Tỷ Lệ (%) Diện Tích Pic Của Oxostephanin Khi Chạy Hplc Bằng Các Pha Động Khác Nhau

Phân bố cắn M trên với 5 lít nước cất, thêm HCl 10% đến môi trường acid với pH 4-5. Chiết phân bố dịch acid này 3 lần với dung môi ethyl acetat (tỷ lệ 1:1, v/v), tách và loại bỏ phần dịch chiết ethyl acetat. Thu gom phần dịch chiết nước rồi cất loại dung môi ethyl acetat còn tồn dư dưới áp suất giảm 70 kPa, nhiệt độ 50oC, thu được dịch nước trong môi trường acid, ký hiệu là Wa.

Dịch chiết nước Wa tiếp tục được trung hòa về môi trường kiềm tương đương pH 9-10 sử dụng NH4OH. Tiến hành chiết phân bố dịch nước trong môi trường kiềm hóa (ký hiệu là Wk) 3 lần bằng dung môi petroleum ether, tách và loại bỏ phần dịch chiết petroleum ether, tiếp tục thu gom phần chiết dịch nước Wk, sau đó chiết phân bố tiếp phần dịch nước thu được 3 lần với dung môi chloroform, tách và cất loại bỏ phần dịch chiết chloroform. Thu gom phần dịch chiết Wk rồi cất loại dung môi chloroform còn tồn dư sau khi chiết phân bố chloroform. Dịch chiết Wk đã được cất loại hết phần dung môi chloroform còn tồn dư, tiếp tục được chiết phân bố lại 3 lần với dung môi ethyl acetat, tách và loại bỏ dung môi ethyl acetat, thu được cắn ethyl acetat (45,0 g, hiệu suất 0,90% so với khối lượng nguyên liệu thân lá củ dòm khô). Đây là cắn chứa nhóm chất alcaloid đã được làm giàu và ký hiệu là Ek.

Tiến hành chiết phân bố cắn Ek lặp lại 3 lần bằng hỗn hợp dung môi MeOH và n-hexan (tỷ lệ 85:15, 75:25, 65:35 v/v), gom các phân đoạn chiết phân bố trên, cất thu hồi dung môi được một cắn làm giàu oxostephanin (31,0 g, hiệu suất 0,62% so với khối lượng nguyên liệu thân lá củ dòm khô), ký hiệu là EkO. Cuối cùng, tinh chế hợp chất oxostephanin từ phân đoạn được làm giàu EkO bằng cách kết tinh lại nhiều lần sản phẩm thô làm giàu trên trong hỗn hợp MeOH và EtOH (tỷ lệ 1:2 v/v) thu được 4,0 g sản phẩm tinh khiết dưới dạng bột màu vàng cam vô định hình, cô quay chân không trong 2-3h, đóng lọ bảo quản.

Quy trình phân lập oxostephanin được trình bày trong hình 3.13.

Hình 3.13. Quy trình phân lập oxostephanin

3.2.1.2. Sơ bộ đánh giá độ tinh khiết của oxostephanin

Độ tinh khiết của oxostephanin được đánh giá thông qua phần trăm diện tích pic trên sắc ký đồ khi chạy HPLC với một số hệ dung môi khác nhau.

Các điều kiện sắc ký được sử dụng bao gồm:

- Cột sắc ký: Supelco C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm)

- Detector: DAD 254 nm

- Thể tích tiêm: 10 µl

- Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút

- Nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng

- Pha động

+ Pha động A: MeOH : acid formic 0,1% (tỷ lệ 35:65, v/v)

+ Pha động B: ACN: H2O (tỷ lệ 80:20, v/v)

+Pha động C: Kênh A: ACN (0.1% acid formic, v/v), kênh B: H2O (0.1% acid formic, v/v) với gradient nồng độ được thiết lập như bảng 3.13.

Bảng 3.13. Gradient nồng độ pha động C

Thời gian (min)

Kênh A (%)	Kênh B (%)
0	95	5
12	95	5
13	100	0
16	100	0
17	95	5
20	95	5

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 368 trang tài liệu này.

Kết quả được trình bày trong bảng 3.14 và hình 3.14.

Bảng 3.14. Tỷ lệ (%) diện tích pic của oxostephanin khi chạy HPLC bằng các pha động khác nhau

Thời gian lưu (phút)	Tỷ lệ diện tích pic (%)
Pha động A	14,261	98,641
Pha động B	21,740	99,742
Pha động C	8,838	98,556

Như vậy sơ bộ đánh giá độ tinh khiết của oxostephanin đã phân lập theo phần trăm diện tích pic trên sắc ký đồ HPLC là 98,5%. Hợp chất này được sử dụng làm chất so sánh cho các nghiên cứu tiếp theo về thành phần hoá học và tác dụng sinh học.

Hình 3.14. Sắc ký đồ đánh giá độ tinh khiết của oxostephanin A: pha động A (% S pic oxostephanin = 98,641)

B: pha động B (% S pic oxostephanin = 99,742)

C: pha động C (% S pic oxostephanin = 98,556)

3.2.2. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng oxostephanin trong thân lá cây củ dòm

3.2.2.1. Xây dựng phương pháp định lượng

Khảo sát bước sóng phát hiện

Quét phổ hấp thụ tử ngoại của dung dịch chuẩn oxostephanin thu được kết quả như hình 3.15.

Phổ hấp thụ của dung dịch chuẩn oxostephanin có các điểm cực đại là 256 nm, 287 nm, 374 nm và 478 nm. Nhìn vào phổ hấp thụ có thể thấy ngoài bước sóng ở tử ngoại xa thì tại bước sóng 256 nm cho tín hiệu cao nhất. Theo Dược điển Việt Nam V [128] quy định !"#$ ± 2 nm, do đó đề tài lựa chọn giữ nguyên bước sóng phát hiện so với các công bố trước đây [12], [13] là 254 nm.

mAU

14.165/ 1.00

214

256

287

374

478

200 300 400 500 600 700 nm

Hình 3.15. Phổ hấp thụ tử ngoại của oxostephanin

Khảo sát pha động

Kết quả các hình 3.14 cho thấy tuy pha động C (gồm kênh A: ACN (0,1% acid formic v/v), kênh B: H2O (0,1% acid formic, v/v) với gradient nồng độ) cho thời gian lưu của oxostephanin tương đối ngắn hơn so với hai pha động còn lại, giúp giảm thời gian phân tích, song sử dụng gradient nồng độ phức tạp hơn so với chế độ đẳng dòng. Pha động A gồm MeOH : acid formic 0,1% (tỷ lệ 35:65, v/v) cho sắc ký đồ cân đối, thời gian lưu (khoảng 14 phút) hợp lý hơn so với khi chạy pha động B (khoảng 21 phút); đồng thời trong mẫu dung dịch thử pic của oxostephanin đã tách hoàn toàn ra khỏi pic tạp với Rs > 1,5 (hình 3.16).

Do đó luận án lựa chọn pha động A gồm MeOH : acid formic 0,1% (tỷ lệ 35:65, v/v) cho các nghiên cứu tiếp theo.

Từ các khảo sát trên, điều kiện sắc ký lựa chọn là:

- Cột sắc ký: Supelco C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm).

- Detector: DAD 254 nm

- Thể tích tiêm: 10 µl.

- Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút

- Pha động: MeOH : acid formic 0,1% (tỷ lệ 35:65, v/v)

- Nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng

- Thời gian chạy: 25 phút

Hình 3.16. Sắc ký đồ dung dịch thử khi chạy pha động A (MeOH : acid formic 0,1% (tỷ lệ 35:65, v/v))

Khảo sát quá trình xử lý mẫu

* Khảo sát số lần chiết

- Khảo sát hàm lượng oxostephanin sau các lần với dung môi là MeOH và sử dụng sóng siêu âm để hỗ trợ chiết.

- Số lần khảo sát: 1 lần, 2 lần, 3 lần, 4 lần.

- Thời gian chiết mỗi lần: 1 giờ.

- Lượng dược liệu cân chính xác khoảng: 0,50 g

- Lượng dung môi chiết mỗi lần: 50 ml, sau mỗi lần chiết lọc dịch chiết vào bình 50 ml và làm đầy bằng MeOH.

Kết quả khảo sát được trình bày trong bảng 3.15.

Bảng 3.15. Kết quả khảo sát số lần chiết

Lần chiết Diện tích pic (mAU.s) Lần 1 2320696

Lần 2 524905

Lần 3 ND*

Lần 4 ND*

*ND: không xác định được diện tích pic

Để xác định sự có mặt của oxostephanin trong lần chiết thứ 3 và thứ 4, tiến hành cô riêng biệt tạo cắn 2 dịch chiết trên, sau đó cắn thu được hoà tan trở lại trong 500 µl MeOH, lọc và đem định lượng, từ đó tính được lượng oxostephanin trong dịch chiết lần 3 và lần 4 và hàm lượng của nó còn tồn lại trong bã chiết. Kết quả thu được ở bảng 3.16.

Bảng 3.16. Kết quả hàm lượng oxostephanin trong dược liệu thu được qua các lần chiết

Số lần chiết

Hàm lượng (%) tính trên dược liệu	Tổng hàm lượng sau các lần chiết được (%)
Lần 1	0,347 ± 0,013	0,347
Lần 2	0,076 ± 0,003	0,423
Lần 3	0,033 ± 0,001	0,456
Lần 4	0,006 ± 0,002	0,462

Kết quả cho thấy sau 3 lần chiết đã chiết kiệt được oxostephanin trong dược liệu. Luận án lựa chọn số lần chiết là 3 lần cho các nghiên cứu tiếp theo. Từ khảo sát trên cho thấy tổng lượng dung môi dùng để chiết tối thiểu là 100 ml methanol với chính xác khoảng 0,50000 g thân lá củ dòm (tương đương tỷ lệ dung môi/dược liệu (ml/g) là 200:1).

* Khảo sát tỷ lệ dung môi/ dược liệu

- Khảo sát lượng oxostephanin chiết được với các lượng dung môi khác nhau.

- Dung môi chiết là MeOH, số lần chiết 3 lần, mỗi lần 1 giờ.

- Tổng lượng dung môi khảo sát: 25 ml/0,25 g dược liệu; 50 ml/0,25 g dược liệu, 100 ml/0,25 g dược liệu.

Kết quả khảo sát được thể hiện trong bảng 3.17.

Bảng 3.17. Kết quả hàm lượng oxostephanin với lượng dung môi khác nhau

Tổng lượng dung môi

chiết (ml)

Tỷ lệ dung môi/ dược liệu (ml/mg)	Hàm lượng (%)
25	100 : 1	0,362 ± 0,006
50	200 : 1	0,423 ± 0,001
100	400 : 1	0,425 ± 0,002

Hàm lượng oxostephanin khi chiết tỉ lệ dung môi/ dược liệu (ml/g) là 200 : 1 và 400 : 1, hàm lượng oxostephanin chiết được cao hơn đáng kể so với 100 : 1. Điều này chứng tỏ với tỷ lệ 100 : 1 oxostephanin vẫn chưa được chiết kiệt. So sánh tỷ lệ 200 : 1 và 400 : 1 hàm lượng oxostephanin chiết được không nhiều sự khác biệt. Như vậy đề tài lựa chọn tổng lượng dung môi chiết/ dược liệu là 200 : 1 (ml/g) cho các nghiên cứu tiếp theo.

* Khảo sát thời gian chiết

- Khảo sát lượng oxostephanin chiết được theo thời gian, với cùng lượng dung môi và số lần chiết.

- Dung môi chiết: MeOH.

- Số lần chiết: 3 lần, sử dụng sóng siêu âm để hỗ trợ chiết xuất.

- Tỷ lệ tổng lượng dung môi/ dược liệu: 200 : 1

- Thời gian chiết mỗi lần: 20 phút; 40 phút; 60 phút; 80 phút (tổng thời gian chiết: 1 giờ, 2 giờ, 3 giờ, 4 giờ).

- Lượng cân chính xác khoảng 0,25g.

Kết quả khảo sát được thể hiện trong bảng 3.18.

Bảng 3.18. Kết quả khảo sát thời gian chiết

Thời gian chiết mỗi lần

Tổng thời gian chiết	Hàm lượng trung bình (%)
20 phút	1 giờ	0,321 ± 0,005
40 phút	2 giờ	0,370 ± 0,029
60 phút	3 giờ	0,442 ± 0,013
80 phút	4 giờ	0,443 ± 0,021

Qua khảo sát thời gian chiết nhận thấy sau 3 lần chiết với thời gian chiết là 60 phút/ lần đã chiết kiệt được oxostephanin trong dược liệu. Luận án lựa chọn thời gian chiết là 1 giờ/ lần (tổng thời gian chiết 3 giờ) cho các nghiên cứu tiếp theo.

Như vậy điều kiện xử lý mẫu được lựa chọn là:

- Dung môi chiết: MeOH.

- Số lần chiết: 3 lần, sử dụng sóng siêu âm để hỗ trợ chiết xuất.

- Tỷ lệ tổng lượng dung môi/ dược liệu: 200 : 1