Phương Pháp Thử Hoạt Tính Gây Độc Tế Bào Và Hoạt Tính Kháng Vi Sinh Vật Kiểm Định

(+)ESI-QTOF cho tín hiệu về số khối của các ion mảnh đặc trưng theo B.C Das [66] cho phép xác định vị trí các nhóm hydroxyl, vòng THF trong phân tử acetogenin. Phương pháp phổ khối lượng này và phương pháp đo nhiễu xạ tia X được đo tại Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên - Cộng hòa Pháp.

Độ quay cực được đo bằng máy Jasco P-2000 của hãng Jasco-Mỹ và điểm nóng chảy được đo trên máy MEL TEMP3.0 của hãng Thermo Scientific-Mỹ tại Viện Hóa Sinh biển (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam).

2.5 Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào và hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định

2.5.1 Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào

Dịch chiết EtOAc của vỏ, quả cây Giác đế đài to và dịch chiết EtOAc của quả, lá cây Giác đế cuống dài được thử sơ bộ hoạt tính gây độc tế bào đối với dòng tế bào KB. Dịch chiết CH2Cl2, MeOH và một số phân đoạn của vỏ, quả cây Giác đế đài to và một số chất sạch được thử hoạt tính gây độc tế bào đối với dòng tế bào KB và dòng tế bào phổi nguyên bào sợi của người MRC-5. Các phép thử này được tiến hành tại Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên – Cộng hòa Pháp.

Các chất còn lại được phân lập từ vỏ, quả cây Giác đế đài to và từ quả, lá cây Giác đế cuống dài được thử hoạt tính gây độc tế bào và hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa kỳ (NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư ở điều kiện in vitro. Bốn dòng tế bào

ung thư ở người được cung cấp bởi ATTC gồm: KB - ung thư biểu mô (CCL – 17TM); Hep G2 - ung thư gan (HB – 8065TM); MCF-7 - ung thư vú (HTB – 22TM) và LU-1 - ung thư phổi (HTB-57TM). Sử dụng phương pháp MTT assay: Tế bào được nuôi cấy trong môi trường DMEM có bổ sung 10% huyết thanh ở điều kiện 37 oC, 5% CO2, độ ẩm 95%. Nồng độ tế bào dùng cho thử độc tính là 3x104/mL. Chất thử được pha loãng thành một dãy nồng độ thích hợp và được ủ cùng tế bào nuôi ở 37 oC, 5% CO2/3 ngày. Sau 72 giờ nuôi cấy ủ với MTT 0,2 mg/mL trong 4 giờ. Dừng phản ứng bằng DMSO. Đọc OD trên máy quang phổ bước sóng 540 nm. Giá trị

IC50 (nồng độ ức chế 50% sự tăng trưởng của tế bào thử nghiệm) được tính toán dựa trên số liệu phần trăm kìm hãm phát triển của tế bào bằng phần mềm máy tính table curve [67].

2.5.2 Phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định

Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được thử theo phương pháp pha loãng đa nồng độ F. Hadacek và H. Greger [68]. Vi khuẩn và nấm kiểm định gây bệnh ở người được sử dụng trong phép thử gồm:

- Bacillus subtilis: là trực khuẩn gram (+), sinh bào tử, thường không gây bệnh.

- Staphylococcus aureus: cầu khuẩn gram (+), gây mủ các vết thương, vết bỏng, gây viêm họng, nhiễm trùng có mủ trên da và các cơ quan nội tạng.

- Lactobacillus fermentum: vi khuẩn gram (+), là loại vi khuẩn đường ruột lên men có ích, thường có mặt trong hệ tiêu hoá của người và động vật.

- Escherichia coli: vi khuẩn gram (), gây một số bệnh về đường tiêu hoá như viêm dạ dày, viêm đại tràng, viêm ruột, viêm lỵ trực khuẩn.

- Pseudomonas aeruginosa: vi khuẩn gram (), trực khuẩn mủ xanh, gây nhiễm trùng huyết, gây viêm đường tiết niệu, viêm màng não, màng trong tim, viêm ruột.

- Salmonella enterica: vi khuẩn gram (), vi khuẩn gây bệnh thương hàn, nhiễm trùng đường ruột ở người và động vật.

- Candida albicans: là nấm men, thường gây bệnh tưa lưỡi ở trẻ em và các bệnh phụ khoa.

Môi trường nuôi cấy: MHB (Mueller-Hinton Broth), MHA (Mueller-Hinton Agar); TSB (Tryptic Soy Broth); TSA (Tryptic Soy Agar) cho vi khuẩn; SDB (Sabouraud-2% dextrose broth) và SA (Sabouraud-4% dextrose agar) cho nấm men. Mẫu ban đầu được pha loãng trong DMSO và nước cất tiệt trùng thành một dãy 05 nồng độ theo yêu cầu và mục đích thử. Nồng độ thử cao nhất đối với dịch chiết là 256 g/mL và với chất sạch là 128 g/mL. Lấy 10 L dung dịch mẫu thử ở các nồng độ vào đĩa 96 giếng, thêm 200l dung dịch vi sinh vật kiểm định có nồng độ

5.105 CFU/mL, ủ ở 37oC/24h. Giá trị MIC được xác định tại giếng có nồng độ chất

thử thấp nhất ức chế sự phát triển của vi sinh vật. Giá trị IC50 được tính toán dựa trên số liệu đo độ đục của môi trường nuôi cấy bằng máy quang phổ TECAN và phần mềm raw data.

CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM

3.1 Tách chiết, phân lập các chất từ cây Giác đế đài to

3.1.1 Vỏ cây Giác đế đài to

3.1.1.1 Xử lý mẫu thực vật và chiết tách

Mẫu vỏ cây Giác đế đài to sau khi phơi khô, xay nhỏ (1,98 kg) được ngâm chiết với CH2Cl2 trong 24h ở nhiệt độ phòng (5 lít × 3 lần). Gộp các dịch chiết đã lọc, cất loại dung môi dưới áp suất thấp thu được 63,8 g cặn chiết CH2Cl2. Mẫu vỏ thân cây còn lại được ngâm chiết tiếp với MeOH (5 lít × 24 h/lần × 3 lần). Sau khi cô cạn dung môi MeOH trên máy quay cất chân không thu được 40,3 g cặn chiết MeOH (Hình 3.1.).

Có thể bạn quan tâm!

• Một Số Styryl-Lactone Khác Từ Chi Goniothalamus
• Con Đường Sinh Tổng Hợp Các Khung Styryl-Lactone Cơ Bản
• Phương Pháp Phân Tích, Phân Tách Các Hỗn Hợp Và Phân Lập Các Hợp Chất Từ Mẫu Thực Vật
• Sơ Đồ Phân Lập Các Chất Từ Dịch Chiết Ch 2 Cl 2 Quả Cây Giác Đế Đài To
• (2’-Hydroxytetracosanoylamino)Octadecane-1,3,4-Triol (Gm19):
• Sơ Đồ Ngâm, Chiết Phân Bố Lá Cây Giác Đế Cuống Dài

Xem toàn bộ 184 trang tài liệu này.

Hình 3.1. Sơ đồ ngâm chiết vỏ cây Giác đế đài to

Quá trình phân lập các chất từ cặn CH2Cl2 được trình bày trong Hình 3.2:

Tiến hành sắc kí cột silica gel với hệ dung môi CH2Cl2-MeOH gradient phần cặn CH2Cl2 thu được 9 phân đoạn kí hiệu F1-F9. Từ phân đoạn F2, sau khi tinh chế bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi n-hexane-CH2Cl2 gradient thu được 7 phân đoạn nhỏ, ký hiệu từ F2.1-F2.7. Tinh chế phân đoạn F2.4 bằng cột sephadex với dung môi MeOH thu được 76 mg chất GM6.

Hình 3.2. Sơ đồ phân lập dịch chiết CH2Cl2 vỏ cây Giác đế đài to

Từ phân đoạn F3, sau khi được tinh chế bằng sắc kí cột silica gel với hệ dung môi n-hexane-EtOAc gradient (5 - 80%) thu được 10 phân đoạn nhỏ, kí hiệu từ F3.1-F3.10. Kết tinh phân đoạn F3.2 với hệ dung môi CH2Cl2-MeOH thu được 20 mg chất GM10. Từ phân đoạn F5, sau khi được tinh chế bằng sắc kí cột silica gel với hệ dung môi n-hexane-EtOAc gradient (10 - 80%) thu được 9 phân đoạn nhỏ, kí hiệu từ F5.1-F5.9. Phân đoạn F5.5 được tinh chế bằng sắc kí cột silica gel với hệ dung môi rửa giải là CH2Cl2-acetone gradient (0 - 10%) thu được 1,1 g chất GM1. Sau khi kết tinh phân đoạn F5.7 trong hệ dung môi n-hexane-EtOAc thu được 145

mg chất GM2. Từ phân đoạn F5.8, sau khi chạy cột sephadex với hệ dung môi CH2Cl2-MeOH 1/9 thu được 547 mg chất GM3.

Quá trình phân lập các chất từ cặn MeOH được trình bày trong Hình 3.3:

Hình 3.3. Sơ đồ phân lập dịch chiết MeOH vỏ cây Giác đế đài to

Phần cặn MeOH được tinh chế bằng sắc kí cột với hệ dung môi CH2Cl2- MeOH gradient thu được 10 phân đoạn F1-F10. Từ phân đoạn F3, sau khi tinh chế bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi n-hexane-CH2Cl2 1/1 thu được 8 phân đoạn nhỏ, ký hiệu từ F3.1-F3.8. Tiếp tục tinh chế phân đoạn F3.5 bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi n-hexane-CH2Cl2 1/1 thu được 43 mg chất GM7. Tinh

chế phân đoạn F3.7 bằng cột sephadex với dung môi MeOH thu được 2 phân đoạn. Tiến hành sắc ký bản mỏng điều chế phân đoạn thứ hai với hệ dung môi n-hexane- CH2Cl2 1/1 thu được 14 mg chất GM5. Từ phân đoạn F3.8, sau khi chạy cột sephadex với dung môi MeOH thu được 17,5 mg chất GM9. Từ phân đoạn F4, sau khi tinh chế bằng sắc kí cột silica gel với hệ dung môi n-hexane-acetone gradient (8-50%) thu được 15 phân đoạn nhỏ kí hiệu từ F4.1-F4.15. Phân đoạn F4.13 được kết tinh bằng hệ dung môi CH2Cl2-MeOH thu được 6,4 mg chất GM8. Tinh chế phân đoạn F6 bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi CH2Cl2-acetone gradient thu được 4 phân đoạn nhỏ, kí hiệu F6.1-F6.4. Tiếp tục tinh chế phân đoạn nhỏ F6.4 bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi n-hexane-acetone gradient thu được 30 mg chất GM3. Phân đoạn F8 được kết tinh trong hệ dung môi CH2Cl2-MeOH thu được 7,5 mg chất GM4.

3.1.1.2 Dữ kiện phổ và hằng số vật lý của các hợp chất được phân lập từ vỏ cây Giác đế đài to

Altholactone (GM1):

25

Chất dầu màu vàng nhạt; Rf = 0,67 (n-hexane-EtOAc 30/70, v/v); []D + 233,5o (c 0,65; EtOH).

FT-IR (film) νmax (cm1): 3432, 3070, 2928, 1726, 1637, 1454, 1368, 1252,

1093, 1022, 823, 704, 640, 448.

max

UV MeOH nm (log ): 207 (4,34). (+)-ESI-MS: m/z 255 [M+Na]+.

1H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ (ppm) 7,29 (5H, m, C6H5); 6,98 (1H, dd, J=5,0

10,0 Hz, H-4); 6,20 (1H, d, J=10,0 Hz, H-3); 4,90 (1H, dd, J=2,5; 5,5 Hz, H-6);

4,73 (1H, d, J=5,5 Hz, H-8); 4,61 (1H, t, J=5,0 Hz; H-5); 4,42 (1H, m, H-7); 3,62 (1H, d, J=3,5 Hz, OH).

13C-NMR (125 MHz, CDCl3): δ (ppm) 161,6 (C-2); 140,5 (C-4); 138,1 (C-9);

128,6 (C-11, C-13); 128,3 (C-12); 126,1 (C-10, C-14); 123,6 (C-3); 86,6 (C-6); 86,0

(C-8); 83,5 (C-7); 68,1 (C-5).

Goniopypyrone (GM2):

25 o

Tinh thể hình kim màu trắng; đnc. 179-181 oC; Rf = 0,42 (n-hexane-EtOAc 30/70, v/v); []D + 61,7 (c 0,3; EtOH).

FT-IR (KBr) νmax (cm1): 3400, 3272, 2986, 2872, 1741, 1447, 1346, 1223,

1169, 1058, 830, 740, 708, 513, 450.

max

UV MeOH nm (log ): 206 (3,93); 252 (2,44).

(+)-ESI-MS: m/z 273 [M+Na]+.

1H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ (ppm) 7,42 (4H, m); 7,37 (1H, m); 5,01 (1H, br s, H-8); 4,80 (1H, m, H-5); 4,46 (1H, m, H-4); 4,14 (2H, m, H-7, OH); 4,02 (1H,

m, H-6); 3,08 (1H, dd, J=1,5; 19,5 Hz, H-3a); 3,00 (1H, dd, J=5,0; 19,5 Hz, H-3b); 2,37 (1H, d, J=3,5 Hz, OH).

13C-NMR (125 MHz, CDCl3): δ (ppm) 167,8 (C-2); 135,9 (C-9); 129,0 (C-11,

C-13); 128,6 (C-12); 126,2 (C-10, C-14); 72,7 (C-6); 70,9 (C-4); 70,4 (C-8); 70,1

(C-7); 64,5 (C-5); 35,2 (C-3).

Goniofufurone (GM3):

25 o

Tinh thể hình kim màu trắng; đnc. 152-153 oC; Rf = 0,39 (n-hexane-EtOAc 30/70, v/v); []D + 11,5 (c 0,4, EtOH).

FT-IR (KBr) νmax (cm1): 3420, 3350, 2996, 2862, 1746, 1450, 1342, 1191,

max

1046, 905, 702, 635, 493. UV MeOH nm (log ): 206 (3,95); 258 (2,31).

(+)-ESI-MS: m/z 273 [M+Na]+.

1H-NMR (500 MHz, CD3OD): δ (ppm) 7,43 (2H, d, J=7,5 Hz, H-10, H-14);

7,35 (2H, t, J=7,5 Hz, H-11, H-13); 7,28 (1H, t, J=7,5 Hz, H-12); 4,94 (2H, m, H-4,

H-5); 4,89 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-8); 4,47 (1H, m, H-6); 3,98 (1H, dd, J=2,0; 8,0 Hz,

H-7); 2,81 (1H, dd, J=6,0; 18,5 Hz, H-3a); 2,42 (1H, d, J=18,5 Hz, H-3b).

13C-NMR (125 MHz, CD3OD): δ (ppm) 178,1 (C-2); 143,6 (C-9); 129,2 (C-

11, C-13); 128,7 (C-12); 128,0 (C-10, C-14); 89,5 (C-5); 85,2 (C-7); 78,4 (C-4);

74,7 (C-6); 72,3 (C-8); 36,3 (C-3).

Cardiobutanolide (GM4):

24 o

Chất bột rắn màu trắng; đnc. 188-190 oC; Rf = 0,41 (CH2Cl2-MeOH 90/10, v/v); []D +1,3 (c 0,15; MeOH).

FT-IR (KBr) νmax (cm1): 3476, 2937, 2852, 1743, 1629, 1581, 1400, 1206,

1113, 985, 645, 608, 500, 452.

max

UV MeOH nm (log ): 208 (3,43); 260 (2,06).

(+)-ESI-MS: m/z 291 [M+Na]+.

1H-NMR (500 MHz, CD3OD): δ (ppm) 7,46 (1H, d, J=7,5 Hz, H-10, H-14);

7,35 (2H, t, J=7,5 Hz, H-11, H-13); 7,27 (1H, td, J=1,5; 7,5 Hz, H-12); 4,78 (1H, d,

J=8,0 Hz, H-8); 4,59 (1H, dd, J=3,5; 8,0 Hz, H-5); 4,53 (1H, td, J=0,5; 4,5 Hz, H-

4); 4,41 (1H, dd, J=1,5; 8,0 Hz, H-6); 3,90 (1H, dd, J=1,5; 8,0 Hz, H-7); 2,92 (1H,

dd, J=5,0; 17,5 Hz, H-3a), 2,45 (1H, dd, J=0,5; 17,5 Hz, H-3b).

13C-NMR (125 MHz, CD3OD): δ (ppm) 178,6 (C=O); 144,2 (C-9); 129,1 (C-

11, C-13); 128,5 (C-12); 128,4 (C-10, C-14); 88,2 (C-5); 75,4 (C-8); 74,4 (C-7);

70,3 (C-6); 68,8 (C-4); 40,9 (C-3).

Goniothalamin (GM5):