Khảo Sát Sự Biến Đổi Hoạt Tính Của Các Chế Phẩm Theo Thời Gian.

M3: mẫu enzyme thu được bằng phương pháp tủa bằng dung môi aceton sau khi đông khô.

Nhận xét:

Qua biểu đồ trên chúng ta thấy rằng hàm lượng protein của các chế phẩm hầu như không thay đổi nhiều theo thời gian chúng tôi khảo sát. Chế phẩm M0 có hàm lượng protein cao nhất còn M1 có hàm lượng protein nhỏ nhất. Như vậy phương pháp kết tủa bằng muối đã loại bỏ hầu hết các protein tạp có trong mẫu nghiên cứu, còn lại chủ yếu là papain nên có hàm lượng protein nhỏ nhất trong các phương pháp. Phương pháp đông khô giữ lại hầu hết những protein trong chế phẩm M0 vì quá trình đông khô giúp cố định mẫu nên có hàm lượng protein cao nhất. Còn hai phương pháp còn lại dùng dung môi để tủa enzyme đã loại bỏ một số protein có trong chế phẩm nhưng không thể loại bỏ hoàn toàn các protein khác nên có hàm lượng protein trung bình nằm giữa chế phẩm M0 và M1.

3.9 KHẢO SÁT SỰ BIẾN ĐỔI HOẠT TÍNH CỦA CÁC CHẾ PHẨM THEO THỜI GIAN.

Nhằm đánh giá tính ổn định của chế phẩm, chúng tôi đã tiến hành khảo sát sự biến đổi hoạt tính của chế phẩm theo thời gian.

Cân 0.1 gam các chế phẩm thu được bằng các phương pháp khác nhau sau khi đã đông khô, cho vào bình định mức 100ml. Thêm nước cất đến vạch định mức, sau đó lắc đều đến khi chế phẩm tan hoàn toàn. Chế phẩm được bảo quản ở 4oC để dùng dần, thời gian tiến hành thí nghiệm là 5 ngày.

Hút 1ml dung dịch trong bình định mức tiến hành xác định hoạt tính protease theo phương pháp Anson. Thí nghiệm được lặp lại mỗi ngày và kết quả được thể hiện trong bảng 3.8:

Bảng 3.8. Hoạt tính protein của các chế phẩm theo thời gian

Ngày

∆OD				P(UI/ml)
M0	M1	M2	M3	M0	M1	M2	M3
1	0.296	0.212	0.144	0.116	70.353	49.286	32.187	25.146
2	0.197	0.158	0.192	0.124	65.081	51.010	63.224	38.797
3	0.125	0.107	0.081	0.080	54.728	45.766	32.690	32.187
4	0.265	0.071	0.064	0.087	44.702	9.879	8.621	12.753
5	0.264	0.059	0.044	0.033	26.749	4.634	3.018	1.832

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 96 trang tài liệu này.

Hoạt tính (UI/ml)

Kết quả này được biểu diễn bằng đồ thị như hình 3.7

M0 M1 M2

Thời gian (ngày)

Hình 3.7. Sự biến đổi hoạt tính của các chế phẩm theo thời gian

Trong đó:

M0: mẫu nhựa đu đủ tươi được đem đông khô

M1: mẫu enzyme thu được bằng phương pháp tủa với ammonium sulfate sau khi đông khô.

M2: mẫu enzyme thu được bằng phương pháp tủa bằng ethanol sau khi đông

khô.

M3: mẫu enzyme thu được bằng phương pháp tủa bằng dung môi aceton sau

khi đông khô.

Nhận xét:

Nhựa đu đủ là hỗn hợp các protease có tính thủy phân mạnh, trong đó papain là một trong những enzyme có hoạt tính mạnh và chiếm hàm lượng cao nhất, thủy phân protein tới oligopeptide. Papain ở dạng tự nhiên, nhóm –SH tự do bị bao vây, có tính ổn định cao hơn papain dạng hoạt động trong dung dịch.

Không chỉ là proteza có tính chất đặc hiệu cơ chất rộng, papain còn có khả năng tự thủy phân do một phân tử papain xúc tác cho sự thủy phân một phân tử khác. Do trong thời gian tiến hành thí nghiệm, dung dich enzyme chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố khách quan như chịu ảnh hưởng của 2 yếu tố oxy trong không khí và sự tự thủy phân của papain, nên hoạt tính của các chế phẩm sẽ giảm dần theo thời gian.

Theo kết quả ở bảng, hoạt tính của các chế phẩm giảm dần mỗi ngày. Sạu 5 ngày chúng tôi khảo sát thì hoạt tính của các chế phẩm giảm đi rất nhiều so với ngày đầu tiên (M0 còn 47.91%, M1: 9.4%, M2: 9.37 %, M3:7.29 %). Chế phẩm M0 giữ hoạt tính tốt hơn là do trong nhựa đu đủ còn có một số chất khác đã góp phần bảo vệ papain. Các phương pháp kết tủa thu nhận papain đã loại bỏ một số chất có trong nhựa nên độ bền của những chế phẩm còn lại kém hơn so với M0.

Trên hình biểu diễn sự biến động hoạt tính của các chế phẩm theo thời gian đã cho chúng ta thấy rằng hoạt tính của chế phẩm M1 có hoạt tính cao hơn hẳn các chế phẩm khác. Lý do có thể là do phương pháp tủa muối không có ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme, phương pháp này chỉ loại đi nhiều proteaza tạp, còn lại phần lớn là papain. Cồn và aceton cũng là một dung môi hữu cơ được sử dụng rộng rãi để kết tủa proteaza nhưng phương pháp này có nhược điểm làm giảm hoat tính proteolytic, nhiều khi dẫn đến mất hoạt tính hoàn toàn.

Từ những số liệu thực nghiệm cho ta có thể đánh giá rằng chế phẩm papain được tách bằng muối có hoạt tính cao hơn so với các phương pháp sử dụng dung môi hữu cơ và khá bền khi tồn tại ở dạng hoạt động.

3.10 KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HOẠT TÍNH CỦA ENZYME PAPAIN.

3.10.1. Khảo sát ảnh hưởng của pH

Tiến hành thí nghiệm xác định hoạt tính enzyme ở các pH khác nhau từ 7.5 đến 9.0. Xác định hoạt tính theo phương pháp Anson, mẫu được đo độ hấp thu quang ở bước sóng 720nm. Kết quả được trình bày trong bảng 3.9 (phụ lục 20)

75.00

70.00

65.00

60.00

55.00

50.00

7.0

7.5

8.0

8.5

9.0

Bảng 3.9. Hoạt tính của protein P(UI) biến đổi theo pH

∆OD1	∆OD2	∆OD	P(UI/ml)
7.0	0.355	0.087	O.268	72.34
7.5	0.295	0.030	0.265	71.65
8.0	0.232	0.067	0.228	60.80
8.5	0.275	0.064	0.211	56.01
9.0	0.271	0.072	0.200	52.77

Hoạt tính P (UI/ml)

Hình 3.8 Hoạt tính của protein P(UI/ml) trong nhựa khô biến đổi theo pH

Nhận xét:

Khi tăng dần giá trị pH lên thì đồng thời hoạt tính protein cũng tăng lên sau đó giảm xuống rất nhanh, đều này chứng tỏ rằng pH đóng một vai trò rất quan trọng cho sự tồn tại của enzyme trong môi trường do pH ảnh hưởng đến mức độ ion hóa của các enzyme và phần nào quyết định dạng tồn tại và hoạt tính của chúng. Và khi pH = 7 – 7.5 thì hoạt tính protein trong nhựa khô đạt giá trị cao nhất so với các giá trị còn lại.

3.10.2 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ

Cân 0.0224 g nhựa khô hòa tan trong 100ml nước cất. Sau đó tiến hành thí nghiệm xác định hoạt tính protein trong nhựa khô theo phương pháp Anson ở các khoảng nhiệt độ khác nhau từ nhiệt độ t = 40OC đến 90oC (với ∆t = 5OC), pH dung dịch đệm được giữ cố định ở pH = 7.6. Kết quả được trình bày trong bảng 3.10:

Bảng 3.10. Hoạt tính của protein P(UI) trong nhựa khô biến đổi theo nhiệt độ

tOC

∆OD1	∆OD2	P(UI/ml)
45	0.1053	0.0646	17.728
50	0.1108	0.0652	21.276
55	0.1619	0.0559	25.844
60	0.2731	0.0659	54.957
65	0.2525	0.0718	59.178
70	0.4136	0.0702	70.560
75	0.1678	0.0415	23.758
80	0.1993	0.0532	28.059
85	0.1697	0.0559	21.075
90	0.1366	0.0486	15.524

60 65

70 75

Nhiệt độ (oC)

Hoạt tính P (UI/ml)

Hình 3.9:Hoạt tính của protein trong nhựa khô theo nhiệt độ

Nhận xét:

Khi nhiệt độ thay đổi thì hoạt tính cũng thay đổi đáng kể theo nhiệt độ, tăng dần khi nhiệt độ tăng và đạt giá trị cực đại khi lên tới 70OC và sau đó lại giảm dần.

Nguyên nhân có thể là do khi ta tăng nhiệt độ thì các protein trong nhựa khô sẽ thay đổi cấu trúc tâm hoạt động của chúng chuyển từ dạng bất hoạt hay ở dạng có hoạt tính kém do quá trình phân hủy hay oxy hóa thành dạng hoạt hóa nên dẫn đến hoạt tính tăng cao, nhưng khi nhiệt độ tăng quá cao thì nó lại chuyển thành dạng bất hoạt có khi bất hoạt hoàn toàn do cấu trúc tâm hoạt động đã bị thay đổi.

Qua các kết quả khảo sát trên chúng tôi nhận thấy rằng: hoạt tính của enzyme papain sau các giai đoạn tinh chế giảm dần đồng thời với lượng protein cũng giảm dần. Do đó, chúng tôi sử dụng nhựa đu đủ đã đông khô để làm xúc tác cho phản ứng thủy phân protein trong bánh dầu đậu phộng mà không tiến hành tinh chế.

3.11 KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG ĐẠM FORMOL VÀ AMONIAC THEO THỜI GIAN TRONG PHẢN ỨNG THỦY PHÂN.

Tiến hành phản ứng thủy phân protein trong bánh dầu đậu phộng ở điều kiện nhiệt độ phản ứng là 70OC và pH của phản ứng là 7.0 với các hàm lượng xúc tác khác nhau. Sau mỗi 2 giờ phản ứng, cân 10ml dung dịch thủy giải từ bình phản ứng, thêm nước sôi để ngừng phản ứng, định mức thành 100ml dung dịch đem lọc. Hút

10ml dịch lọc đem xác định đạm formol theo phương pháp Sorensen. Kết quả được trình bày trong bảng 3.11 – 3.13:

Bảng 3.11: Biến thiên hàm lượng đạm formol theo thời gian ở tỉ lệ enzyme là 0.25% so với cơ chất.

Thời gian phản ứng

Hàm lượng đạm formol trung bình của

dịch thủy phân (g/l)

1.1

1.4

1.8

2.0

2.2

2.4

2.5

2.9

3.1

3.4

3.5

3.6

Bảng 3.12: Biến thiên hàm lượng đạm formol theo thời gian ở tỉ lệ enzyme là 0.50% so với cơ chất.

Thời gian phản ứng

Hàm lượng đạm formol trung bình của

dịch thủy phân (g/l)

1.9

2.9

3.2

3.5

3.8

4.1

4.2

4.6

4.9

6.1

7.2

8.6

Bảng 3.13: Biến thiên hàm lượng đạm formol theo thời gian ở tỉ lệ enzyme là 1.00% so với cơ chất.

Thời gian phản ứng

Hàm lượng đạm formol trung bình của

dịch thủy phân (g/l)

1.4

2.8

3.5

4.9

6.3

7.0

7.7

8.3

8.4

8.8

9.1

9.2

Sự biến thiên hàm lượng đạm formol ở các hàm lượng xúc tác khác nhau được biểu diễn qua đồ thị hình 3.10

Biến thiên hàm lượng đạm formol theo thời gian

8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

Thời gian phản ứng (giờ)

Nổng độ xúc tác 0.25% Nồng độ xúc tác 0.50%

Nồng độ xúc tác 1.00%

Hàm lượng đạm formol (g/l)

Hình 3.10: Đồ thị biểu diễn sự biến thiên hàm lượng đạm formol theo thời gian phản ứng.

Bảng 3.14: Biến thiên hàm lượng đạm amoniac ở các nồng độ enzyme khác nhau

Nồng độ enzyme (%)

0.25

0.50

1.00

Hàm lượng đạm amoniac trung bình của dịch thủy phân

(g/l)

0.06

0.07

Nhận xét:

Hàm lượng đạm amin = hàm lượng đạm formol – hàm lượng đạm amoniac.

Qua kết quả khảo sát trên, hàm lượng đạm amoniac của dịch thủy phân dao động từ 0.06 – 0.07g/l. Như vậy hàm lượng đạm amoniac của dịch thủy phân rất thấp so với các chỉ tiêu cho phép của nước chấm và xem như không đáng kể. Do đó trong các khảo sát về ảnh hưởng của tỉ lệ enzyme so với cơ chất cũng như các điều