Xác Định Nồng Độ Ficolins­2 Và Mbl Trong Huyết Thanh

Giảm: Nam < 4,3 T/l, Nữ < 3,9 T/l Tăng: Nam > 5,8 T/l, Nữ > 5,4 T/l

+ Số lượng bạch cầu: chia ra các mức độ: Bình thường: 4­12 G/l

Giảm: < 4 G/l

Tăng bạch cầu: > 12 G/l

+ Số lượng tiểu cầu: bình thường: số lượng tiểu cầu Nữ: 148 ­ 400 G/l; Nam: 141 ­ 385 G/l. Từ 100­150 G/l là theo dõi giảm tiểu cầu. Giảm tiểu cầu có ý nghĩa khi < 100 G/l, chia thành các mức: Mức < 50G/l;Mức 50­80 G/l; Mức > 80 G/l

+ Hematocrit: chia ra các mức độ: Nhỏ hơn 0,38 l/l

Bình thường: 0,38­0,5 l/l Từ 0,5 l/l trở lên

­ Sinh hoá máu

Làm xét nghiệm tại Khoa sinh hóa Bệnh viện Quân y 103 trên hệ thống máy hóa sinh tự động hoàn toàn Olympus AU640, AU 5800. Giá trị

bình thường lấy theo “Xét nghiệm sử Thế Khánh và Phạm Tử Dương .

­ Vi sinh vật

dụng trong lâm sàng” của Nguyễn

Các xét nghiệm phát hiện DENV­NS1, DENV­IgM; DENV­IgG

được thực hiện bằng phương pháp ELISA sử

dụng bộ

kít

AccuDiag™

Dengue NS1 Antigen ELISA Kit, AccuDiag™ Dengue IgM ELISA Kit, AccuDiag™ Dengue IgG ELISA Kit của hãng Diagnostic Automation. Các bước thực hiện theo quy trình hướng dẫn của nhà sản xuất đi kèm với bộ kít.

2.3.3. Xác định nồng độ Ficolins­2 và MBL trong huyết thanh

2.3.3.1. Xác định nồng độ protein Ficolin­2

ELISA là kỹ

thuật hấp thụ

miễn dịch liên kết với enzym dựa trên

nguyên tắc chung là sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể được gắn với một enzym. Khi cho thêm cơ chất thích hợp vào phản ứng, enzym sẽ thủy phân cơ chất thành một chất có màu. Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng nguyên

với kháng thể. Thông qua việc đo mật độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện.

quang sẽ

biết được nồng độ

Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng phương pháp ELISA ­

Sandwich. Các khay đĩa microelisa được cung cấp trong bộ kít đã được phủ một loại kháng thể đặc hiệu với Ficolin­2. Cho các mẫu chuẩn hoặc mẫu thử vào các giếng của khay đĩa microelisa thích hợp, chúng sẽ kết hợp với kháng thể đặc hiệu. Sau đó, cho thêm một kháng thể liên hợp với enzym đặc hiệu đối với Ficolin­2 vào mỗi giếng của khay đĩa microelisa và ủ.

Rửa sạch các thành phần tự do. Thêm dung dịch cơ chất (tetramethyl

benzidine) vào mỗi giếng, chỉ những giếng chứa Ficolin­2 và kháng thể

của nó liên hợp với enzym mới xuất hiện màu xanh, sau khi thêm dung

dịch dừng phản ứng (stop solution) những giếng này chuyển sang màu

vàng. Đo mật độ quang (OD) ở bước sóng 450 nm. Giá trị OD tỉ lệ thuận

với nồng độ

của Ficolin­2. Tính nồng độ

Ficolin­2 trong các mẫu bằng

cách so sánh OD của các mẫu với đường cong chuẩn dựa trên phương trình đường chuẩn được lập.

Hình 2.1: Máy đo mật độ quang ở bước sóng 450 nm

*Nguồn: Bộ môn Sinh lý bệnh – Học viện Quân y

­ Nồng độ

protein Ficolin­2 được định lượng bằngbộ

kít: ELISA

Human Ficolin­2 mã HK336­02 của nhà sản xuất Hycult Biotech.

Hình 2.2: Bộ kít ELISA Human Ficolin­2 (Hycult Biotech)

*Nguồn: Bộ môn Sinh lý bệnh – Học viện Quân y

­ Quy trình định lượng Ficolin­2 gồm các bước như sau:

1. Cho 100 ul dung dịch Standard; mẫu vào giếng theo sơ đồ nghiên cứu tránh chạm đầu côn vào thành và đáy giếng; gián miếng dính phủ mặt; ủ 1 giờ ở 37oC.

2. Rửa 4 lần, mỗi lần 200 ul bằng dung dịch rửa 1X.

3. Cho 100 ul biotinylated tracer antibody đã pha loãng vào mỗi giếng;

ủ 1 giờ ở 25oC.

4. Rửa 4 lần, mỗi lần 200 ul bằng dung dịch rửa 1X.

5. Cho 100 ul streptavidin­peroxidase đã pha loãng vào mỗi giếng; ủ 1 giờ ở 25oC.

6. Rửa 4 lần, mỗi lần 200 ul bằng dung dịch rửa 1X.

7. Cho 100 ul TMB vào mỗi giếng; ủ 30 phút ở 25oC, có thể ủ ngắn hơn nếu thấy lên màu mạnh, tránh ánh sáng mặt trời trực tiếp.

8. Cho 100 ul Stop Solution vào mỗi giếng; đọc OD trong vòng 30 phút ở bước sóng 450 nm.

2.3.3.2. Xác định nồng độ protein MBL

Nồng độ protein MBL trong huyết thanh được định lượng bằng hệ thống Luminex® 100/200™ và phần mềm EMD Millipore’s MILLIPLEX® MAP (Hoa Kỳ) tại labo bệnh lý phân tử thuộc Bộ môn Sinh lý bệnh – Học viện Quân y.

Hình 2.3: Hệ thống và phần mềm định lượng miễn dịch Luminex

*Nguồn: Bộ môn Sinh lý bệnh – Học viện Quân y

­ Nguyên lý hoạt động của hệ thống Luminex® 100/200™: Luminex® 100/200™ hoạt động dựa trên công nghệ Luminex® xMAP là xét nghiệm miễn dịch trên bề mặt của các hạt từ được mã hóa màu fluorescent ­ các vi hạt MagPlex®.

+ Luminex® 100/200™ sử dụng các công nghệ mã hóa màu bên trong cho các vi hạt với hai chất nhuộm fluorescent. Thông qua nồng độ chính xác của các chất nhuộm này, các bộ hạt từ có màu riêng biệt gồm 500 vi hạt polystyrene 5,6µm hoặc 80 vi hạt từ 6,45 µm được tạo ra, mỗi vi hạt được bao phủ bởi kháng thể đặc hiệu được biotin hóa.

+ Hỗn hợp phản ứng sau đó được ủ với cặp liên hợp Streptavidine – PE, phân tử thông báo, để hoàn thành phản ứng trên bề mặt mỗi vi hạt.

+ Mỗi vi hạt được xác định và kết quả xét nghiệm được định lượng dựa trên tín hiệu màu fluorescent thu được. EMD Millipore kết hợp dữ liệu dòng chảy đạt được của phần mềm Luminex® Xponent với khả năng phân tích phức tạp của phần mềm phân tích MILLIPLEX®5.1.

­ Nồng độ

protein MBL được định lượng bằng bộ

kít: Human

Complement Magnetic Bead Panel 1 mã HCMP1MAG­19Kcủa Merck.

Hình 2.4: Bộ kít Human Complement Magnetic Bead Panel 1 (Merck).

*Nguồn: Bộ môn Sinh lý bệnh – Học viện Quân y

­Quy trình thực hiện việc định lượng MBL gồm các bước như sau:

1.Lấy 200 µl đệm rửa vào mỗi giếng của đĩa xét nghiệm. Dán và trộn trên máy lắc trong 10 phút ở nhiệt độ phòng (20­25 oC).

2.Đổ bỏ

đệm rửa và loại bỏ

tất cả

lượng còn thừa từ

tất cả

các

giếng bằng cách dốc ngược đĩa và đập nhẹ trên khăn thấm vài lần.

3.Thêm 25 µl mỗi chất chuẩn hoặc mẫu chứng vào các giếng phù hợp. Đệm phản ứng được dùng là nồng độ chuẩn 0 ng/ml.

4.Thêm 25 µl đệm phản ứng vào các giếng mẫu.

5.Thêm 25 µl dung dịch pha loãng chuẩn vào giếng nền (background), các giếng chuẩn và chứng.

6.Thêm 25 µl huyết thanh đã pha loãng 200 lần vào các giếng tương ứng.

7. Trộn lọ hỗn hợp và thêm 25 µl các hạt từ đã trộn vào mỗi giếng (chú ý: trong suốt quá trình thêm hạt từ, lắc lọ hạt từ ngắt quãng để tránh lắng đọng hạt từ xuống dưới).

8.Dán đĩa bằng miếng dán đĩa. Bọc lại đĩa bằng lá nhôm và ủ trên máy lắc qua đêm (16­18 tiếng) ở nhiệt độ 2­8 độ C.

9.Nhẹ

nhàng đổ

bỏ các dịch trong giếng và rửa đĩa 3 lần theo phần

hướng dẫn rửa đĩa.

10.Thêm 50 µl các kháng thể phát hiện vào mỗi giếng (để các lọ đựng kháng thể này ấm lên ở nhiệt độ phòng trước khi sử dụng)

11.Dán và bọc đĩa bằng lá nhôm và ủ trên máy lắc trong 1 tiếng ở nhiệt độ phòng (20­25 độ C).

12.Thêm 50 µl Streptavidin­Phycoerythrin vào mỗi giếng có chứa 50 µl kháng thể phát hiện.

13. Dán, bọc đĩa lại bằng lá nhôm và ủ trên máy lắc trong 30 phút ở

nhiệt độ phòng.

14.Nhẹ nhàng bỏ đi các dịch và rửa đĩa 3 lần theo phần hướng dẫn rửa

đĩa.

15.Thêm 150 µl dung dịch tải mẫu (Sheath) vào tất cả các giếng, lắc trên máy lắc trong 5 phút để trộn đều hạt từ.

16.Chạy đĩa trên hệ thống Luminex 200TM, HTS, FLEXMAP 3D với phần mềm Xponent.

2.2.3.3. Xác định tính đa hình các gen FCN2 và MBL2.

­ Khảo sát tính đa hình các gen FCN2 và MBL2 bằng phương pháp

giải trình tự gen: lựa chọn các cặp mồi đặc hiệu và khuếch đại các đoạn DNA nằm trong gen FCN2 và MBL2. Các nghiên cứu trước đây về tính đa hình gen FCN2 và MBL2 đã chỉ ra các đa hình ảnh hưởng đến nồng độ cũng như hoạt tính của protein MBL và Ficolin­2 từ đó liên quan đến tăng tính nhạy cảm của các cá thể mang chúng với các bệnh lý đặc biệt là bệnh lý

truyền nhiễm tập trung chủ

yếu

ở vùng promotor và Exon 1 của gen

MBL2 , và vùng promotor và Exon 7, Exon 8 của gen FCN2 , . Do đó trong nghiên cứu này chúng tôi cũng tập trung đánh giá tính đa hình gen FCN2 và

MBL2 tại các vùng này. Trình tự nghiên cứu của Tong H.V. và cs , :

các cặp mồi đặc hiệu tham khảo trong

Bảng 2.1: Trình tự các cặp mồi đặc hiệu

Tên cặp mồi

Trình tự	Kích thước sản phẩm
Nhân đoạn promoter gen FCN2
FCN2.Pro.F	5’­ATT GAA GGA AAA TCC GAT GGG­3’	1278 bp
FCN2.Pro.R	5’­GAA GCC ACC AAT CAC GAA G­3’
Nhân đoạn exon 7, intron 7 và exon 8 gen FCN2
EX7.F	5’­CCA GCT CCC ATG TCT AAA GG­3’	1132 bp
EX7.R	5’­TTA CAA ACC GTA GGG CCA AG­3’
Nhân đoạn promoter gen MBL2
MBL.pro.F	5’­GGCCAACGTAGTAAGAAATTTCCAGAGA­3’	696 bp

Có thể bạn quan tâm!

• Chức Năng Của Protein Ficolin­2 Gắn Với Carbohydrate
• Vai Trò Của Mbl, Ficolin­2 Và Tính Đa Hình Gen Mbl2, Fcn2 Trong Sốt Xuất Huyết Dengue
• Chỉ Tiêu Về Lâm Sàng, Cận Lâm Sàng
• Một Số Đặc Điểm Nhóm Bệnh Nhân Sốt Xuất Huyết Dengue
• Tính Đa Hình Gen Fcn2 Ởcác Nhóm Đối Tượng Nghiên Cứu
• Nghiên cứu tính đa hình gen MBL2, FCN2 và nồng độ protein MBL, Ficolin-2 ở bệnh nhân sốt xuất huyết Dengue - 12

Xem toàn bộ 189 trang tài liệu này.

MBL.pro.R

5’­GAGGGAGTGATGGAAACAGGGACA­3’
Nhân đoạn exon 1 gen MBL2
MBL.EX1.F	5’­GTGGCAGCGTCTTACTCAGAAAC­3’	343bp
MBL.EX1.R	5’­TGGGCTGGCAAGACAACTATTAG­3’

­Thành phần phản ứng PCR nhân gen:

Master mix: 12,5; primers (10pmol/μl): 0,5μl; nước deion: 7 μl; mẫu: 5 μl, tổng thể tích 25 μl.

­Chu trình nhiệt phản ứng PCR:

+ nhân vùng promoter, exon 7, exon 8 của gen FCN2: 95ºC trong

5phút; 40 chu kì 94ºC trong 30 giây, 56ºC trong 30 giây và 72ºC trong 30 giây; ổn định chuỗi cuối cùng ở 72ºC trong 5 phút.

+ nhân vùng promoter, exon 1 của gen MBL2: 94ºC trong 5 phút; 35

chu kì 94ºC trong 30 giây, 68ºC trong 30 giây và 72ºC trong 1 phút 30 giây;

ổn định chuỗi cuối cùng ở 72ºC trong 2 phút.

­ Tinh sạch các sản phẩm PCR bằng kít Exo­SAP­IT.

­ Sản phẩm PCR sau tinh sạch được giải trình tự Sanger sử dụng kit BigDye™ Terminator v1.1, điện di mao quản trên máy ABI 3130XL.

­ Dựa trên các trình tự gen thu được, phân tích và xác định các điểm đa hình nằm trên gen MBL2 và FCN2:

+ Phân tích 6 điểm đa hình gen MBL2: 2 điểm trong vùng promoter

­550G>C, ­221G>C (hai SNPs liên kết chặt chẽ trong vùng promoter), 1

SNP +4C>T trong vùng 5'UTR và 3 điểm trong vùng exon1 codon 52 (MBL2*D), 54 (MBL2*B), và 57 (MBL2*C) bằng giải trình tự gen trực tiếp ở nhóm bệnh và nhóm chứng.

+ Phân tích 9 điểm đa hình của gen FCN2: 5 điểm đa hình trong vùng promoter (­986G/A; ­902G/T; ­602G/A); ­64A/C; ­4A/G) và 4 điểm đa hình trong vùng exon7, intron 7, exon 8 (+6031A/G; +6220T/G); +6359C/T;