Nghiên Cứu Thành Phần Phần Hóa Học Và Hoạt Tính Sinh Học Của Các Loài Thực

Hình 3.6. Cây Xương khỉ (Clinacanthus

nutans (Burm. f.) Lindau)

Hình 3.7. Cây lèo heo ( Leoheo domatiophorus

Chaowasku, D.T. Ngo & H.T. Le.)

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 136 trang tài liệu này.

Hình 3.8. Bồ công anh (Taraxacum

officinale (L.) Weber ex F.H. Wigg)

Hình 3.9. Cây Kê huyết đằng

(Milletia reticulata Benth.)

Hình 3.10. Thạch tùng

( Lycopodiella cernua (L.) Pic. Serm.)

Hình 3.11. Cây Bình vôi:

(Stephania rotunda Lour.)

Hình 3.12. Cây Bạch hoa xà (Plumbago zeylanica L.)

Hình 3.13. Cây Xà căn ba vì (Ophiorrhiza baviensis Drake)

Hình 3.14. Cây Bá bệnh

(Eurycoma longifolia Jack.)

Hình 3.15. Cây Cà dại hoa trắng

(Solanum torvum Sw.)

Hình 3.16. Cây Cà gai leo

(Solanum procumbens Lour.)

Hình 3.17. Phá lửa (Tacca subflabellata

P.P.Ling & C.T.Ting)

3.2. Nghiên cứu thành phần phần hóa học và hoạt tính sinh học của các loài thực vật làm thuốc tiềm năng

Qua điều tra nghiên cứu, đã ghi nhận được 427 loài thuộc 316 chi, 123 họ thực vật bậc cao có mạch được làm thuốc ở vùng đệm KBT Sao La. Dựa trên tri thức bản địa và tra cứu các tài liệu chuyên ngành, chúng tôi lựa chọn 12 loài cây thuốc có tiềm năng làm đối tượng sàng lọc hoạt tính sinh học, nhằm tìm kiếm các hoạt chất có khả năng phục vụ công tác chữa bệnh.

3.2.1. Sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào ung thư, kháng viêm của những loài dược liệu tiềm năng tại khu vực nghiên cứu

3.2.1.1. Tạo cao chiết tổng các loài

Mẫu 12 loài dược liệu tiềm năng được trình bày ở Bảng 3.9.

Mẫu dược liệu sau khi thu hái được rửa sạch, băm nhỏ rồi đem phơi dưới bóng râm đến khô.

Quy trình tạo cao chiết tổng của các được liệu được thực hiện theo các bước

Bước 1: Mẫu dược liệu khô (10g) được được ngâm chiết với dung môi

methanol 99% (100 mL) với sự hỗ trợ của máy siêu âm (3 lần x 3 giờ).

Bước 2: Dịch ngâm chiết được thu gom sau mỗi lần chiết.

Bước 3: Cất loại hoàn toàn dung môi bằng thiết bị cô quay chân không thu được cao chiết methanol (cao chiết tổng).

Bảng 3.9. Cao chiết tổng của 12 loài dược liệu tiềm năng

Stt

Họ

Chi

Tên khoa học

Tên thường gọi

Kí hiệu mẫu

Bộ phận thu mẫu

Khối lượng cao chiết

(mg)

Acanthaceae.

Clinacanthus

C. nutans

Xương

khỉ

LTA18

Lá

505

Annonaceae

Leoheo

domatiophorus

Lèo

heo

CNĐ321

Thân

và lá

475

Asteraceae

Taraxacum

T. officinale

Bồ

công anh

LTA75

Cả cây

425

Fabaceae

Milletia

M. reticulata

Kê huyết

đằng

LTA37

Dây

570

Lycopodiaceae

Lycopodiella

L. cernua

Thạch

tùng

CNĐ225

Cả

cây

435

Stt

Họ	Chi	Tên khoa học	Tên thường gọi	Kí hiệu mẫu	Bộ phận thu mẫu	Khối lượng cao chiết (mg)
6	Menispermaceae	Stephania	S. rotunda	Bình vôi	LTA59	Rễ và củ	538
7	Plumbaginaceae	Plumbago	P. zeylanica	Bạch hoa xà	LTA11	Cả cây	455
8	Rubiaceae	Ophiorrhiza	O. baviensis	Xà căn Ba vì	CQL147	Cả cây	481
9	Simaroubaceae	Eurycoma	E. longifolia	Bá bệnh	CNĐ165	Thân và rễ	524
10	Solanaceae	Solanum	S. torvum	Cà dại hoa trắng	LTA83	Phần trên mặt đất	540
11	Solanaceae	Solanum	S. procumben	Cà gai leo	LTA34	Thân và lá	475
12	Taccaceae	Tacca	T.subflabellata	Râu hùm việt	LTA62	Cả cây	536

3.2.1.2. Sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào ung thư

Cao chiết tổng của 12 mẫu dược liệu được tiến hành sàng lọc tác dụng gây độc trên 5 dòng tế bào ung thư ở người gồm: ung thư phổi SK-LU-1 và A549, ung thư cổ tử cung Hela, ung thư vú MCF-7, ung thư biểu mô KB. Kết quả sàng lọc được chỉ ra ở bảng 3.10.

Cao chiết tổng các loài Xương khỉ (LTA18), Bình vôi (LTA59), Xà căn ba vì (CQL147), thể hiện hoạt tính gây độc ở mức trung bình trên cả 5 dòng tế bào ung thư thử nghiệm với giá trị IC50 từ 21,76±2,32 đến 50,25±4,49 μg/mL. cao chiết loài Kê huyết đằng (LTA37) và Râu hùm việt (LTA62) có tác dụng gây độc yếu với giá trị IC50 từ 62,45±6,67 đến 88,76±6,35 μg/mL, các mẫu còn lại không thể hiện hoạt tính gây độc tế bào ung thư (IC50 > 100 μg/mL)

Bảng 3.10. Kết quả sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào ung thư của cao chiết tổng của 12 loài dược liệu tiềm năng

Nồng độ (µg/ml)		Xương khỉ (LTA18)
Nồng độ (µg/ml)	MCF7	Hela	KB	A549	SK-LU-1
100	84,59	88,29	89,64	81,82	82,18
20	29,64	29,56	37,04	22,09	26,82
4	16,05	15,15	18,57	16,51	14,41
0,8	5,62	2,77	5,73	0,12	7,75
IC50	44,02±1,37	41,74±1,01	33,17±1,36	48,22±4,98	50,25±4,49

Nồng độ (µg/ml)	Lèo heo (CNĐ321)
Nồng độ (µg/ml)	MCF7	Hela	KB	A549	SK-LU-1
100	48,27	46,46	23,82	27,78	24,01
20	11,63	19,34	-2,08	4,28	-3,00
4
0,8
IC50	>100	>100	>100	>100	>100
3	Nồng độ (µg/ml)	Bồ công anh(LTA75)
	Nồng độ (µg/ml)	MCF7	Hela	KB	A549	SK-LU-1
	100	29,64	34,85	24,79	30,82	28,77
	20	5,71	3,86	8,00	10,14	4,05
	4
	0,8
	IC50	>100	>100	>100	>100	>100
4	Nồng độ (µg/ml)	Kê huyết đằng(LTA37)
	Nồng độ (µg/ml)	MCF7	Hela	KB	A549	SK-LU-1
	100	60,24	54,13	69,94	63,37	58,09
	20	19,31	18,15	13,52	16,86	18,66
	4	8,63	8,57	2,94	7,08	10,57
	0,8	-0,75	1,08	-2,51	1,99	4,36
	IC50	75,40±1,58	88,76±6,35	70,52±7,24	75,19±4,17	81,49±4,19
5	Nồng độ (µg/ml)	Thạch tùng(CNĐ225)
	Nồng độ (µg/ml)	MCF7	Hela	KB	A549	SK-LU-1
	100	26,37	18,37	24,22	20,76	18,41
	20	6,51	6,22	7,40	9,55	4,45
	4
	0,8
	IC50	>100	>100	>100	>100	>100
6	Nồng độ (µg/ml)	Bình vôi(LTA59)
	Nồng độ (µg/ml)	MCF7	Hela	KB	A549	SK-LU-1
	100	81,48	79,08	95,07	79,78	90,00
	20	42,57	35,10	49,41	41,84	43,54
	4	15,64	17,91	13,31	19,39	15,78
	0,8	7,49	4,40	2,42	10,44	8,49
	IC50	31,56±1,35	38,23±1,67	23,20±2,49	32,06±1,58	28,78±2,13
7	Nồng độ (µg/ml)	Bạch hoa xà(LTA11)
	Nồng độ (µg/ml)	MCF7	Hela	KB	A549	SK-LU-1
	100	47,91	31,37	42,37	44,21	43,00
	20	2,36	6,31	7,62	4,66	15,88
	4
	0,8
	IC50	>100	>100	>100	>100	>100
8	Nồng độ (µg/ml)	Xà căn Ba vì(CQL147)
	Nồng độ (µg/ml)	MCF7	Hela	KB	A549	SK-LU-1
	100	89,48	86,79	93,65	97,22	89,66
	20	46,18	41,93	45,15	50,22	46,49
	4	16,34	14,74	14,21	15,91	12,68
	0,8	5,21	0,10	6,60	3,73	4,79
	IC50	25,68±2,66	29,02±1,64	26,92±1,40	21,76±2,32	26,75±3,42

Nồng độ (µg/ml)	Bá bệnh(CNĐ165)
Nồng độ (µg/ml)	MCF7	Hela	KB	A549	SK-LU-1
100	22,31	25,48	20,94	28,97	24,45
20	11,02	10,41	11,26	9,24	10,33
4
0,8
IC50	>100	>100	>100	>100	>100
10	Nồng độ (µg/ml)	Cà dại hoa trắng(LTA83)
	Nồng độ (µg/ml)	MCF7	Hela	KB	A549	SK-LU-1
	100	48,48	40,10	26,18	39,55	30,07
	20	19,31	5,14	0,82	1,52	14,48
	4
	0,8
	IC50	>100	>100	>100	>100	>100
11	Nồng độ (µg/ml)	Cà gai leo(LTA34)
	Nồng độ (µg/ml)	MCF7	Hela	KB	A549	SK-LU-1
	100	21,48	16,34	12,29	18,42	16,24
	20	6,56	2,79	-1,85	5,14	4,75
	4
	0,8
	IC50	>100	>100	>100	>100	>100
12	Nồng độ (µg/ml)	Râu hùm việt (LTA62)
	Nồng độ (µg/ml)	MCF7	Hela	KB	A549	SK-LU-1
	100	63,72	79,92	80,03	78,38	82,06
	20	10,21	13,52	11,61	10,89	12,63
	4	5,77	7,14	5,89	2,73	3,91
	0,8	-6,02	-3,19	-2,94	-7,18	-5,29
	IC50	78,11±5,56	63,66±7,32	66,24±6,84	73,34±7,96	62,45±6,67
Pos,	Nồng độ (µg/ml)	Ellipticine (Đối chứng dương)
	Nồng độ (µg/ml)	MCF7	Hela	KB	A549	SK-LU-1
	10	95,15	99,14	92,87	95,24	100,21
	2	72,86	76,05	72,08	72,36	81,80
	0,4	51,22	51,67	50,19	49,74	55,31
	0,08	22,08	23,23	24,45	19,36	21,77
	IC50	0,42±0,04	0,41±0,02	0,45±0,03	0,50±0,04	0,36±0,02

Riêng đối với dòng tế bào ung thư cổ tử cung cao chiết tổng của các dược liệu chưa thể hiện hoạt tính ở các nồng độ thử.

3.2.1.3. Sàng lọc hoạt tính kháng viêm

Cao chiết tổng của 12 mẫu dược liệu được tiến hành sàng lọc tác dụng kháng viêm thông qua ức chế sản sinh NO trong tế bào RAW 264.7 được kích thích bởi LPS. Kết quả sàng lọc được chỉ ra ở bảng 3.11 sau đây:

Bảng 3.11. Kết quả sàng lọc hoạt tính kháng viêm của cao chiết tổng của 12 loài dược liệu tiềm năng

Nồng độ (µg/ml)

Xương khỉ (LTA18)		Lèo heo (CNĐ321)		Bồ công anh (LTA75)
% ức chế NO	% tế bào sống	% ức chế NO	% tế bào sống	% ức chế NO	% tế bào sống
100	52,91	80,16	34,82	99,50	47,29	63,58
20	36,71	89,52	-1,84	100,71	23,41	101,55
4	16,55		-2,17		9,73
0,8	3,85				-1,24
IC50	74,93±3,16	-	>100	-	>100	-
Nồng độ (µg/ml)	Kê huyết đằng (LTA37)		Thạch tùng (CNĐ225)		Bình vôi (LTA59)
Nồng độ (µg/ml)	% ức chế NO	% tế bào sống	% ức chế NO	% tế bào sống	% ức chế NO	% tế bào sống
100	88,13	72,33	32,36	97,14	60,08	72,11
20	51,02	94,53	14,91	98,78	37,09	78,98
4	19,56		8,10		6,09
0,8	5,31		1,98		1,77
IC50	21,04±1,34	-	>100	-	57,49±2,39	-
Nồng độ (µg/ml)	Bạch hoa xà (LTA11)		Xà căn ba vì (CQL147)		Bá bệnh (CNĐ165)
Nồng độ (µg/ml)	% ức chế NO	% tế bào sống	% ức chế NO	% tế bào sống	% ức chế NO	% tế bào sống
100	63,62	74,92	65,30	63,24	77,99	76,86
20	34,81	88,96	45,09	85,56	63,39	77,50
4	7,06		7,45		28,50
0,8	0,22		2,71		12,83
IC50	53,86±3,70	-	40,89±2,34	-	12,37±2,21	-
Nồng độ (µg/ml)	Cà dại HT (LTA83)		Cà gai leo (LTA34)		Râu hùm việt(LTA62)
Nồng độ (µg/ml)	% ức chế NO	% tế bào sống	% ức chế NO	% tế bào sống	% ức chế NO	% tế bào sống
100	12,95	101,68	78,28	87,47	52,23	99,58
20	-5,58	102,35	46,45	89,01	4,12	99,75
4	7,37		18,24		3,75
0,8	2,95		10,22		2,62
IC50	>100	-	28,35±2,41	-	98,01±7,64	-
Nồng độ (µg/ml)	Đối chứng dương (L-NMMA)
Nồng độ (µg/ml)	% ức chế NO	% tế bào sống
100	93,56	85,30
20	77,29	98,14
4	30,66
0,8	17,84
IC50	7,10±0,68	-

Kết quả sàng lọc cho thấy 07/12 cao chiết từ các loài dược liệu tiềm năng có tác dụng kháng viêm thông qua ức chế sản sinh NO trong tế bào RAW264.7 được kích thích bởi LPS. Trong đó, Kê huyết đằng (LTA37), Cà gai leo (LTA34) và Bá bệnh (CNĐ165) có tác dụng kháng viêm mạnh với giá trị IC50 lần lượt là 21,04;

28,35 và 12,37 μg/mL. Các loài Bạch hoa xà (LTA11), Râu hùm việt nam (LTA62), Bình vôi (LTA59) và Xương khỉ (LTA18) cũng thể hiện hoạt tính kháng viêm ở mức độ yếu hơn với giá trị IC50 từ 53,86 đến 98,01 μg/mL. Cao chiết của các loài dược liệu còn lại chưa thể hiện hoạt tính ở các nồng độ nghiên cứu.Đối chứng dương L- NMMA hoạt động ổn định trong suốt quá trình thử nghiệm.

Như vậy, từ kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào trên 5 dòng tế bào ung thư (Bảng 3.12.) và khả năng ức chế sản sinh NO (Bảng 3.11) của 12 mẫu cao chiết methanol tương ứng 12 mẫu loài dược liệu đã được lựa chọn, cho thấy:

Xà căn ba vì, Bình vôi là những cây thuốc có hoạt tính gây độc tế bào trên 5 dòng ung thư cao; Bá bệnh, Kê huyết đằng là những cây thuốc có khả năng ức chế sản sinh NO cao trong số 12 loài dược liệu tiềm năng đã đánh giá, chọn lựa. Trong 4 loài cây dược liệu này, ngoài trừ cây bá bệnh, 3 cây thuốc còn lại gồm: Xà căn ba vì, Bình vôi và Kê huyết đằng đều thể hiện cả hoạt tính gây độc tế bào ung thư và khả năng ức chế sản sinh NO, trong đó Xà căn ba vì là cây cho kết quả đánh giá sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào ung thư cao nhất, Bá bệnh là cây cho kết quả đánh giá sàng lọc khả năng ức chế sản sinh NO cao nhất.

Với kết quả sàng lọc như trên, và tình hình điều tra nguyên liệu nghiên cứu thực tế, chúng tôi lựa chọn loài O. baviensis để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.

3.2.2. Nghiên cứu thành phần hóa học của Xà căn ba vì (O. baviensis)

3.2.2.1. Phân lập hợp chất từ loài Xà căn ba vì (O. baviensis Drake)

Phần trên mặt đất loài Xà căn ba vì (O. baviensis Drake) được thu hái vào tháng 3 năm 2018 tại Nam Đông, Thừa Thiên Huế. Mẫu được phơi khô dưới bóng râm, xay nhỏ thu được 3kg bột khô. Bột này được ngâm chiết với methanol (3 lần x 5 lít) bằng thiết bị chiết siêu âm (ở 50oC, mỗi lần 2 giờ). Các dịch chiết được gom lại, lọc qua bông và cất quay loại dung môi dưới áp suất giảm thu được 150 g cặn chiết methanol. Cặn chiết được phân bố đều trong 2 lít nước cất rồi chiết lần lượt với các dung môi n-hexane, dicholoromethane, ethyl acetate. Các dịch chiết trên được loại dung môi dưới áp suất giảm thu được cặn n-hexane (OBH, 60 g), dicholoromethane (OBD, 9 g), ethyl acetate (OBE, 6 g) và cặn nước (OBW, 18g).

Cặn ethyl acetat (OBE 6 g) được tẩm vào silica gel rồi được tiến hành sắc ký cột với hệ dung môi dicholoromethane/methanol (15/1, v/v) thu được bốn phân đoạn, OBE1 – OBE4. Phân đoạn OBE1 được tinh chế trên cột sắc ký RP18 với hệ