Ch Ẩn Bị Ix (Hỗn Hợp Phản Ứng Rt- Cr Giải T Ình Tự Gen

 Nhuộm b ng Haematoxylin trong 3 phút, sau đó nửa qua vòi nước chảy

 Rửa b ng nước cất, sau đó rút nước (b ng cách nhúng qua cồn 90, cồn tuyệt đối: 2 lần, xylen: 2 lần)

 Gắn lamen

2.3.2.11. hương ph p giải t ình tự gen

- Chiết tách NA như trên (xem 2.3.2. , phần a)

- Nhân đoạn toàn bộ đoạn gen HA, NA b ng phản ứng RT-PCR (PCR phiên mã ngược) với các cặp primer đặc hiệu

+ Pha master mix để chạy phản ứng PCR (sử d ng kít Promega Access- Quick RT-PCR (A1701))

Bảng 2.4. Ch ẩn bị ix (hỗn hợp phản ứng RT- CR giải t ình tự gen

Promega Access-Quick RT-PCR (A1701) kit

Reagent	Lượng (µl)
Access Quick Master Mix	12,5
Mẫu RNA	2 - 5
Forward primer (20 μ )	0,5
everse primer (20 μ )	0,5
AMV Reverse Transcriptase	0,5
Nước Rnase/Dnase free	Tới 25

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 162 trang tài liệu này.

+ Chu trình nhiệt:

Bước 1: 48°C trong 4 phút Bước 2: 94°C trong 2 phút

Bước 3: 94°C trong 20 giây

Bước 4: 0°C trong 30 giây Bước : 2°C trong 1 phút

Bước 6: Thực hiện 3 chù kỳ từ bước 3-5 Bước : 2°C trong 10 phút

Bước 8: Giữ 4°C

Bảng 2.5. T ình tự p i e đ giải t ình tự gen (theo q y t ình CDC)

Primer	Trình tự nucleotide
H5N1 HA	H5F-1	AGC AAA AGC AGG GGT YTA AT
	H5R-1111r	CCA TAC CAA CCA TCT AYC ATT CC
	H5F-751r	AYG CMT AYA ARA TTG TCA AG
	H5R-1773	AGT AGA AAC AAG GGT GTT TTT AAC TAC AAT
	H5F-219r	GAT CTT CTT GRT TGG TRT TAT TGT ARC T
	H5R-515r	GAG TGA AGC CTC TRA TYT T
	H5R-1000r	TGA TTT CAC RTA YTT GGG RCA TTC
	H5F-945r	CAT TCC ACA AYA TMC AYC C
	H5F-1150r	CAA YGA GCA GGG GAG TGG RTA
H5N1 NA	N1F1	AGC AAA AGC AGG AGA TTA AAA TGA ATC CAA
	N1R835	CAC ACA TGT GAT TTC GCC AGC
	N1F458	GGC AAG TGC TTG CCA TGA TGG
	NA-	AGT AGA AAC AAG GAG TTT TTT
	N1R561	GAC CAA GCA ACA GAC TCA AAC C
	N1F955	TCA AAT AGG ATA YAT ATG CAG TGG
	N1R1112	AAC TGA TTG GTC AGG RTA YAG YGG
H5N1 M	MF1	AGC AAA AGC AGG TAG ATA TTG AAA GAT GAG
	MR1027	AGT AGA AAC AAG GTA GTT TTT TAC
	AvMF476	TGTGAGCAGATTGCA GATTCAC
	AvMR560	TTA GCT GTA GTG CTG GCC AGC ACC

- Sản phẩm PC được đọc trình tự b ng máy giải trình tự gen tự động ABI 3730 Analyzer (CDC)

- Sử d ng phần mềm Bioedit .0.9 để thực hiện việc so sánh chuỗi trình tự (Alignment)

- Lập cây phả hệ sử d ng chuỗi gen HA, NA và dựa trên khung đọc mã m (ORF) sử d ng phương pháp Neighbor-joining (NJ) với phần mềm MEGA 5 (Molecular Evolutionary Genetic Analysis). Lập cây phả hệ so sánh với các virus cúm A/H5N1 thuộc các clade (nhánh) khác nhau với gốc là virus clade 0 (A/goose/Guangdong/1/1996).

Hình 2.1. Sơ đồ b t í p i e giải t ình tự gen H5, N1 à M i c A/H5N1

2.3.2.12. Tiê phòng vacxin cho gà, đ nh gi c c ch s gây bệnh lâ àng

- Lô Thí nghiệm: 10 con gà 2 tuần tuổi khỏe mạnh, không có kháng thể cúm A H N1 được tiêm 0,3 ml vacxin cúm A H N1 e-1, dưới da cổ.

- Lô Đối chứng: 0 gà khỏe mạnh, không có kháng thể cúm A H N1 cùng nguồn gốc với gà thí nghiệm.

- Thời điểm 4 tuần sau khi tiêm vacxin cúm, công cường độc cho gà được tiêm vacxin (10 con) và gà đối chứng (5 con) với liều công cường độc virus cúm A/H5N1clade là 106TCID50/100 µl gà qua đường nhỏ mũi. Việc công cường độc được tiến hành trong khu chuồng nuôi động vật đảm bảo điều kiện an toàn sinh học cấp độ 3 tại Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương.

+ Theo dõi các biểu hiện lâm sàng trong vòng 10 ngày sau khi công cường độc, đánh giá các chỉ số gây bệnh lâm sàng (khỏe mạnh-0, ốm nhẹ-1, ốm nặng-2, chết-3).

+ Lấy máu và kiểm tra kháng thể cúm gia cầm trước và sau khi công cường độc (theo phương pháp HI).

- Tỷ lệ bảo hộ thực sự của gà được tiêm vacxin (PF-Preventable Fraction) được tính như sau:

(% đối chứng chết-%thí nghiệm chết)

PF=	% đối chứng chết

2.3.2.12. C ch tính thời gian chết t ng bình (MDT)

Lấy ngày gia cầm được gây bệnh chết nhân với số gia cầm chết trong ngày đó, rồi lấy tổng số ngày đã tính được chia cho tổng số gia cầm được gây bệnh sẽ có thời gian chết trung bình:

Ví d : Gây bệnh cho 10 gà, có 4 con chết vào ngày thứ tư, 4 con chết vào ngày thứ năm, và 2 con chết vào ngày thứ sau. Ta sẽ tính như sau:

MDT = [(4 x 4) + (4 x 5) + (2 x 6)]/10 MDT = 48 10 = 4,8 (ngày)

2.3.2.13. C ch tính đi lâ àng

Cho điểm lâm sàng gia cầm thí nghiệm như sau: khỏe mạnh – 0 điểm, ốm nhẹ (bỏ ăn, uống) – 1 điểm, ốm nặng (n m liệt) – 2 điểm, và chết – 3 điểm.

Sau đó cộng điểm từng ngày của mỗi gia cầm thí nghiệm và tính trung bình trên số ngày thí nghiệm. Có thể tính tiếp trung bình cho cả lô thí nghiệm.

Ví d :

Ngày sau khi tiến hành thí nghiệm

1	2	3	4	5	6	TB
Gia cầm TN	0	1	1	2	2	3	1,5

TB = (0+1+1+2+2+3)/6 TB = 1,5

CHƯƠNG 3

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU V THẢO LUẬN

3.1. hân lập à gi định i c A/H5N1 cl de 7

Nhiều nghiên cứu trước đây đã cho thấy có nhiều dòng virus cúm A/H5N1 khác nhau đã lưu hành trong khu vực cũng như đã thâm nhập vào Việt Nam. Các nghiên cứu về phát sinh loài virus A H N1 Việt Nam cũng cho thấy có nhiều nhánh (clade) virus đã xâm nhập và tái xuất hiện trong nước trong những năm qua (Nguyen và cs, 2008; Simmons và cs, 200 ; Wallace và cs, 200 ). Mặc dù cơ chế xâm nhập và lây lan của virus vẫn còn chưa được xác định rõ, nhưng khả năng virus vẫn còn tiếp t c tái xuất hiện sẽ có thể làm phức tạp thêm cho công tác phòng chống cúm gia cầm Việt Nam.

Từ cuối năm 200 , để phòng chống dịch cúm gia cầm gây bệnh cho gia cầm và gây nguy hiểm cho con người, Việt Nam đã áp d ng chương trình tiêm phòng cúm gia cầm A/H5N1 trong cả nước. Song song với chương trình phòng bệnh b ng vacxin, để đảm bảo và giám sát chủ động kết quả tiêm phòng C c Thú y đã tiến hành các chương trình giám sát sau tiêm phòng và đồng thời giám sát sự lưu hành của virus A H N1. Chương trình giám sát virus đã được thực hiện những vùng nguy cơ (nơi từng xảy ra dịch) và những nơi có gia cầm nhập lậu vào Việt Nam.

Để khống chế sự lây lan của virus cúm A/H N1 độc lực cao (HPAI), Việt Nam đã thiết lập và thực hiện những chương trình giám sát cúm gia cầm trên các đàn gia cầm, chợ gia cầm sống…đặc biệt là một số điểm (cửa khẩu) dọc theo tuyến biên giới phía Bắc, c thể là Lạng Sơn, nơi có hiện tượng gia cầm nhập lậu vào Việt Nam. Tại đây, gia cầm đã bị bắt giữ và tiêu hủy với số lượng tương đối lớn. Trước khi tiêu hủy, gia cầm đã được lấy mẫu b ng tăm bông ngoáy ổ nhớp (cloacal swab), sau đó các mẫu tăm bông được giữ trong dung dịch bảo quản (VTM-viral transport medium) và chuyển về Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương. Chúng tôi đã thực hiện việc xét nghiệm nh m phát hiện virus cúm gia cầm. Trong luận án này chúng tôi chỉ trình bày về virus cúm A/H5N1 clade

7. Kết quả xét nghiệm được trình bày bảng 3.1.

Bảng 3.1. Kết quả xét nghiệm à phân lập virus từ chương t ình gi t biên giới (Lạng Sơn)

Huyện

Số mẫu	Kết quả
	Dương tính cúm A (RRT-PCR)		Dương tính H5N1 (RRT-PCR)		Phân lập virus
	Số mẫu	Tỷ lệ %	Số mẫu	Tỷ lệ %	Số mẫu	Tỷ lệ %
Cao Lộc	275	10	3,64	8	2,91	5	1,82
Lộc Bình	220	7	3,18	7	3,18	0	0,00
Tổng c ng	495	17	3,43	15	3,03	5	1,01

Bảng 3.1 cho thấy trong giai đoạn năm 2008, đã có tổng cộng 495 mẫu swab ngoáy ổ nhớp từ gà nhập lậu được thu thập và gửi đến Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương để xét nghiệm. Trong đó có 2 mẫu dịch swab từ huyện Cao Lộc và 220 mẫu dịch swab từ huyện Lộc Bình của tỉnh Lạng Sơn.

Chúng tôi đã tiến hành chiết tách NA từ các mẫu dịch swab b ng kít RNeasy minikit (cat# 4104) và xét nghiệm b ng phản ứng Realtime RT-PCR phát hiện virus cúm A (phát hiện gen M).

Như vậy, trong số 495 mẫu xét nghiệm, đã phát hiện 17 mẫu bệnh phẩm dương tính với virus cúm A, trong đó có 10 mẫu phát hiện Cao Lộc và mẫu Lộc Bình, đạt tỷ lệ trung bình 3,43% (17/495).

Các mẫu dương tính với virus cúm A, được tiếp t c xét nghiệm b ng phương pháp ealtime T-PC để phát hiện virus A/H5N1. Kết quả cho thấy có 15/17 mẫu dương tính virus A H N1, đạt tỷ lệ trung bình 3,03% trên tổng số 49 mẫu dịch swab đã xét nghiệm. Các mẫu dương tính virus cúm A/H5N1 đều được phát hiện các điểm kiểm soát cửa khẩu khác nhau biên giới phía Bắc n m huyện Cao Lộc và Lộc Bình.

Các mẫu dương tính A/H5N1 được tiếp t c gây nhiễm lên phôi trứng gà 9- 10 ngày tuổi, kết quả là đã phân lập được chủng virus cúm A H N1 trên tổng số 15 mẫu phát hiện dương tính virus cúm A/H5N1. Cả chủng này đều là các mẫu từ huyện Cao Lộc. Các mẫu còn lại (Cao Lộc và Lộc Bình) không phân lập được virus có thể do virus có trong mẫu swab đã chết trong quá trình bảo quản và vận chuyển.

Hình 3.1. Bản đồ nơi ph t hiện được c c chủng i A/H5N1 thu c clade 7 ở Lạng Sơn

Từ các kết quả xét nghiệm và phân lập virus từ các địa điểm khác nhau trên tuyến biên giới có thể nhận thấy r ng rõ ràng nguy cơ xâm nhập của virus cúm gia cầm theo gia cầm nhập lậu, đặc biệt là virus A H N1 từ nước ngoài vào Việt Nam là rất cao. Đây có thể là một nguyên nhân dẫn đến việc dịch cúm gia cầm vẫn liên t c xảy ra Việt Nam trong nhiều năm. Đồng thời, việc tiến hành công tác giám sát virus cúm gia cầm là rất cần thiết với b ng chứng rõ ràng về virus đã phát hiện và phân lập được, điều này giúp cho việc có thông tin chủ động trong việc phát hiện sớm những nguy cơ dịch cúm gia cầm có thể xảy ra, chủ động nâng cao công tác phòng và chống bệnh cúm gia cầm.

3.2. X c định đặc tính di t yền của virus c A/H5N1 th c clade 7 phân lập ở Việt N (bằng phương ph p giải t ình tự à lập cây phả hệ)

3.2.1. Giải t ình tự gen HA (H5) à phân tích cây phả hệ sử dụng chuỗi gen H5.

Trong số 15 mẫu được xác định là virus cúm A/H5N1 clade 7, có mẫu đã phân lập được virus, còn 10 mẫu còn lại chỉ cho kết quả dương tính b ng phương pháp ealtime T-PCR. Cả 15 mẫu này đều được chúng tôi tiến hành chiết tách NA của virus và sau đó sử d ng phản ứng RT-PC để khuếch đại gen HA để giải trình tự gen tại phòng thí nghiệm cúm của CDC-Hoa Kỳ.

S TT	Tên chủng virus c phân lập được	Đị đi m ph t hiện	hân lo i cl de/nhó	Subtype
1	A/Chicken/Vietnam/NCVD-016/2008	Cao Lộc	7	H5N1
2	A/chicken/Vietnam/NCVD-03/2008	Cao Lộc	Nhóm B	H5N1
3	A/chicken/Vietnam/NCVD-04/2008	Cao Lộc	Nhóm B	H5N1
4	A/chicken/Vietnam/NCVD-05/2008	Cao Lộc	Nhóm B	H5N1
5	A/chicken/Vietnam/NCVD-093/2008	Cao Lộc	Nhóm A	H5N1
	Tên dương tính virus c (kh ng phân lập được virus)
6	A/chicken/Vietnam/NCVD-swab06/2008	Cao Lộc	Nhóm B	H5N1
7	A/chicken/Vietnam/NCVD-swab15/2008	Lộc Bình	Nhóm A	H5N1
8	A/chicken/Vietnam/NCVD-swab16/2008	Lộc Bình	Nhóm B	H5N1
9	A/chicken/Vietnam/NCVD-swab17/2008	Lộc Bình	Nhóm A	H5N1
10	A/chicken/Vietnam/NCVD-swab18/2008	Lộc Bình	Nhóm A	H5N1
11	A/chicken/Vietnam/NCVD-swab19/2008	Cao Lộc	7	H5N1
12	A/chicken/Vietnam/NCVD-swab20/2008	Cao Lộc	Nhóm B	H5N1
13	A/chicken/Vietnam/NCVD-swab24/2008	Lộc Bình	Nhóm B	H5N1
14	A/chicken/Vietnam/NCVD-swab25/2008	Lộc Bình	Nhóm B	H5N1
15	A/chicken/Vietnam/NCVD-swab26/2008	Lộc Bình	Nhóm B	H5N1

Bảng 3.2. Kết q ả giải t ình tự gen à phân tích cây ph t inh loài c c chủng i c A/ H5N1 ph t hiện ở Lạng Sơn