Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase và α-amylase của loài dây thìa canh - Gymnema sylvestre Retz. R.BR. EX SM. và dây thìa canh lá to - Gymnema latifolium Wall. EX wight

LDL Low density lipoprotein lipoprotein mật độ thấp MIC Minimum inhibitory concentration Nồng độ ức chế tối thiểu

MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide

ROESY Rotating frame Overhause Effect Spectroscopy

3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide Phổ ROESY

OD Optical density Mật độ quang

Ole Oleandropyranose Đường oleandropyranose

pNPG 4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside 4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside TBARS Thiobarbituric acid reactive substances Các chất phản ứng với axit

thiobarbituric

TGs Triglyceride Triglyceride

Thv Thevetopyranose Đường thevetopyranose

TLC Thin layer chromatography Sắc ký lớp mỏng

TLTK Tài liệu tham khảo

VLDL Very low density lipoprotein Lipoprotein mật độ rất thấp

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Danh sách và nơi phân bố các loài thuộc chi Gymnema 4

Bảng 1.2. Danh sách các loài thuộc chi Gymnema ở Việt Nam 5

Bảng 1.3. Các hợp chất pregnane glycoside từ chi Gymnema 7

Bảng 1.4. Các hợp chất triterpennoid khung oleanane từ chi Gymnema 9

Bảng 1.5. Các hợp chất khung dammarane và lupane từ chi Gymnema 16

Bảng 1.6. Phenolic và một số hợp chất khác từ chi Gymnema 17

Bảng 2.1. Giá trị độ quay cực riêng của các đường đơn sau thủy phân 34

Bảng 2.2. Hoạt tính ức chế α-glucosidase của các hợp chất từ G.sylvestre 47

Bảng 2.3. Hoạt tính ức chế α-glucosidase của các hợp chất từ G. latifolium 47

Bảng 2.4. Hoạt tính ức chế α-amylase của các hợp chất phân lập từ G. sylvestre 47

Bảng 2.5. Hoạt tính ức chế α-amylase của các hợp chất từ loài G. latifolium 48

Bảng 3.1. Số liệu phổ NMR của hợp chất GS1 57

Bảng 3.2. Số liệu phổ NMR của hợp chất GS2 và hợp chất tham khảo 63

Bảng 3.3. Số liệu phổ NMR của hợp chất GS3 và chất tham khảo 65

Bảng 3.4. Số liệu phổ NMR của hợp chất GS4 và chất tham khảo 67

Bảng 3.5. Số liệu phổ NMR của hợp chất GS5 và chất tham khảo 69

Bảng 3.6. Số liệu phổ NMR của hợp chất GS6 và chất tham khảo 71

Bảng 3.7. Số liệu phổ NMR của hợp chất GS7 74

Bảng 3.8. Số liệu phổ NMR của hợp chất GS8 76

Bảng 3.9. Số liệu phổ NMR của hợp chất GS9 và hợp chất tham khảo 78

Bảng 3.10. Số liệu phổ NMR của hợp chất GS10 và hợp chất tham khảo 80

Bảng 3.11. Số liệu phổ NMR của hợp chất GS11 và hợp chất tham khảo 82

Bảng 3.12. Số liệu phổ NMR của hợp chất GS12 và hợp chất tham khảo 84

Bảng 3.13. Số liệu phổ NMR của hợp chất GS13 và hợp chất tham khảo 86

Bảng 3.14. Số liệu phổ NMR của hợp chất GS14 và hợp chất tham khảo 88

Bảng 3.15. Số liệu phổ NMR của hợp chất GS15 và hợp chất tham khảo 90

Bảng 3.16. Số liệu phổ NMR của hợp chất GS16 và hợp chất tham khảo 92

Bảng 3.17. Số liệu phổ NMR của hợp chất GL1 94

Bảng 3.18. Số liệu phổ NMR của hợp chất GL2 97

Bảng 3.19. Số liệu phổ NMR của hợp chất GL3 99

Bảng 3.20. Số liệu phổ NMR của hợp chất GL4 101

Bảng 3.21. Số liệu phổ NMR của hợp chất GL5 và hợp chất tham khảo 103

Bảng 3.22. Số liệu phổ NMR của hợp chất GL6 và hợp chất tham khảo 105

Bảng 3.23. Số liệu phổ NMR của hợp chất GL8 và hợp chất tham khảo 107

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Hình ảnh một số loài thuộc chi Gymnema 3

Hình 1.2. Cấu trúc các hợp chất pregnane glycoside từ chi Gymnema 9

Hình 1.3. Cấu trúc các hợp chất khung oleanane từ chi Gymnema 15

Hình 1.4. Cấu trúc các hợp chất khung dammarane và lupane từ chi Gymnema 17

Hình 1.5. Cấu trúc các phenolic và một số hợp chất khác từ chi Gymnema 19

Hình 1.6. Ý nghĩa của việc ức chế enzyme α-glucosidase và enzyme α-amylase trong giảm đường huyết 27

Hình 2.1. Dây thìa canh (G. sylvestre) 31

Hình 2.2. Dây thìa canh lá to (G. latifolium) 31

Hình 2.3. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ loài G. sylvestre 38

Hình 2.4. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ loài G.latifolium 41

Hình 3.1. Cấu trúc hóa học các hợp chất được phân lập từ loài G. sylvestre 49

Hình 3.2. Cấu trúc hóa học các hợp chất được phân lập từ loài G. latifolium 50

Hình 3.3. Cấu trúc khung pregnane 51

Hình 3.4. Cấu trúc hóa học của hợp chất GS1 53

Hình 3.5. Các tương tác HMBC, COSY và NOESY chính của hợp chất GS1 55

Hình 3.6. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất GS1 58

Hình 3.7. Phổ 1H NMR của hợp chất GS1 58

Hình 3.8. Phổ 13C-NMR của hợp chất GS1 59

Hình 3.9. Phổ DEPT-135 của hợp chất GS1 59

Hình 3.10. Phổ HSQC của hợp chất GS1 60

Hình 3.11. Phổ HMBC của hợp chất GS1 60

Hình 3.12. Phổ COSY của hợp chất GS1 61

Hình 3.13. Phổ ROESY của hợp chất GS1 61

Hình 3.14. Cấu trúc hóa học của hợp chất GS2 62

Hình 3.15. Các tương tác HMBC, COSY chính của hợp chất GS2 63

Hình 3.16. Cấu trúc hóa học của hợp chất GS3 64

Hình 3.17. Các tương tác HMBC và COSY chính của hợp chất GS3 65

Hình 3.18. Cấu trúc hóa học của hợp chất GS4 66

Hình 3.19. Các tương tác HMBC và COSY chính của hợp chất GS4 66

Hình 3.20. Cấu trúc hóa học của hợp chất GS5 68

Hình 3.21. Các tương tác HMBC và COSY chính của hợp chất GS5 70

Hình 3.22. Cấu trúc hóa học của hợp chất GS6 70

Hình 3.23. Các tương tác HMBC và COSY chính của hợp chất GS6 72

Hình 3.24. Cấu trúc hóa học của hợp chất GS7 73

Hình 3.25. Các tương tác HMBC và COSY chính của hợp chất GS7 75

Hình 3.26. Cấu trúc hóa học của hợp chất GS8 75

Hình 3.27. Các tương tác HMBC và COSY chính của hợp chất GS8 77

Hình 3.28. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất GS9 77

Hình 3.29. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất GS10 79

Hình 3.30. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất GS11 81

Hình 3.31. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất GS12 83

Hình 3.32. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất GS13 84

Hình 3.33. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất GS14 87

Hình 3.34. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất GS15 89

Hình 3.35. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất GS16 91

Hình 3.36. Cấu trúc hóa học của hợp chất GL1 93

Hình 3.37. Các tương tác HMBC, COSY chính của hợp chất GL1 95

Hình 3.38. Cấu trúc hóa học của hợp chất GL2 95

Hình 3.39. Các tương tác HMBC, COSY chính của hợp chất GL2 96

Hình 3.40. Cấu trúc hóa học của hợp chất GL3 98

Hình 3.41. Các tương tác HMBC, COSY chính của hợp chất GL3 98

Hình 3.42. Cấu trúc hóa học của hợp chất GL4 100

Hình 3.43. Các tương tác HMBC, COSY chính của hợp chất GL4 102

Hình 3.44. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất GL5 102

Hình 3.45. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất GL6 104

Hình 3.46. Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất GL8 106

Hình 3.47. Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase của các hợp chất và cặn chiết từ loài G. sylvestre 109

Hình 3.48. Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase của các hợp chất và cặn chiết từ loài G. latifolium

...............................................................................................................................................................109

Hình 3.49. Hoạttínhứcchếenzymeα-amylasecủacáchợp chấtvàcặn chiếttừloàiG. sylvestre 110

Hình 3.50. Hoạt tính ức chế enzyme α-amylase của các hợp chất và cặn chiết từ loài G. latifolium

...............................................................................................................................................................110

MỞ ĐẦU

Tiểu đường là một nhóm bệnh rối loạn chuyển hóa cacbohydrat, mỡ và protein khi hormone insulin của tuyến tụy bị thiếu hay giảm tác động trong cơ thể, biểu hiện bằng mức đường trong máu luôn cao. Trong giai đoạn mới phát bệnh bệnh nhân thường đi tiểu nhiều, tiểu ban đêm và do đó làm khát nước, về lâu dài gây phá hủy các hệ thống trên cơ thể, đặc biệt là các mạch máu và dây thần kinh. Theo thời gian, bệnh tiểu đường có thể dẫn đến mù, suy thận và tổn thương thần kinh. Tiểu đường cũng là một trong những yếu tố quan trọng thúc đẩy quá trình hình thành xơ vữa động mạch, dẫn đến đột quỵ, bệnh tim mạch. Các biến chứng mãn tính xảy ra sớm hay muộn, nặng hay nhẹ rất khác biệt ở từng bệnh nhân. Nhưng nói chung, nếu kiểm soát tốt đường huyết, chúng ta có thể ngăn ngừa hoặc làm chậm hay nhẹ đi các biến chứng mãn tính của bệnh tiểu đường [1].

Xu hướng sử dụng nguồn dược liệu tự nhiên nói chung, đặc biệt là các hợp chất thiên nhiên có nguồn gốc từ thực vật để chữa trị một số bệnh nhiệt đới và những bệnh hiểm nghèo đã và đang là mối quan tâm không chỉ của ngành dược ở nước ta mà còn của các nước trong khu vực cũng như các nước trên thế giới. Nhiều cây thuốc bản địa đã được phát hiện có tác dụng làm hạ đường huyết. Đây là một lợi thế vì khả năng cung cấp nguyên liệu để điều trị cũng như ít tác dụng phụ. Theo thống kê, trên thế giới có khoảng 800 loài được cho là có khả năng điều trị bệnh tiểu đường [2]. Tiêu biểu trong số đó là các loài: dây thìa canh (G. sylvestre), mướp đắng (Momordica charantia), cải bẹ xanh (Brassica Juncea), bồ công anh (Elephantopus scaber), cỏ tóc tiên (Liriope spicata), thầu dầu (Ricinus communis), khoai sâm (Smallanthus sonchifolius), trạch lan (Vernonia anthelmintica), … Các loài thuộc chi Gymnema thuộc họ Trúc đào (Apocynaceae) đã nhận được rất nhiều quan tâm của các nhà khoa học trên thế giới. Các loài thuộc chi Gymnema được coi như là nguồn cung cấp các hoạt chất và thể hiện các hoạt tính sinh học (hạ đường huyết, kháng tế bào ung thư, chống oxi hóa, kháng viêm, …). Đặc biệt, loài G. sylvestre được sử dụng rộng rãi như là một loại thảo dược chuyên trị bệnh tiểu đường từ trên 2000 năm ở Ấn Độ. Loài này còn được dùng để điều trị hen suyễn, đau mắt, viêm và rắn cắn. Bên cạnh đó, G. sylvestre có tính kháng khuẩn và bảo vệ tế bào gan. Tuy nhiên ở Việt Nam chỉ mới có một vài nghiên cứu về thành phần hóa học và dược học của loài Gymnema sp. Xuất phát từ điểm đó,

chúng tôi đề xuất đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase và α-amylase của loài dây thìa canh - Gymnema sylvestre (Retz.) R.Br. ex Sm. và dây thìa canh lá to - Gymnema latifolium Wall. ex Wight”.

Mục tiêu của luận án:

Mục tiêu của luận án là xác định được thành phần hóa học chủ yếu của thân và lá của hai loài Gymnema sylvestre và Gymnema latifolium ở Việt Nam và đánh giá được tác dụng ức chế enzyme α-glucosidase và α-amylase in vitro của các hợp chất phân lập được.

Nội dung luận án bao gồm:

1. Phân lập các hợp chất từ thân và lá loài G. sylvestre và G. latifolium ở Việt Nam.

2. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được bằng các phương pháp vật lý, hóa học.

3. Đánh giá tác dụng ức chế enzyme α-glucosidase và α-amylase của các hợp chất phân lập được từ loài G. sylvestre và G. latifolium.

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. Giới thiệu về chi Gymnema

1.1.1. Đặc điểm thực vật của chi Gymnema

Chi Gymnema (chi Lòa ti) thuộc họ Trúc đào (Apocynaceae), bộ Long đởm (Gentianales), phân lớp Bạc hà (Lamiidae), lớp Ngọc lan (Magnoliopsida), ngành Ngọc lan (Magnoliophyta). Các cây thuộc chi này là cây leo, không có rễ phụ trên thân, lá mọc đối, không nạc, cụm hoa xim, tán hoặc chùm, hoa nhỏ, có thùy đài nhỏ, hình trứng, đầu tù, gốc đài có tuyến, tràng hình bánh xe, thùy tràng không gập trong nụ, tiền khai hoa vặn phải. Tràng phụ đơn, vảy tràng phụ đính ở tràng, thường có các hàng lông xếp dọc theo tràng. Chỉ nhị dính nhau, bao phấn 2 ô, thường có phần phụ ở đỉnh, hạt phấn dính thành khối phấn và có sáp bao bên ngoài vách khối phấn, khối phấn không có mỏm ở đỉnh, cơ quan truyền phấn có gót dính và 2 chuôi, khối phấn hướng lên, chỉ có một khối phấn trong mỗi ô phấn. Đầu nhụy phình lên hình trứng, đỉnh bầu không thót lại thành dạng vòi nhụy. Cột nhị- nhụy hình ống nhọn đầu.

Gymnema sylvestre [3] Gymnema reticulatum[3]

Gymnema foetidum [3] Gymnema inodorum[4] Hình 1.1. Hình ảnh một số loài thuộc chi Gymnema

Theo thống kê của hiệp hội các nhà thực vật học thế giới “http://www.theplantlist.org”, thư viện trực tuyến về danh mục các loài thực vật học trên thế giới, chi Gymnema hiện nay có 52 loài được công nhận (xem Bảng 1.1).

Bảng 1.1. Danh sách và nơi phân bố các loài thuộc chi Gymnema

Tên khoa học	Phân bố	TT	Tên khoa học	Phân bố
1	G. acuminatum Wall.	Nepal, Ấn Độ, Malaysia	27	G. longiretinaculatum Tsian g	Trung Quốc
2	G. albidum Decne.	Timor	28	G.lushaiense M.A.Rahm an & Wilcock	Assam
3	G. albiflorum Costantin	Việt Nam	29	G. macrothyrsa Warb.	Sulawesi
4	G. brevifolium Benth.	Úc	30	G. maingayi Hook.f.	Malacca
5	G. calycinum Schltr.	Luzon	31	G. mariae Schltr.	Philippin
6	G. chalmersii Schltr.	New Guinea	32	G. micradenium Benth.	Queenland
7	G. cumingii Schltr.	Philippin	33	G. molle Wall. ex Wight	Myanmar
8	G. cuspidatum (Thunb.) Kuntze	Ấn Độ, Sri Lanka	34	G. montanum Hook.f.	Ấn Độ
9	G. decaisneasum	Tamil Nadu	35	G. montanum var. beddo mei Hook.f.
10	G. dissitiflorum Ridl.	Malaysia	36	G. muelleri Benth.	Úc
11	G. dunnii (Maiden & Betche) P.I.Forst.	Úc	37	G. pachyglossum Schltr.	Luzon
12	G. elegans Wight & Arn.	Tamil Nadu	38	G. piperii Schltr.	Mindanao
13	G. erianthum Decne.	New Caledonia	39	G. pleiadenium F.Muell.	Queenland
14	G. foetidum Tsiang	Việt Nam, Trung Quốc	40	G. recurvifolium Blume	New Guinea
15	G. glabrum Wight	Myanmar	41	G. rotundatum Thwaites	Sri Lanka
16	G. griffithii Craib	Thái Lan, Việt Nam	42	G. rufescens Decne.	Madagasca
17	G. hainanense Tsiang	Trung Quốc	43	G. schlechterianum Warb.	Philippin
18	G. hirtum Ridl.	Malaysia	44	G. spirei Costantin	Lào
19	G. inodorum (Lour.) Decne.	Trung Quốc, Ấn Độ, Đông Nam Á	45	G. suborbiculare K.Schum.	New Guinea
20	G. javanicum Koord.	Java	46	G. sylvestre (Retz).R.Br. ex Sm.	Việt Nam, Trung Quốc, Ấn Độ
21	G. khandalense Santapau	Maharashtra	47	G. syringaefolium (Decne.) Costantin	Việt Nam, Timor
22	G. kollimalayanum A.Ram ach & M.B.Viswan	Ấn Độ	48	G. thorelii Costantin	Lào
23	G. lacei Craib	Myanma, Bangladesh	49	G. tricholepis Schltr.	New Guinea
24	G. lactiferum (L.) R.Br. ex Schult.	Ân Độ, Siriranka	50	G. trinerve R.Br.	Úc
25	G. latifolium Wall. ex Wight	Trung Quốc, Việt Nam	51	G. uncarioides Schltr.	Luzon
26	G. littorale Blume	Java	52	G. yunnanense Tsiang	Trung Quốc