Mức Độ Và Tỉ Lệ Các Vi Rút Cúm A Giảm Độ Nhạy Cảm Với Oseltamivir Thông

Số lượng 342 chủng cúm A thu được trong nghiên cứu trong giai đoạn 2001- 2012 với các phân típ đại diện cho từng năm lưu hành đã đảm bảo tính bao quát của nghiên cứu. Với số lượng 42 vi rút cúm A/H1N1; 157 vi rút cúm A/H1N1pdm09; 115 vi rút cúm A/H3N2 và 28 vi rút cúm A/H5N1 phản ánh quy mô của hoạt động giám sát cúm tại Việt Nam. Trong giai đoạn 2001-2005, giám sát cúm chưa thành hệ thống, chỉ được thực hiện tại một số điểm giám sát của Hà Nội vì vậy số lượng vi rút thu thập trong các năm này thấp dao động từ 4 vi rút (2001) đến 19 vi rút (2003), trong khi số vi rút thu thập tại các năm sau đó cao hơn từ 24 vi rút (2007) đến 132 vi rút (2009) sau khi hệ thống giám sát cúm quốc gia hình thành với sự tăng số điểm giám sát thường xuyên (Bảng 3.1). Tỷ lệ của các phân típ vi rút thu thập trong từng năm của nghiên cứu tương đồng tỷ lệ lưu hành các phân típ vi rút cúm A trong kết quả giám sát (Bảng 3.1, Biểu đồ 5.1). Tuy nhiên, nghiên cứu sử dụng vi rút phân lập từ bệnh phẩm lâm sàng dương tính với RT-PCR, vì vậy một số phân típ vi rút sẽ không có mặt trong nghiên cứu khi sự lưu hành của phân típ này với tỷ lệ quá thấp, ví dụ năm 2012 có ghi nhận sự lưu hành của A/H1N1pdm09 (Biểu đồ 5.1), nhưng không phân lập được vi rút (Bảng 3.1). Vì vậy kết quả nghiên cứu tuy mang tính tổng quan nhưng chưa thực sự đại diện và đầy đủ, do đó việc nâng cao hiệu quả của công tác phân lập vi rút là rất cần thiết trong những nghiên cứu tiếp theo.

Song hành với các vi rút cúm mùa, vi rút cúm gia cầm A/H5N1 được xác định gây bệnh trên người từ năm 1997 và bùng phát năm 2003 với tỉ lệ tử vong cao. Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới, tại Việt Nam tính đến năm 2013 có 125 ca mắc và 62 ca tử vong (49,6%) [115]. Khác với các vi rút cúm mùa, sự xuất hiện vi rút A/H5N1 tại Việt Nam không theo chu kỳ và được xác định có liên quan đến sự nhiễm cúm trên đàn gia cầm [55, 75, 123]. Tổng số 28 chủng vi rút cúm A/H5N1 thu thập trong nghiên cứu được tập trung vào các năm 2004, 2007 và 2008; không thu thập được trong các năm 2006, 2011 và 2012 (Bảng 3.1). Trong năm 2006, không ghi nhận trường hợp nhiễm cúm A/H5N1 tại Việt Nam, tiếp theo các năm 2011 và 2012 số người nhiễm vi rút cúm A/H5N1 có được ghi nhận tại Việt Nam,

tuy nhiên các trường hợp này chỉ được xác định tại khu vực phía Nam [115]. Như vậy, kết quả thu thập vi rút cúm gia cầm A/H5N1 trong nghiên cứu này đã phản ánh đúng tình hình nhiễm cúm A/H5N1 trên người tại miền Bắc Việt Nam trong giai đoạn 2003-2012.

4.2. Mức độ và tỉ lệ các vi rút cúm A giảm độ nhạy cảm với oseltamivir thông qua giá trị ức chế 50% (IC50)

4.2.1 Giá trị IC50 ngưỡng của các chủng cúm A lưu hành tại miền Bắc Việt Nam

Phương pháp xác định giá trị ức chế 50% (IC50) của oseltamivir bằng thử nghiệm ức chế neuraminidase (chất phát quang flouroresence) với các vi rút cúm A lần đầu tiên được áp dụng tại PTN cúm viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương với mục đích xác định giá trị ngưỡng (IC50) của từng típ/phân típ vi rút cúm để từ đó có thể xác định mức độ giảm độ nhạy hoặc kháng oseltamivir của vi rút cúm A lưu hành tại Việt nam theo thường quy của TCYTTG.

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 147 trang tài liệu này.

Từ những kết quả thu được trong nghiên cứu cho thấy sự tương tác của oseltamivir tới mỗi phân típ vi rút cúm khác nhau không giống nhau cho dù có cùng kiểu dạng protein NA thể hiện ở giá trị IC50 trung bình cho các phân típ vi rút cúm mang protein NA1 lưu hành tại Việt Nam (Bảng 3.2). Kết quả của chúng tôi phù hợp với những nghiên cứu trước đó tại Úc, Anh và Nhật [36, 79, 104, 122]. Tại Anh, giá trị IC50 trung bình của vi rút cúm A/H1N1 và A/H3N2 lần lượt là 0,45- 1,73 nM và 0,2-0,94 nM [122]. Sự khác nhau này có thể giải thích do mỗi vi rút cúm xâm nhập vào các quần thể người khác nhau có thể tạo ra các biểu hiện kiểu hình (phenotype) khác nhau trong quá trình tiến hóa. Ngoài ra, sự khác nhau về giá trị ngưỡng của típ/phân típ vi rút cúm có thể do mỗi neuraminidase của từng loại cúm có sự tương tác khác nhau với oseltamivir, điển hình là vi rút cúm B, trên phân đoạn gen mã hóa NA không mang các đột biến liên quan đến kháng thuốc nhưng giá trị IC50 thu được cao hơn ở vi rút cúm A [79] hoặc vi rút cúm A/H5N1 có giá trị

IC50 trung bình cao hơn các phân típ cúm A khác như đã trình bày trong phần Kết quả.

Theo dõi được sự đa dạng trong tương tác của vi rút cúm với oseltamivir theo từng năm ta có thể xây dựng được cơ sở dữ liệu về giá trị IC50 của từng vi rút cúm theo từng phân típ, tạo nền tảng để thực hiện công tác giám sát kháng thuốc của vi rút cúm tại miền Bắc Việt Nam nói riêng và mở rộng ra toàn quốc nói chung. Theo hướng dẫn của tổ chức APHL (Association of Public Health Laboratories), giá trị IC50 trung bình của mỗi phân típ cúm phải được cập nhật theo từng năm. Mỗi năm ít nhất 20 chủng vi rút thuộc từng phân típ cúm phải được thực hiện xác định giá trị IC50 và đưa vào cơ sở dữ liệu [8].

Sự tương tự về kết quả trong nghiên cứu được khẳng định, tuy nhiên giá trị thực tế của IC50 tại mỗi quốc gia sẽ khác nhau, ví dụ vi rút cúm B tại Việt Nam có IC50 được xác định là 24,79 nM, trong khi giá trị này tại Anh được xác định là 15.19 nM [122]. Vì vậy, việc xác định giá trị ngưỡng IC50 cho từng quốc gia, từng khu vực địa lý là cần thiết trong việc tiến hành giám sát sự kháng thuốc tại từng quốc gia. Nghiên cứu của chúng tôi xác định giá trị IC50 ngưỡng cho từng phân típ vi rút cúm A được thực hiện dựa trên thực tế của chính các vi rút sử dụng trong nghiên cứu. Sử dụng phần mềm Graphpad prism cho phép xác định được độ tập trung của các cá thể khác nhau, đồng thời cho phép xác định giá trị giá trị nhỏ nhất, giá trị lớn nhất và khoảng liên tứ phân vị của các giá trị IC50. Từ đó có thể xác định được giá trị ngưỡng thông qua tính đại diện của số đông trong quần thể nghiên cứu và đảm bảo được sự tương đồng với của từng phân típ khi kết hợp với giá trị IC50 trung bình của vi rút tham chiếu chuẩn được cung cấp bởi hiệp hội quốc tế giám sát sự kháng thuốc của vi rút cúm (ISRIV-AVG) [45]. Giá trị ngưỡng của các phân típ vi rút cúm A được xác định trong nghiên cứu này đã đảm bảo tính chính xác cho các kết quả của nghiên cứu.

4.2.2. Mức độ và tỉ lệ các vi rút cúm A giảm độ nhạy cảm với oseltamivir

Trong thời gian nghiên cứu, từ 2001 đến 2012, vi rút cúm A lưu hành tại miền Bắc Việt Nam luôn thể hiện những sự biến đổi thích nghi với vật chủ (người) tương tự như các phân típ vi rút cúm lưu hành trên thế giới như thay đổi đặc tính kháng nguyên (H3N2, H5N1) [55, 71, 72, 120], hoặc sự thích nghi liên quan đến khả năng gây bệnh trên người của vi rút cúm gia cầm A/H5N1 [57, 75, 99]. Sự thay đổi về độ mẫn cảm của vi rút với thuốc kháng vi rút cũng là một biểu hiện của sự thay đổi để thích nghi và phát triển trên vật chủ của vi rút cúm. Thông qua giá trị ức chế 50% của oseltamivir (IC50) với các vi rút cúm A, nghiên cứu của chúng tôi đã xác định được tổng số 20 vi rút cúm thuộc các phân típ A/H1N1, A/H1N1pdm09 và A/H5N1 yêu cầu nồng độ oseltamivir cao để ức chế sự phát triển của mình. Các vi rút này được xếp vào nhóm giảm độ nhạy mạnh, giảm độ nhạy và có biểu hiện giảm độ nhạy theo phân loại của TCYTTG (Bảng 3.7)

Sự giảm độ nhạy hoặc kháng thuốc của các vi sinh vật (vi rút hoặc vi khuẩn) thường xuất hiện do áp lực của việc sử dụng thuốc kháng vi rút hoặc kháng sinh, trong nghiên cứu của chúng tôi, đã xuất hiện các vi rút cúm A/H1N1, A/H1N1pdm09 được xác định giảm độ nhạy cảm với oseltamivir vào các năm 2008, 2009 và 2011. Trong nghiên cứu này, chúng tôi nhận thấy có sự xuất hiện của các vi rút cúm A/H1N1 giảm độ nhạy với oseltamivir vào các năm 2008 và 2009 với tỷ lệ 85,7% và 100%. Tuy số chủng chỉ giới hạn trong nghiên cứu nhưng cũng đã gợi ý về sự tự biến chuyển về kiểu hình của phân típ vi rút cúm này (Bảng 3.9). Điều này được khẳng định khi kết quả mức độ nhạy cảm với oseltamivir của H1N1 trong nghiên cứu tương tự với các chủng A/H1N1 lưu hành tại Nhật Bản, Trung Quốc, Mỹ và Châu Âu giai đoạn 2006 – 2009. Cụ thể, các vi rút A/H1N1 lưu hành trên thế giới năm 2006 có tỉ lệ kháng oseltamivir thấp (0,3-2,2%), nhưng từ 2007 đến 2009 tỉ lệ kháng thuốc tăng dần 23% năm 2007, 43-60% năm 2008 và 95% năm

2009. [27, 66, 110]. Mùa cúm 2008-2009, sự kháng của H1N1 với oseltamivir được ghi nhận trên thế giới với tỉ lệ 100% [14, 20, 34, 110]. Kết quả của nghiên cứu cũng cho thấy mức độ giảm nhạy cảm với oseltamivir của phân típ vi rút này gần như tuyệt đối khi giá trị IC50 được xác định cao hơn giá trị ngưỡng từ 1104 đến

3933 lần (Bảng 3.7). Với kết quả trên, có thể nhận định phân típ vi rút cúm A/H1N1 trong nghiên cứu vào các năm 2008 và 2009 có khả năng kháng hoàn toàn thuốc kháng vi rút oseltamivir. Để có thể xác định toàn diện về hiện tượng này, nghiên cứu hồi cứu về độ nhạy cảm của A/H1N1 nên được thực hiện với cỡ mẫu đủ lớn và đại diện cho các vùng tại Việt Nam. Sự kháng thuốc mạnh mẽ của A/H1N1 sẽ là quan ngại lớn cho sức khỏe cộng đồng nếu phân típ vi rút này tiếp tục lưu hành trong các năm tiếp theo, tuy nhiên từ năm 2010 phân típ vi rút này đã không được xác nhận trong báo cáo của hệ thống giám sát quốc gia tại Việt Nam cũng như hệ thống giám sát cúm toàn cầu (GISRS)

Vi rút cúm A/H1N1pdm09 đã xuất hiện và bắt đầu lưu hành từ năm 2009 bằng đại dịch xảy ra từ tháng 5/2009 đến tháng 4/2010 trên toàn thế giới và tiếp tục lưu hành đến nay thay thế cho vi rút cúm A/H1N1 [12, 23, 77]. Cũng như các vi rút cúm A khác, hiện tượng giảm độ nhạy cảm với oseltamivir có thể xảy ra, nhất là trong giai đoạn đầu mới xuất hiện, khi văc xin đặc hiệu chưa có và oseltamivir là công cụ chủ yếu để điều trị nhiễm vi rút. Trong nghiên của chúng tôi, tổng số có 5 vi rút được xác định có biểu hiện giảm độ nhạy với oseltamivir (Bảng 3.7), 4/5 vi rút này được phát hiện trong giai đoạn đại dịch 2009 và 1/5 trường hợp được phát hiện vào năm 2011. Tỷ lệ lưu hành của vi rút A/H1N1pdm09 giảm độ nhạy với oseltamivir tại Việt Nam trong nghiên cứu được xác định là 4,7% năm 2009 và 1,7% năm 2011 (Bảng 3.9). Tỉ lệ kháng thuốc của H1N1pdm09 năm 2009 trong thời điểm đại dịch được cho là hợp lý khi chúng tôi tham khảo nghiên cứu của Moghadas về mô hình kháng thuốc trong đại dịch cúm (năm 2008) và Hurt về sự kháng thuốc của vi rút cúm trong đại dịch (năm 2012) [40, 68]. Các tác giả đều cho rằng tỉ lệ kháng thuốc của vi rút thường tăng cao trong thời điểm vi rút lan rộng trên toàn thế giới. Theo báo cáo của hệ thống giám sát cúm toàn cầu và với một số nước trên thế giới trong cùng giai đoạn tỷ lệ vi rút A/H1N1pdm09 kháng thuốc được xác định là 0,5% tại Mỹ; 0,8% tại Anh hoặc 1,1% tại châu Á - Thái Bình Dương [21, 59, 91], tuy nhiên trong nghiên cứu của chúng tôi tỉ lệ này dường như cao hơn (1,7% năm 2011). Sự khác biệt này có thể giải thích do phạm vi nghiên cứu chỉ nằm

trong giới hạn miền Bắc Việt Nam và thực hiện trên quần thể là vi rút phân lập, không phải tổng số mẫu dương tính với vi rút cúm (được xác định bằng phương pháp RT-PCR). Số vi rút được xác định giảm độ nhạy với oseltamivir trong nghiên cứu này không bao gồm các trường hợp viêm phổi nặng nghi do vi rút tại Việt Nam, vì vậy để xác định chính xác tỷ lệ giảm độ nhạy với thuốc kháng vi rút, cần phải mở rộng nghiên cứu cũng như thống nhất cách đánh giá tỷ lệ của hệ thống giám sát cúm toàn cầu trong tương lai.

Mức độ giảm độ nhạy với oseltamivir của vi rút cúm A/H1N1pdm09 lưu hành tại Việt Nam được xác định ở mức độ mạnh khi độ chênh lệch với giá trị ngưỡng được xác định cao hơn từ 356 đến 2944 lần so với giá trị IC50 ngưỡng (Bảng 3.8). Kết quả trên cho thấy sự đa dạng về đáp ứng với oseltamivir trong nhóm vi rút có cùng biểu hiện về kiểu gen đột biến liên quan H275Y. Kết quả nghiên cứu này cũng tương tự với các thông báo từ các nước khác như Mỹ, Anh và Úc… trong cùng thời gian [21, 38, 53]. Sự khác nhau về mức độ nhạy cảm với oseltamivir của vi rút cúm A/H1N1pdm09 đặt ra yêu cầu cần phải tiếp tục giám sát thường xuyên và có những chiến lược giám sát cụ thể trong hệ thống giám sát cúm toàn cầu khi thời gian xuất hiện của vi rút này chưa lâu và sự thay đổi, tiến hoá của vi rút vẫn trong giới hạn kiểm soát.

Vi rút cúm A/H5N1 trong nghiên cứu được xác định là vi rút cúm gia cầm lưu hành trên người, chưa có những thay đổi về kiểu gen (đột biến liên quan đến thay đổi thụ cảm thể bám gắn từ gia cầm sang người trên phân đoạn gen mã hóa HA hoặc đột biến liên quan đến khả năng thích ứng của vi rút trong tế bào động vật có vú trên gen PB2…) hoặc thay đổi về kiểu hình (dễ dàng lây truyền từ người sang người). Vì vậy tổng số người nhiễm vi rút A/H5N1 trên toàn thế giới hiện tại là 637 ca mắc và chỉ giới hạn trong 15 nước và vùng lãnh thổ [115]. Do sự xuất hiện lẻ tẻ, không phổ biến nên hiện tại việc sản xuất văc xin phòng chống cúm A/H5N1 chỉ dừng lại trên quy mô phòng thí nghiệm, vì vậy thuốc kháng vi rút Taminflu (oseltamivir) là công cụ chủ yếu và duy nhất trong việc điều trị nhiễm cúm A/H5N1

và sẽ rất nguy hiểm nếu hiện tượng kháng thuốc hoặc giảm độ nhạy xảy ra trên phân típ cúm này.

Nghiên cứu của chúng tôi đã phát hiện ra trường hợp kháng thuốc đầu tiên của vi rút cúm A/H5N1 vào năm 2005 [56]- vi rút A/Vietnam/HN30408/2005 - với giá trị IC50 cao hơn 30 lần so với giá trị ngưỡng được đánh giá ở mức giảm độ nhạy cảm với oseltamivir (Bảng 3.8). Vi rút này thuộc clade 1, lưu hành tại miền Bắc Việt Nam trong giai đoạn 2003-2005. Vi rút này cũng được phân tích sâu về kiểu gen và cho thấy, đây là vi rút có đột biến không hoàn toàn, chỉ có 6 trong tổng số 10 clone có nguồn gốc từ vi rút này được phát hiện có đột biến H275Y, vì vậy việc biểu hiện kiểu hình đa dạng của các vi rút mang đột biến là có thể và liên quan nhiều đến hiện tượng "quasi-species" [24, 49, 56]. Ngoài ra, vi rút này cũng được ghi nhận hiện tượng đột biến xuất hiện dưới áp lực của điều trị [49, 56], do vậy việc kiểm soát điều trị hay xây dựng phác đồ điều trị thuốc kháng vi rút phù hợp sẽ góp phần kiểm soát hiện tượng kháng thuốc của vi rút cúm.

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng phát hiện hai vi rút cúm A/H5N1 thuộc clade 2.3.4.3 lưu hành năm 2008, có đột biến tại vị trí I117V và có biểu hiện giảm độ nhạy với giá trị IC50 cao hơn giá trị ngưỡng 5-6 lần. Kết quả này tương tự với kết quả các nghiên cứu của Hurt (2012) và Takano (2012) thu được giá trị IC50 sau khi thực hiện đột biến I117V trong nghiên cứu (giả định) tại phòng thí nghiệm cùng cho kết quả tăng hơn 5-6 lần so với giá trị trung bình [41, 102].

Nghiên cứu với 115 chủng H3N2 chúng tôi nhận thấy giá trị IC50 của phân típ vi rút cúm này ít có sự khác biệt giữa các vi rút và không phát hiện sự giảm nhạy cảm với oseltamivir trong giai đoạn từ năm 2003 đến 2012. Tham khảo các tài liệu về sự kháng thuốc của vi rút H3N2 cho thấy dường như vi rút này chủ yếu kháng amantadine (thuốc điều trị cúm được sử dụng trước oseltamivir) và chỉ kháng oseltamivir ở mức độ thấp [61, 89]. Tỉ lệ kháng oseltamivir tại các nước như Úc, Anh, Mỹ, Nhật cũng chỉ ở mức dưới 1% [13, 103]. Không giống với tỷ lệ kháng oseltamivir cao của vi rút cúm A/H1N1 (80-100% trong năm 2008-2009), vi rút

cúm A/H3N2 dường như vẫn đảm bảo độ nhạy cảm cao với oseltamivir, lý giải cho hiện tượng này, chúng tôi cho rằng đó có thể do khả năng gắn kết giữa protein NA của vi rút H3N2 với thuốc tốt hơn H1N1 và các đột biến tuy có xảy ra trên phân đoạn gen mã hóa NA nhưng khả năng gây hiện tượng kháng thuốc không mạnh. Mặc dù vậy việc theo dõi mức độ nhạy cảm của vi rút H3N2 với oseltamivir vẫn phải được thực hiện định kỳ hàng năm với mục đích phát hiện sớm các trường hợp kháng thuốc trong quá trình điều trị tại bệnh viện và trong cộng đồng dân cư.

Trong quá trình nghiên cứu, nhóm nghiên cứu thực hiện xác định tỉ lệ kháng oseltamivir của vi rút cúm dựa trên phương pháp đang được sử dụng tại các phòng thí nghiệm chuẩn thức của TCYTTG và đã được TCYTTG chấp nhận là phương pháp thường quy để thực hiện việc xác định sự kháng thuốc của vi rút cúm (bao gồm xác định mức độ kháng thuốc của vi rút sau đó kiểm tra các đột biến liên quan đến kháng thuốc trên phân đoạn gen mã hóa NA) [111]. Trên thực tế, việc giám sát sự kháng thuốc của vi rút cúm thường xuyên tại PTN mới được TCYTTG khuyến cáo thực hiện trong vòng 5 năm gần đây (từ 2009) [46]. Do vậy, phương pháp giám sát chuẩn thức vẫn được điều chỉnh hàng năm cho phù hợp với sự thay đổi của vi rút cúm và tình hình nhiễm cúm của từng quốc gia. Với phương pháp áp dụng cho nghiên cứu, chúng tôi xác định được các chủng vi rút cúm kháng oseltamivir. Với các bệnh phẩm lâm sàng dương tính với cúm nhưng không phân lập được vi rút, trong tương lai gần, chúng tôi sẽ áp dụng phương pháp giải trình tự gen với từng nucletotide xác định (pyrosequencing) để xác định trực tiếp đột biến liên quan đến kháng thuốc trên bệnh phẩm lâm sàng. Như vậy, việc giám sát kháng thuốc tại PTN sẽ bao quát được không những các chủng vi rút kháng thuốc mà còn những bệnh phẩm lâm sàng nghi ngờ mang vi rút cúm kháng thuốc.

4.3. Sự liên quan của các đột biến trên phân đoạn gen mã hóa NA với quá trình kháng thuốc oseltamivir của các chủng cúm A lưu hành tại miền Bắc Việt Nam

Dựa vào cấu trúc của protein NA , thuốc kháng vi rút cúm có tác dụng hạn chế sự phát tán của vi rút cúm được phát triển theo cơ chế ức chế neuraminidase. Hiện