Sự Liên Quan Về Mặt Di Truyền Của Các Chủng Vi Rút A Mang Gen Đột Biến Và

tại, các chế phẩm thương mại thường được nhắc đến đó là Taminflu (oseltamivir) , zanamivir... Tác dụng ức chế neuraminidase của oseltamivir thông qua sự bám kết của oseltmivir vào các vị trí hoạt động của neuraminidase tại vị trí Glu276, Ala246, Arg224, và Ile222 [9, 25, 32, 34, 64, 87]. Ái lực gắn bám sẽ quyết định hiệu quả hoạt đông ức chế của oseltamivir. Với cơ chế như vậy, nên bất cứ sự đột biến, thay đổi của axit amin trên protein NA tại các vị trí này hoặc các vị trí xung quanh đều ảnh hưởng đến ái lực gắn bám hoặc làm thay đổi vị trí tương tác với oseltamivir sẽ dẫn đến hiện tượng giảm độ nhạy, hoặc kháng oseltamivir. Theo kết quả thống kê từ những giám sát kháng thuốc được thực hiện sau khi thuốc Taminflu (oseltamivir) xuất hiện trên thị trường, đột biến trên protein NA1 như Q137K, Y156H, I223V, S247G và H275Y là phổ biến, ngoài ra các đột biến tại các vị trí I117V, R152K, E119V, R292K, S295N ... cũng được ghi nhận liên quan đến hiện tượng giảm độ nhạy hoặc kháng oseltamivir [44]. Trên protein NA2 (vi rút cúm A/H3N2), đột biến E119V, R292K có ảnh hưởng đến khả năng ức chế neuraminidase của oseltamivir, tuy nhiên các báo cáo về hiện tượng này rất hạn chế [7, 80].

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi chỉ phát hiện đột biến H275Y và I117V trên protein NA, trong đó vị trí H275Y chiếm ưu thế 90% (18/20 vi rút) trong khi đột biến I117V chỉ chiếm 10% (2/20 vi rút) (Bảng 3.8). Trong các vi rút mang phân đoạn gen mã hóa N1 trong nghiên cứu, chỉ vi rút A/H5N1 có hai loại đột biến trên phân đoạn gen mã hóa NA liên quan đến kháng thuốc. Theo thống kê các đột biến liên quan đến kháng thuốc của tổ chức ISIRV, dường như đột biến I117V chỉ được đề cập trong phân típ cúm A/H5N1, không xuất hiện trong các vi rút cúm người phân típ N1 (A/H1N1 hoặc A/H1N1pdm09). Đột biến này cũng phát hiện trên vi rút cúm A/H5N1 lưu hành trên gia cầm năm 2007-2008 tại Việt Nam [76] chứng tỏ sự liên hệ giữa vi rút cúm lưu hành trên gia cầm và trên người và cho phép nghĩ đến hiện tượng đột biến tự nhiên, không chịu áp lực của thuốc kháng vi rút oseltamivir. Rameix-Welti và cộng sự (2006) cũng đã chứng tỏ các vi rút cúm gia cầm lưu hành từ 2004-2006 có ái lực với oseltamivir thấp hơn các chủng lưu hành trước đó (1997- 2005) khi thực hiện trên các vi rút không mang đột biến liên quan đến kháng thuốc

[86]. Sự lưu hành của những vi rút mang đột biến trong đàn gia cầm sẽ không thể kiểm soát được và sẽ là nguy hiểm khi vi rút cúm gia cầm A/H5N1 thích ứng, thay đổi thành vi rút cúm lây bệnh cho người, khi đó thuốc kháng vi rút oseltamivir sẽ hoàn toàn mất tác dụng. Hơn nữa, sự trao đổi và tích hợp là hiện tượng xảy ra không những trong nội phân típ mà còn giữa các phân típ với nhau, do đó, khả năng một vi rút cúm gia cầm mang phân đoạn gen mã hóa NA có sẵn đột biến kháng thuốc là hoàn toàn có thể xảy ra. Sự nguy hiểm của vi rút cúm gia cầm mang gen kháng thuốc có khả năng lây bệnh cho người đã được chứng minh khi vi rút cúm A/H7N9 lưu hành tại Trung Quốc gần đây [63]. Phân đoạn gen mã hóa NA của vi rút cúm A/H7N9 được xác định có đột biến R292K và đã làm mất/giảm hiệu lực của thuốc Taminflu và tỷ lệ tử vong cao của những người nhiễm bệnh đã được ghi nhận (33%) [62, 63, 96, 116]. Vì vậy việc kiểm soát độ nhạy cảm của vi rút cúm gia cầm A/H5N1 là công việc bắt buộc nên trong nghiên cứu này, khác với các vi rút cúm A khác chỉ phân tích trình tự phân đoạn gen mã hóa NA của vi rút có IC50 cao, toàn bộ 28 vi rút cúm A/H5N1 đều được phân tích trình tự phân đoạn gen mã hóa NA (Hình 3.9 - 3.12).

Ngoài năm trường hợp H1N1pdm09 được khẳng định kháng thuốc trên cả kiểu hình và kiểu gen, chúng tôi còn xác định được 4 trường hợp khác cũng mang gen kháng thuốc nhưng không đủ điều kiện để thực hiện thử nghiệm ức chế neuraminidase. Bốn trường hợp này cũng mang đột biến H275Y, tuy nhiên, do không thể xác định mức kháng thuốc (kiểu hình), một điều kiện quan trọng của việc khẳng định sự kháng thuốc cho nên các chủng này chỉ dừng lại ở mức ghi nhận có mang đột biến liên quan đến kháng thuốc.

Sự phổ biến của đột biến H275Y được phát hiện trong nghiên cứu hoàn toàn phù hợp với các báo cáo tại các nước khác trêm thế giới [11, 16, 21, 33, 101]. Trong nghiên cứu này, hai đột biến H275Y và I117V được phát hiện đều là đột biến đơn lẻ, nhưng các báo cáo về hiện tượng xuất hiện các đột biến kép giả định I117V và H275Y hoặc I117M và H275Y đã xảy ra trên vi rút cúm A/H1N1pdm09 thực hiện

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 147 trang tài liệu này.

trong phòng thí nghiệm dẫn đến giá trị IC50 tăng gấp 1800 lần đối với oseltamivir, 500 lần với peramivir so với giá trị ngưỡng trung bình [41]. Ngoài ra, trường hợp bệnh nhân nhiễm cúm mang đột biến kép I223R và H275Y trên protein NA cũng đã được đề cập tại một nghiên cứu ở Mỹ gây hiện tượng tăng mạnh giá trị IC50 (9000 lần) so với giá trị IC50 ngưỡng được xác định tại nước này [74]. Do đó, hiện tượng đột biến tại các vị trí ít gặp hoặc điểm đột biến mới xuất hiện có thể xảy ra trong tương lai, nên cần phải xây dựng một chương trình giám sát kháng thuốc một cách chủ động với những phương pháp xác định cập nhật cùng các quy trình thử nghiệm hiện đại, thực hiện trên các bệnh phẩm thu thập từ chương trình giám sát cúm. Đó cũng là biện pháp tích cực trong việc phòng tránh sự lây lan của vi rút mang gen kháng thuốc trong cộng đồng.

Từ những kết quả này, các phương pháp giám sát kháng oseltamivir hiện nay đã phát triển với các phương pháp phát hiện đột biến chỉ điểm H275Y thông qua các thử nghiệm đơn giản như realtime PCR hoặc hiện đại như pyrosequencing. Những thử nghiệm này có thể thực hiện vừa trên chủng vi rút vừa trên các bệnh phẩm lâm sàng và những bệnh phẩm được xét nghiệm dương tính với vi rút cúm nhưng không thành công trong phân lập [17, 25, 26, 111]. Điều này rất hữu ích trong việc tầm soát đột biến liên quan đến kháng thuốc, có thể phát hiện sớm được cá thể mang vi rút kháng thuốc, do đó tăng cường khả năng ngăn chặn sự phát tán của vi rút kháng thuốc trong cộng đồng.

Kết quả nghiên cứu cũng cho thấy, sự đa dạng về mức độ giảm độ nhạy với oseltamivir giữa các phân típ vi rút A/H1N1, A/H1N1pdm09 và A/H5N1 có biểu hiện cùng kiểu hình NA1 và có cùng đột biến H275Y. Mức độ giảm độ nhạy cao được ghi nhận ở phân típ A/H1N1 (trung bình >1000 lần), giảm độ nhạy vừa được xác định ở phân típ A/H1N1pdm09 (>100 lần) và có biểu hiện giảm độ nhạy ở phân típ A/H5N1 (<100 và <10 lần). Sự khác biệt này có thể do đặc điểm của bản thân của từng phân típ vi rút , nhưng cũng có thể là do sự đột biến không hoàn toàn (đã

quan sát được trên vi rút cúm A/H5N1 [56]), vì vậy yêu cầu những nghiên cứu tiếp theo sâu và toàn diện hơn về sự khác biệt này trong tương lai.

4.4. Sự liên quan về mặt di truyền của các chủng vi rút A mang gen đột biến và

các vi rút cúm A lưu hành cùng thời gian.

Hệ gen của vi rút cúm A bao gồm tám phân đoạn mã hóa cho 11 protein, dưới áp lực tương tác với kháng thể vật chủ, phân đoạn gen mã hóa cho các protein bề mặt đã thể hiện sự đa dạng trong kiểu gen mà trong đó điển hình là phân đoạn gen mã hóa HA và NA của vi rút. Sự tiến hóa của vi rút cúm A được thể hiện qua sự thay đổi về di truyền học của các phân đoạn gen nhưng phân đoạn gen mã hóa HA đóng vai trò quan trọng. Sự tiến hóa của phân đoạn gen mã hóa HA cũng quyết định sự thay đổi về đặc tính kháng nguyên, yếu tố quyết định sự xuất hiện các vụ dịch hoặc đại dịch trong cộng đồng. Phân đoạn gen mã hóa NA tuy không đóng vai trò quan trọng trong sự tiến hóa của vi rút cúm A, nhưng protein NA với vai trò là một trong hai protein bề mặt của vi rút cúm sẽ ảnh hưởng rất lớn trong quy trình tạo đáp ứng miễn dịch trong cộng đồng. Sự thay đổi các axit amin trong protein NA không chỉ ảnh hưởng đến chức năng ezyme của neuramindase như đã đề cập trong nghiên cứu mà còn ảnh hưởng đến khả năng tạo miễn dịch trong cộng đồng. Chính vì vậy trong nghiên cứu này, chúng tôi tìm hiểu sự liên quan về mặt di truyền của vi rút cúm có mang đột biến liên quan đến giảm độ nhạy hoặc kháng oseltamivir và các vi rút cúm cùng phân típ lưu hành tại miền Bắc Việt Nam cũng như các chủng lưu hành trong cả nước và thế giới thông qua phân tích cây gia hệ phân đoạn gen mã hóa HA và NA. Thông qua mối liên quan này, có thể phần nào hiểu biết được sâu hơn về quá trình kháng thuốc trên các chủng cúm tại Việt Nam.

Cây gia hệ phân đoạn gen mã hóa HA và NA của các phân típ vi rút A/H1N1, A/H1N1pdm09 và A/H5N1 trong nghiên cứu đã cho thấy một sự tương đồng của các vi rút giảm độ nhạy cảm với oseltamivir với các vi rút lưu hành trong cùng một

thời gian tại các khu vực địa lý khác nhau (Hình 3.5-3.12). Sự tiến hóa của phân đoạn gen mã hóa HA dường như nhanh hơn phân đoạn gen mã hóa NA trong toàn bộ các phân típ cúm A. Cây gia hệ phân đoạn gen mã hóa HA của vi rút A/H1N1 chia thành 2 nhóm với các phân nhánh 2A, 2B và 2C trong khi phân đoạn gen mã hóa NA của vi rút này qua quan sát cũng có sự phân nhánh nhưng không thể hiện rõ qua giá trị bootstrap. Tương tự, phân đoạn gen mã hóa HA của vi rút cúm A/H5N1 phân tách rõ thành 10 clade chính và rất nhiều clade phụ như 2.3.4.1, 2.3.4.2, 2.3.4.3, trong khi phân đoạn gen mã hóa NA chỉ phân tách thành 2 nhánh chính và không hình thành các nhánh phụ. Với vi rút cúm A/H1N1pdm09 mới xuất hiện vào năm 2009, sự thay đổi của phân đoạn gen mã hóa HA và NA không nhiều (Hình 3.7, 3.8), các vi rút lưu hành vẫn tập trung trong cùng 1 nhóm và có mức độ tương đồng về di truyền cao so với vi rút dự tuyển văc xin năm 2009 A/California/07/09.

Trong cây gia hệ phân đoạn gen mã hóa HA, các vi rút cúm mang đột biến trên protein NA trong nghiên cứu đều tập trung cùng với các vi rút lưu hành tại Việt Nam trong cùng giai đoạn tương ứng. Tổng số 12 vi rút A/H1N1 mang đột biến H275Y đều nằm trong nhóm 2 và phân bố tại các nhóm phụ 2B. Nhóm 2 của cây gia hệ được tập hợp bởi các vi rút lưu hành trong các năm 2006, 2008 và 2009 tại Việt Nam, Trung Quốc, Đài Loan và Nhật Bản, có độ tương đồng cao với vi rút dự tuyển văc xin A/Solomon Island/3/2006 và A/Brisbane/59/2007. Các chủng vi rút lưu hành năm 2008-2009 tại các nước này đều được xác định có mang gen kháng thuốc (tỉ lệ kháng ~100%) tương tự vi rút lưu hành trong nghiên cứu này [22, 101, 119]. Kết quả trên cho thấy đột biến kháng thuốc (H275Y) trên phân đoạn gen mã hóa NA không ảnh hưởng đến sự thay đổi của phân đoạn gen mã hóa HA trên các vi rút phân típ A/H1N1 có mặt trong nghiên cứu và trên thế giới, các vi rút này không phân tách thành các nhóm riêng như đột biến trên gen M (S31N) liên quan đến kháng thuốc amatadine của vi rút cúm A/H3N2 [61, 89].

Các vi rút cúm A/H5N1 trong nghiên cứu được nhóm vào hai clade chính trong cây gia hệ HA là clade 1 và clade 2.3.4 (Hình 3.10, 3.11) và không phát hiện sự khác biệt của các vi rút mang đột biến H275Y (một vi rút) hoặc I117V (hai vi rút) trên cây gia hệ. Kết quả này có thể do vi rút mang đột biến với số lượng thấp trong nghiên cứu, tuy nhiên cũng không loại trừ trường hợp cũng giống như phân típ cúm A/H1N1, các đột biến tương tự trên phân đoạn gen mã hóa NA không ảnh hưởng đến quá trình tiến hóa của phân đoạn gen mã hóa HA. Nhận định này càng được thuyết phục khi clade 2.3.4 trên cây gia hệ có tập trung một số vi rút phân lập từ gia cầm có đột biến I117V (A/duck/Vietnam/NCVD100/2207) (Hình 3.9).

Tương tự, cây gia hệ phân đoạn gen mã hóa HA của vi rút cúm A/H1N1pdm09 qua quan sát cũng không có sự khác biệt có ý nghĩa của vi rút cúm mang đột biến H275Y với các vi rút khác lưu hành cùng năm (Hình 3.7).

Như vậy, các đột biến trên phân đoạn gen mã hóa NA (H275Y hoặc I117V) được phát hiện trên một số vi rút trong nghiên cứu tuy ảnh hưởng đến khả năng tương tác với oseltamivir, nhưng không ảnh hưởng đến sự thay đổi về mặt di truyền của phân đoạn gen mã hóa HA, và sẽ không làm thay đổi đặc tính kháng nguyên của chính vi rút đó.

KẾT LUẬN

1. Đã xác định giá trị IC50 ngưỡng của các phân típ cúm A lưu hành tại Việt Nam, 2001-2012

Vi rút A/H1N1 0,413 ± 0.352 nM

Vi rút A/H1N1pdm09 0,334 ± 0,286 nM

Vi rút A/H3N2 0,164 ± 0,126nM

Vi rút A/H5N1 2,947 ± 2,539 nM

2. Tỉ lệ và mức độ giảm nhạy cảm với oseltamivir của các phân típ chủng vi rút cúm A tại miền Bắc Việt Nam, 2001-2012 được xác định

 Với vi rút A/H1N1: 28,5% (12/42) vi rút giảm mạnh độ nhạy cảm với oseltamivir trung bình 1448 lần so với giá trị IC50 ngưỡng; tỉ lệ thay đổi theo năm.

 Với vi rút A/H1N1pdm09: 3,2% (5/157) vi rút giảm mạnh độ nhạy cảm với oseltamivir trung bình 1242 lần so với giá trị IC50 ngưỡng; tỉ lệ thay đổi theo năm.

 Với vi rút A/H3N2: 100% (115/115) không có biểu hiện giảm độ nhạy cảm với oseltamivir, giá trị trung bình IC50 (0,164 nM), không vượt giá trị IC50 ngưỡng.

 Với vi rút A/H5N1: trong 28 vi rút, phát hiện 01 vi rút giảm độ nhạy cảm với

oseltamivir: A/Vietnam/HN30408/05 (90nM) và 02 vi rút có biểu hiện giảm độ nhạy cảm với oseltamivir: A/Vietnam/HN31412/08 (19,04 nM) và A/Vietnam/HN31413/08 (14,48 nM)

3. Về sự tương đồng về di truyền học giữa các vi rút cúm A giảm nhạy cảm với oseltamivir tại miền Bắc Việt Nam với các vi rút cúm A trong khu vực và trên thế giới trong giai đoạn 2001-2012

 Hai đột biến H275Y và I117V được xác định trên protein NA liên quan đến giảm sự nhạy cảm của vi rút cúm A với oseltamivir, trong đó đột biến H275Y chiếm tỷ lệ 90% (18/20) được phát hiện trên các chủng cúm A/H1N1, A/H1N1pdm09 và A/H5N1. Đột biến I117V chiếm 10% (2/20) chỉ phát hiện trên phân típ A/H5N1.

 Phân đoạn gen mã hóa HA và NA của các vi rút cúm A có biểu hiện giảm độ nhạy cảm với oseltamivir thuộc các phân típ A/H1N1, A/H1N1pdm09 và A/H5N1 thể hiện sự tương đồng về di truyền học với các phân típ vi rút tương ứng lưu hành trong cùng thời gian tại Việt Nam và một số nước trong khu vực.

 Các đột biến trên phân đoạn gen mã hóa NA liên quan đến giảm độ nhạy của oselatmivir có thể không ảnh hưởng đến sự tiến hóa của phân đoạn gen mã hóa HA của các phân típ vi rút tương ứng lưu hành tại miền Bắc Việt Nam trong giai đoạn 2001-2012.