- Thời gian chiết mỗi lần: 1 giờ
3.2.2.2. Thẩm định phương pháp định lượng oxostephanin bằng HPLC
* Độ phù hợp hệ thống
Kết quả độ phù hợp hệ thống khi tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn oxostephanin với nồng độ khoảng 25 µg/ml được thể hiện ở Bảng 3.19.
Bảng 3.19. Kết quả độ phù hợp hệ thống
Thời gian lưu (phút) | Diện tích pic (mAU.s) | Số đĩa lý thuyết | Hệ số đối xứng | |
1 | 14,11 | 1214153 | 4235 | 1,442 |
2 | 14,15 | 1219037 | 4247 | 1,444 |
3 | 14,33 | 1215144 | 4246 | 1,442 |
4 | 14,32 | 1227682 | 4253 | 1,446 |
5 | 14,31 | 1240081 | 4252 | 1,448 |
6 | 14,30 | 1227474 | 4246 | 1,450 |
Trung bình | 14,25 | 1223929 | 4247 | 1,445 |
RSD (%) | 0,68 | 0,80 | 0,2 | 0,2 |
Có thể bạn quan tâm!
-
Số Liệu Phổ Nmr (Δ Ppm) Của Sd3 Và Hợp Chất Tham Khảo -
Số Liệu Phổ Nmr (Δ Ppm) Của Sd8 Và Hợp Chất Tham Khảo -
Tỷ Lệ (%) Diện Tích Pic Của Oxostephanin Khi Chạy Hplc Bằng Các Pha Động Khác Nhau -
Hình Thái Các Dòng Tế Bào Thử Nghiệm Dưới Tác Dụng Của Sd1, Sd2, Sd3, Sd4 Và Sd5 Tại Thời Điểm 48H (Vk 10X, Zoom 5,6) -
Kích Thước Trung Bình Của Vùng Nhân Tế Bào Sau Khi Ủ Với Oxostephanin Và Vx-680 Trong 48 Giờ (*p < 0.05 So Sánh Với Đối Chứng) -
Đường Cong Ức Chế Tăng Trưởng Đáp Ứng Liều Đối Với Oxostephanin Của Ba Loại Tế Bào
Xem toàn bộ 368 trang tài liệu này.
RSD thời gian lưu và diện tích pic của oxostephanin thấp hơn 2,0%. Số đĩa lý thuyết trung bình của oxostephanin khoảng 4247 (> 3000). Điều kiện sắc ký lựa chọn có độ lặp lại tốt về thời gian lưu, diện tích pic, số đĩa lý thuyết và hệ thống HPLC sử dụng phù hợp và đảm bảo để phân tích định lượng oxostephanin, do đó phương pháp đạt về độ phù hợp hệ thống theo AOAC và “Hướng dẫn của ASEAN về thẩm định quy trình phân tích” [107].
* Độ đặc hiệu
Chuẩn bị độc lập các mẫu dung môi, các mẫu chuẩn, mẫu thử và các mẫu thử thêm chuẩn (như trình bày ở mục 2.2.2.2). Tiến hành sắc ký trong điều kiện đã chọn. Kết quả được trình bày ở hình 3.17.
Oxostephanin được tách hoàn toàn khỏi chất khác trên sắc ký đồ dung dịch chuẩn và dung dịch thử từ thân lá củ dòm. Thời gian lưu của pic oxostephanin trên sắc ký đồ mẫu thử tương tự như thời gian lưu của pic chuẩn tương ứng trên sắc ký đồ dung dịch chuẩn. Trên sắc ký đồ dung dịch thử, pic của oxostephanin
được tách hoàn toàn khỏi các pic khác. Như vậy, phương pháp đủ đặc hiệu để định lượng oxostephanin trong thân lá cây củ dòm
Hình 3.17. Sắc ký đồ thẩm định độ đặc hiệu
Chú thích:
Data 1: SKĐ mẫu trắng Data 3: SKĐ dung dịch thử
Data 2: SKĐ oxostephanin chuẩn Data 4: SKĐ dung dịch thử thêm chuẩn
* Khoảng tuyến tính và đường chuẩn
Tiến hành sắc ký dãy dung dịch chuẩn (chuẩn bị như trình bày ở mục 2.2.2.2) theo điều kiện sắc ký đã chọn. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.20 và hình 3.18.
Bảng 3.20. Kết quả khảo sát độ tuyến tính
Nồng độ (µg/ml) | S (mAu.s) | Độ chệch (%) | |
1 | 3,125 | 272443 | 11,54 |
2 | 6,25 | 418469 | 6,18 |
3 | 12,5 | 696245 | 0,24 |
4 | 25 | 1214153 | -6,12 |
5 | 50 | 2506725 | 0,58 |
6 | 100 | 4900220 | 0,20 |
y = 48390x + 65108 R2 = 0,9993 | |||
mAU.s
6000000
Đường chuẩn oxostephanin
5000000
y = 48390x + 65108 R² = 0.9993
4000000
3000000
2000000
1000000
0
0
20
40
60
Nồng độ μg/ml
80
100
120
Hình 3.18. Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ của oxostephanin
Trong khoảng nồng độ khảo sát đã có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của oxostephanin. Đường chuẩn của oxostephanin có hệ số tương quan 0,995 ≤ R ≤ 1, độ chệch (bias) tại các điểm đều không quá ± 15%. Như vậy độ tuyến tính của oxostephanin phù hợp với yêu cầu của “Hướng dẫn của ASEAN về thẩm định quy trình phân tích” và AOAC.
* Độ lặp lại
Chuẩn bị các mẫu thử như mục 2.2.2.2. Tiến hành sắc ký, mỗi ngày 6 mẫu thử độc lập kết quả thẩm định độ lặp lại giữa các ngày phân tích được thể hiện ở Bảng 3.21.
Bảng 3.21. Kết quả độ lặp lại giữa các ngày phân tích
STT | Lượng cân dược liệu (g) | Diện tích pic (mAU.s) | Hàm lượng (%) | Trung bình (%) | RSD (%) | |
1 | 1 | 0,5001 | 1424964 | 0,281 | 0,285 | 1,6 |
2 | 0,5002 | 1444767 | 0,285 | |||
3 | 0,5007 | 1475847 | 0,291 | |||
4 | 0,5001 | 1465971 | 0,289 |
5 | 0,5003 | 1447025 | 0,286 | |||
6 | 0,5001 | 1414563 | 0,279 | |||
2 | 1 | 0,5001 | 1424964 | 0,281 | 0,282 | 1,0 |
2 | 0.5002 | 1444767 | 0,285 | |||
3 | 0,5005 | 1447125 | 0,280 | |||
4 | 0,5001 | 1414563 | 0,280 | |||
5 | 0,4999 | 1414231 | 0,280 | |||
6 | 0,5001 | 1414565 | 0,286 | |||
3 | 1 | 0,5071 | 1424964 | 0,281 | 0,283 | 1,7 |
2 | 0,5022 | 1455390 | 0,287 | |||
3 | 0,5032 | 1409751 | 0,278 | |||
4 | 0,5074 | 1407767 | 0,277 | |||
5 | 0,5018 | 1450319 | 0,286 | |||
6 | 0,5041 | 1460461 | 0,288 | |||
Trung bình 3 ngày | 0,283 | 1,4 | ||||
RSD của oxostephanin trong cùng ngày, khác ngày phân tích đều thỏa mãn yêu cầu: RSD của oxostephanin ≤ 3,7%. Phương pháp đạt yêu cầu về độ chính xác theo yêu cầu của “Hướng dẫn của ASEAN về thẩm định quy trình phân tích” và AOAC.
* Độ đúng
Mẫu thân lá cây củ dòm có nồng độ oxostephanin 28,02µg/ml. Chuẩn bị các mẫu thử thêm chuẩn như mục 2.2.2.2. Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn. Kết quả độ thu hồi của oxostephanin trình bày ở bảng 3.22.
Kết quả thỏa mãn yêu cầu phần trăm tìm lại của oxostephanin từ 95,0 % – 105,0 %. Phương pháp đã xây dựng đạt yêu cầu về độ đúng của “Hướng dẫn của ASEAN về thẩm định quy trình phân tích” và AOAC.
Bảng 3.22. Kết quả độ thu hồi của oxostephanin
Mdược liệu (g) | Nồng độ thực của dược liệu (µg/ml) | Nồng độ chuẩn thêm vào (µg/ml) | Nồng độ mẫu khi thêm chuẩn (µg/ml) | Nồng độ chuẩn tìm lại được (µg/ml) | Độ thu hồi (%) | Trung bình (%) | |
80% | 0,5001 | 28,02 | 22,0 | 49,88 | 21,86 | 99,36 | 99,45 |
0,5002 | 49,92 | 21,90 | 99,55 | ||||
0,5001 | 49,90 | 21,88 | 99,45 | ||||
100% | 0,5001 | 28,02 | 28,0 | 55,46 | 27.44 | 98,00 | 98,29 |
0,5002 | 55,68 | 27,66 | 98,79 | ||||
0,5001 | 55,48 | 27,46 | 98,07 | ||||
120% | 0,5001 | 28,02 | 33,0 | 60,88 | 32,86 | 99,56 | 99,57 |
0,5002 | 60,90 | 32,88 | 99,64 | ||||
0,5001 | 60,86 | 32,84 | 99,52 |
* Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)
Hình 3.19. Sắc ký đồ HPLC của oxostephanin ở nồng độ 0,002441 µg/ml
Mẫu chuẩn với nồng độ oxostephanin được pha loãng dần đến khi trên sắc kí đồ tại thời điểm quan sát thấy tỷ lệ S/N trong khoảng 2 - 11. Từ đó, xác định
giá trị của LOD và LOQ. Mỗi mẫu lặp lại 3 lần và lấy kết quả trung bình. Kết quả cho thấy dung dịch có nồng độ 0,002441 µg/ml cho đáp ứng pic gấp khoảng 3 lần so với độ nhiễu đường nền (hình 3.19). LOQ được tính toán dự kiến gấp 3 lần LOD là 0,007323 µg/ml. Từ thực nghiệm, dung dịch có nồng độ 0,0079 µg/ml cho đáp ứng pic gấp khoảng 10 lần so với độ nhiễu đường nền.
3.2.3. Đánh giá sự thay đổi hàm lượng oxostephanin theo thời gian thu hái
Ứng dụng phương pháp đã thẩm định để định lượng oxostephanin có trong dược liệu được thu hái ở các thời điểm khác nhau tại Bắc Giang và các mẫu được thu hái từ Quản Bạ - Hà Giang, Ba Vì – Hà Nội.
Kết quả định lượng oxostephanin trong dược liệu được thể hiện trong bảng
3.23 và bảng 3.24.
Bảng 3.23. Kết quả định lượng oxostephanin trong mẫu dược liệu thu hái tại Bắc Giang
Địa điểm | Thời gian thu hái | Hàm lượng trung bình (%) | RSD (%) | |
D1 | TP Bắc Giang | 1/2/2020 | 0,353 | 4,1 |
D2 | TP Bắc Giang | 29/2/2020 | 0,611 | 2,0 |
D3 | TP Bắc Giang | 29/3/2020 | 0,337 | 7,4 |
D4 | TP Bắc Giang | 3/5/2020 | 0,430 | 1,4 |
D5 | TP Bắc Giang | 31/5/2020 | 0,597 | 3,9 |
D6 | TP Bắc Giang | 6/9/2020 | 0,873 | 2,3 |
D7 | TP Bắc Giang | 8/10/2020 | 0,819 | 0,5 |
D8 | TP Bắc Giang | 14/11/2020 | 0,501 | 1,4 |
D9 | TP Bắc Giang | 14/12/2020 | 0,525 | 2,9 |
Kết quả sơ bộ có thể thấy rằng các thời điểm thu hái khác nhau có thể dẫn đến sự khác biệt về hàm lượng oxostephanin trong củ dòm. Dược liệu trồng tại TP Bắc Giang thu hái tại thời điểm thích hợp nhất vào khoảng giữa tháng 9 đến giữa tháng 10. Khi đó sẽ thu được hàm lượng oxostephanin cao nhất lần lượt là 0,873 % và 0,819 %.
Trong khi đó, kết quả định lượng mẫu thân lá thu hái ở Hà Giang và Ba Vì cho thấy rằng: (1) oxostephanin tập trung nhiều ở lá và cao gấp khoảng 40 lần so
với thân; (2) hàm lượng oxostephanin thu mẫu ở Ba Vì (0,340 % (lá) và 0,008 % (thân)), cao hơn ở mẫu thu ở Hà Giang (0,320 % (lá) và 0,004 % (thân)) là khoảng 6% đối với lá và cao gấp 2 lần đối với thân vào thời điểm thu hái 3/2019. Nhưng do trữ lượng oxostephanin trong thân thấp nên nhìn chung sự khác biệt này không đáng kể giữa hai vùng thu hái mẫu trên; (3) Đối với mẫu toàn bộ thân lá thu hái vào hai mùa tháng 5 và tháng 10 ở Ba Vì lại không cho sự khác biệt rõ ràng nào về hàm lượng oxostephanin. Nhưng lại khác biệt đáng kể so với thời điểm tương tự thu hái ở Bắc Giang.
Bảng 3.24. Đánh giá hàm lượng oxostephanin trong một số mẫu thân lá củ dòm thu hái tại Quản Bạ - Hà Giang và vườn giống Ba Vì - Hà Nội
Địa điểm | Thời gian thu hái | Hàm lượng trung bình (%) | RSD (%) | |
QB – phần lá | Quản Bạ - Hà Giang | 3/2019 | 0,320 | 1,7 |
QB – phần thân | Quản Bạ - Hà Giang | 3/2019 | 0,004 | 2,5 |
BV – phần lá | Ba Vì – Hà Nội | 3/2019 | 0,340 | 2,2 |
BV – phần thân | Ba Vì – Hà Nội | 3/2019 | 0,008 | 1,9 |
BV1 | Ba Vì – Hà Nội | 5/2020 | 0,556 | 2,3 |
BV2 | Ba Vì – Hà Nội | 10/2020 | 0,553 | 3,4 |
3.3. ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG GÂY ĐỘC TẾ BÀO CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT ĐÃ PHÂN LẬP VÀ BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU CƠ CHẾ KHÁNG UNG THƯ CỦA OXOSTEPHANIN
3.3.1. Đánh giá tác dụng gây độc tế bào của một số hợp chất đã phân lập
3.3.1.1. Ảnh hưởng của các hợp chất SD1, SD2, SD3, SD4, SD5 tới hình thái tế bào
Sự biến đổi hình thái đặc trưng của tế bào là một chỉ tiêu quan trọng để đánh giá độc tính của các chất lên các tế bào ung thư nuôi cấy.
Kết quả đánh giá ảnh hưởng của dung môi 0,5% DMSO đến hình thái tế bào được thể hiện trong các hình 3.20 – 3.24 trong đó (a) Tế bào đối chứng sinh học; (b) Tế bào trong dung môi 0,5% DMSO tại thời điểm 48h (VK 10X, Zoom 5.6))
a
b
Hình 3.20. Hình thái tế bào Hela
a
b
Hình 3.21. Hình thái tế bào HepG2
a
b
Hình 3.22. Hình thái tế bào MCF7
a
b
Hình 3.23. Hình thái tế bào N87