạng box&whiskers thể hiện giá trị nhỏ nhất, giá trị lớn nhất và khoảng liên tứ phân vị của các giá trị IC50 được quy ra log10. Toàn bộ vi rút sử dụng trong nghiên cứu được sử dụng để xác định giá trị ngưỡng cho từng phân típ, tuy nhiên phần mềm Graphad prism tự động
loại bỏ các cá thể có những giá trị vượt ngoài khoảng liên tứ phân vị (IQR) vì vậy số vi rút sử dụng trong xây dựng giá trị ngưỡng không tương đồng với tổng số vi rút sử dụng trong nghiên cứu, cụ thể: số vi rút cúm A/H1N1 sử dụng là 30/42 vi rút; A/H1N1pdm09 là 152/157 vi rút; riêng vi rút A/H5N1 số lượng là 21/28 vi rút do có 4 chủng không đủ điều kiện thực hiện thử nghiệm ức chế neuraminidase và 3 chủng có giá trị IC50 vượt ngoài khoảng liên tứ phân vị (Bảng 3.2).
Quan sát biểu đồ cho thấy phần lớn các giá trị IC50 của các vi rút tập trung trong khoảng giữa tứ phân vị thứ 1 (Q1) và tứ phân vị thứ 3 (Q3).
Giá tr l n nh t
Q3
Trung
Q1
Giá tr nh nh t
vị (Q2)
Biểu đồ 3.1. Sự phân bố giá trị IC50 của toàn bộ các chủng cúm A, 2001-2012 (biểu
đồ box and whiskers - giá trị trung vị và 2 giá trị lớn nhất, nhỏ nhất - GraphPad Prism)
Cho dù có sự phân tán lẻ tẻ của giá trị IC50 trong mỗi biểu đồ của từng phân típ vi rút nhưng độ tập trung của số đông vẫn được ghi nhận, vì vậy, kết hợp với phân tích tứ phân vị, chúng tôi có thể xác định được giá trị IC50 ngưỡng của các vi rút tương đương với giá trị trung bình IC50 và giá trị trung vị (Q2).
Bảng 3.2. Giá trị IC50 trung bình của các phân típ cúm A thực hiện trong nghiên cứu và giá trị IC50 của các vi rút trong bộ chứng chuẩn [114].
Số vi rút | Giá trị IC50 trung bình (nM) | |
A/H1N1 | 30/42 | 0,413 |
A/H1N1pdm09 | 152/157 | 0,334 |
A/H3N2 | 115/115 | 0,164 |
A/H5N1 | 21/28 | 2,947 |
Vi rút chứng | Giá trị IC50 (nM) | |
A/Mississippi/03/2001 (A/H1N1) | 0,5 | |
A/Perth/265/2009 (A/H1N1pdm09) | 0,6 | |
A/Fukui/20/2004 (A/H3N2) | 0,2 | |
A/Vietnam/1194/2004# (A/H5N1) | 1,3 | |
Có thể bạn quan tâm!
-
Kỹ Thuật Xác Định Mức Độ Kháng Oseltamivir Dựa Trên Hoạt Động Của Neuraminidase -
Xác Định Mức Độ Kháng Thuốc Của Vi Rút Cúm Với Oseltamivir Nguyên Lý -
Giải Trình Tự Gen Sử Dụng Phương Pháp Thông Thường (Sanger) Nguyên Lý -
Sự Tương Tác Của Oseltamivir Với Các Vi Rút Cúm A/h3N2 -
Sự Tương Đồng Về Phân Đoạn Gen Mã Hóa Ha Và Na Giữa Các Vi Rút Cúm A Có Biểu Hiện Giảm Độ Nhạy Osletamir Với Các Vi Rút Cùng Phân Típ Lưu Hành Trong -
Sự Tương Đồng Về Gen Giữa Các Chủng Cúm A/h1N1Pdm09 Giảm Độ Nhạy Cảm Oseltmivir Với Các Chủng Cúm A/h1N1Pdm09 Trên Thế Giới
Xem toàn bộ 147 trang tài liệu này.
# : Bộ chứng chuẩn không bao gồm H5N1, chủng chứng được sử dụng là chủng nằm trong nghiên cứu
3.2.1. Xác định giá trị ngưỡng của vi rút cúm A/H1N1
Giá trị ức chế 50% (IC50) của 30 chủng vi rút cúm A/H1N1 trong nghiên cứu có giá trị trung bình dao động trong khoảng 0,061 – 0,765nM. Độ tập trung của giá trị IC50 được biểu thị qua biểu đồ 3.2 với log10 giá trị IC50 cho thấy tổng số 30/42 cá thể có giá trị IC50 nằm dưới giá trị IC50 trung bình (0,413nM) và 12 cá thể còn lại có IC50 lớn hơn giá trị trung bình. Toàn bộ số cá thể này đều nằm trong trong khoảng giữa tứ phân vị thứ 1 (Q1) và tứ phân vị thứ 3 (Q3). So sánh với vi rút chuẩn A/Mississippi/03/2001 (A/H1N1) có giá trị IC50 là 0,5nM cũng nằm trong nhóm đông của vi rút nghiên cứu, vì vậy giá trị IC50 ngưỡng được xác định cho phân típ vi rút A/H1N1 trong nghiên cứu này chính là giá trị IC50 trung bình đã được xác định là 0,413 ± 0.352 nM (Biểu đồ 3.2)
Giá trị trung bình
Biểu đồ 3.2. Độ tập trung các giá trị IC50 của các chủng A/H1N1 trong nghiên cứu
3.2.2. Xác định giá trị ngưỡng của vi rút cúm A/H1N1pdm09
Với các chủng A/H1N1pdm09, sự dao động giá trị IC50 trong tổng số 152 vi rút được phân tích không nhiều, độ tập trung cao của 147/ 152 vi rút xung quanh giá trị IC50 trung bình 0,334nM được ghi nhận tại biểu đồ 3.3, tương tự giá trị IC50 của vi rút tham chiếu chuẩn A/Perth/265/2009 (A/H1N1pdm09) là 0,6nM, vì vậy giá trị ngưỡng của vi rút được xác định là 0,334 ± 0,286 nM.(Biểu đồ 3.3.)
Giá trị trung bình
Biểu đồ 3.3. Độ tập trung các giá trị IC50 của các chủng A/H1N1pdm09 trong nghiên cứu
3.2.3. Xác định giá trị ngưỡng của vi rút cúm A/H3N2
Tổng số 115 chủng vi rút thuộc phân típ A/H3N2 có giá trị IC50 vi rút trung bình dao động từ 0,04 đến 0,29 nM . Biểu đồ 4 cho thấy sự tập trung cao xung quanh giá trị IC50 trung bình 0,164 nM , tương đương với giá trị IC50 0,2 nM của vi rút tham chiếu chuẩn A/Fukui/20/2004 (A/H3N2), vì vậy giá trị IC50 ngưỡng của phân típ vi rút cúm A/H3N2 được xác định là 0,164 ± 0,126 nM. (Biểu đồ 3.4.)
Giá trị trung bình
Biểu đồ 3.4. Độ tập trung các giá trị IC50 của các chủng A/H3N2 trong nghiên cứu
3.2.4. Xác định giá trị ngưỡng của vi rút cúm A/H5N1
Tổng số 21/28 chủng vi rút cúm A/H5N1 được chấp nhận phân tích kết quả theo chương trình Graphpad prism. Phân tích cụ thể theo từng cá thể cho thấy giá trị IC50 nhỏ nhất là 0,13 nM, giá trị lớn nhất là 8,98 nM đã được ghi nhận. Khoảng cách giữa các giá trị IC50 đã được biểu hiện trên biểu đồ 3.5 cho thấy số vi rút A/H5N1 có giá trị IC50 tập trung gần hoặc dưới giá trị IC50 trung bình 2,947 nM chiếm đa số (17/21), giá trị IC50 của chủng vi rút tham chiếu chuẩn A/Vietnam/1194/2003 (A/H5N1) là 1,3 nM, thấp hơn giá trị trung bình của các vi rút trong nghiên cứu. Giá trị ngưỡng của phân típ cúm A/H5N1 được xác định sẽ là 2,947 ± 2,539 nM (Biểu đồ 3.5)
Biểu đồ 3.5. Độ tập trung các giá trị IC50 của các chủng A/H5N1 trong nghiên cứu
Như vậy, chúng tôi đã xác định được giá trị ngưỡng của các phân típ vi rút cúm A trong nghiên cứu là:
Phân típ vi rút cúm Giá trị IC50 ngưỡng
Vi rút A/H1N1 0,413 ± 0.352 nM
Vi rút A/H1N1pdm09 0,334 ± 0,286 nM
Vi rút A/H3N2 0,164 ± 0,126nM
Vi rút A/H5N1 2,947 ± 2,539 nM
3.3. Sự tương tác của oseltamivir với các vi rút cúm A
3.3.1. Sự tương tác của oseltamivir với các vi rút cúm A/H1N1
Tổng số 42 vi rút A/H1N1 lưu hành từ năm 2001 đến 2009 được thu thập, sử dụng thử nghiệm ức chế neuraminidase (NAI), chúng tôi đã xác định được 12 vi rút A/H1N1 có giá trị IC50 cao hơn giá trị ngưỡng trong nghiên cứu. Toàn bộ các vi rút này được xác định là vi rút lưu hành trong năm 2008 và 2009 (Bảng 3.3).
Bảng 3.3. Giá trị IC50 của các chủng A/H1N1 kháng oseltamivir năm 2008 và 2009
Tên chủng/Số chủng | Giá trị IC50 (nM)±SD | Giá trị IC50 ngưỡng | Giá trị IC50/ Giá trị IC50 ngưỡng | |
2001 | 8 | 0,28 ± 0,09 | 0,413 | 0,68 |
2002 | 4 | 0,51 ± 0,32 | 1,23 | |
2003 | 14 | 0,33 ± 0,14 | 0,79 | |
2006 | 3 | 1,06 ± 0,09 | 2,57 | |
2008 | A/Vietnam/TX285/08 | 534,23 ± 3,58 | 1294 | |
A/Vietnam/TB289/08 | 1624,44 ± 4,52 | 3933 | ||
A/Vietnam/TX200/08 | 456,11 ± 5,38 | 1104 | ||
A/Vietnam/TX233/08 | 453,28 ± 9,39 | 1097 | ||
A/Vietnam/BT241/08 | 678,45 ± 6,12 | 1643 | ||
A/Vietnam/LS324/08 | 59,98 ± 2,35 | 145 | ||
2009 | A/Vietnam/32036/09 | 704,20 ± 4,80 | 1705 | |
A/Vietnam/EL197/09 | 581,24 ± 4,78 | 1407 | ||
A/Vietnam/Q271/09 | 464,86 ± 6,49 | 1126 | ||
A/Vietnam/31808/09 | 527,95 ± 15,75 | 1278 | ||
A/Vietnam/34381/09 | 575,72 ± 5,81 | 1273 | ||
A/Vietnam/N116/09 | 565,95 ± 11,17 | 1370 | ||
Chứng | A/Mississippi/03/2001 | 458,2 | 1109 |
Các năm trước đó, vi rút cúm A/H1N1 được xác định là nhạy cảm với oseltamivir, khi các giá trị IC50 nằm trong giới hạn ngưỡng ức chế bình thường của oseltamivir đối với vi rút H1N1. Đối với số vi rút cúm A/H1N1 (11 vi rút) trong năm 2008 và 2009 có giá trị IC50 cao hơn giá trị IC50 ngưỡng trên 1000 lần, đặc biệt một chủng A/Vietnam/TB289/08 có giá trị IC50 1624,44 nM cao gấp 3933 lần giá trị ngưỡng. Tuy cũng có biểu hiện kháng nhưng A/Vietnam/LS324/08 có giá trị IC50 59,98nM tương đương gấp hơn 100 lần giá trị ngưỡng.
3.3.2. Sự tương tác của oseltamivir với các vi rút cúm A/H1N1pdm09
Trong quá trình nghiên cứu, chúng tôi xác định được hai chủng cúm A/H1N1pdm09 là A/Vietnam/33419/09 có giá trị IC50 125.99nM năm 2009 và A/Vietnam/36530/11 127.91nM năm 2011 có giá trị IC50 tăng từ 350 – 400 lần so với giá trị IC50 ngưỡng của vi rút H1N1pdm09 (Bảng 3.4).
Ngoài ra, số liệu trong bảng 3.4 còn thể hiện giá trị IC50 của ba chủng H1N1pdm09 đã được thực hiện năm 2009 [58]. So với giá trị IC50 ngưỡng, ba chủng H1N1pdm09 này đều có giá trị IC50 cao trên 1000 lần.
Bảng 3.4. Giá trị IC50 của các chủng A/H1N1pdm09 kháng oseltamivir
năm 2009 và 2011
Tên chủng | Giá trị IC50 (nM)±SD | Giá trị IC50 ngưỡng | Giá trị IC50/ Giá trị IC50 ngưỡng | |
2009 | A/Vietnam/32043/09 | 429,5 ± 10,25 | 0,334 | 1422 |
A/Vietnam/32060/09 | 323,66 ± 12,68 | 1072 | ||
A/Vietnam/32067/09 | 889,2 ± 9,73 | 2944 | ||
A/Vietnam/33419/09 | 125,99 ± 13,44 | 417 | ||
2011 | A/Vietnam/36530/11 | 127,91 ± 9,84 | 356 | |
Chứng | A/Perth/261/2009 | 191,2 | 572 |