TÓM TẮT
Đề tài: “Nghiên cứu tạo, nhân phôi vô tính và rễ bất định cây Ngũ gia bì chân chim (Schefflera octophylla Lour. Harms)” được thực hiện tại Viện Sinh học nhiệt đới –Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam từ tháng 9 năm 2015 đến tháng 9 năm 2019.
Mục tiêu tổng quát của đề tài là tạo được phôi vô tính tái sinh trực tiếp, gián tiếp và nhân được phôi vô tính trên môi trường đặc và trong môi trường lỏng lắc. Tạo được rễ bất định tái sinh trực tiếp và nhân được rễ bất định trong môi trường lỏng lắc. Mục tiêu cụ thể của đề tài là: (1) Xác định được một số yếu tố ảnh hưởng (môi trường khoáng, chất điều hòa sinh trưởng, đường,…) đến tái sinh trực tiếp hoặc/và gián tiếp phôi vô tính và rễ bất định từ mô lá nuôi cấy in vitro; (2) Xác định được một số yếu tố ảnh hưởng (môi trường khoáng, chất điều hòa sinh trưởng, số/khối lượng phôi/rễ, đường,…) đến nhân phôi vô tính và rễ bất định có nguồn gốc từ mô lá nuôi cấy in vitro; (3) Tạo được cây con in vitro hoàn chỉnh từ phôi vô tính; (4) Tạo được rễ bất định từ chồi có nguồn gốc đốt thân/phôi vô tính; (5) Xác định được hình thái giải phẫu của phôi vô tính ở một số giai đoạn phát triển khác nhau, nguồn gốc tế bào
phát sinh phôi vô tính và rễ bất định thông qua kỹ thuật nhuộm hai màu.
Đề tài gồm có các nội dung cơ bản như: (i) Tạo phôi vô tính trực tiếp và gián tiếp từ mô lá; (ii) Nhân phôi vô tính trên môi trường đặc và trong môi trường lỏng lắc; (iii) Tạo cây con hoàn chỉnh từ phôi vô tính; (iv) Tạo rễ bất định trực tiếp từ mô lá, từ chồi có nguồn gốc đốt thân/phôi vô tính; (v) Nhân rễ bất định trong môi trường lỏng lắc; (vi) Khảo sát hình thái giải phẫu phôi vô tính và rễ bất định.
Qua nghiên cứu, kết quả cho thấy môi trường thích hợp cho sự hình thành phôi vô tính trực tiếp từ nuôi cấy in vitro mô lá cây Ngũ gia bì chân chim là SH có bổ sung 5 mg/L NAA, 0,25 mg/L BA; 50 g/L sucrose, 10% (v/v) nước dừa kết hợp với nuôi mô ở điều kiện chiếu sáng 4.000 lux. Môi trường thích hợp cho tạo mô sẹo từ mô lá là môi trường SH có 2 mg/L 2,4-D. Phôi vô tính tái sinh (gián tiếp) từ mô sẹo trên môi trường SH có 2 mg/L NAA, 0,25 mg/L BA, 30 g/L sucrose. Đã nhân in vitro thành công phôi vô tính trên môi trường đặc và trong môi trường lỏng thông qua sự hình thành phôi thứ cấp theo cơ chế bất định. Nhân phôi trong môi trường lỏng hiệu quả hơn so với môi trường đặc. Môi trường lỏng thích hợp dùng nhân nhanh phôi vô
tính là môi trường SH có bổ sung 2 mg/L NAA, 0,25 mg/L BA, 50 g/L sucrose, 10% (v/v) nước dừa; khối lượng phôi nuôi cấy ban đầu thích hợp là 2% (w/v), kích thước phôi thích hợp dùng nuôi cấy ~ 10 mm, điều kiện chiếu sáng ~ 4.000 lux. Phôi vô tính phát triển thành cây con có khả năng sinh trưởng bình thường trong điều kiện in vitro và ex vitro.
Có thể bạn quan tâm!
-
Nghiên cứu tạo, nhân phôi vô tính và rễ bất định cây ngũ gia bì chân chim Schefflera octophylla Lour. Harms - 1 -
Nghiên cứu tạo, nhân phôi vô tính và rễ bất định cây ngũ gia bì chân chim Schefflera octophylla Lour. Harms - 2 -
Giới Thiệu Về Ngũ Gia Bì Chân Chim (Schefflera Octophylla Lour. Harms) -
Didymopanax Morototoni (Aublet) Decaisne Et Planchon. -
Một Số Nghiên Cứu Về Sự Phát Sinh Phôi Vô Tính
Xem toàn bộ 180 trang tài liệu này.
Môi trường thích hợp cho tạo rễ bất định trực tiếp từ mô lá là môi trường đặc
½MS có 3 mg/L NAA, 30 g/L sucrose; cường độ ánh sáng ~ 4.000 lux. Đã nhân thành công sinh khối rễ bất định thông qua sự hình thành rễ thứ cấp bằng phương pháp nuôi lỏng lắc dùng môi trường ½MS có bổ sung 2 mg/L NAA, 30 g/L sucrose. Khối lượng rễ nuôi cấy ban đầu thích hợp là 2% (w/v), sinh khối rễ phát triển rất nhanh ở giai đoạn 21–35 ngày, đạt mức cao nhất ở giai đoạn 42 ngày sau cấy.
Cũng đã tạo được rễ bất định cho chồi có nguồn gốc đốt thân (cây vườn ươm, cây in vitro) và phôi vô tính (đã cắt bỏ rễ trụ), ghi nhận được hình thái giải phẫu phôi vô tính và rễ bất định bằng phương pháp nhuộm hai màu.
SUMMARY
The study “In vitro induction and multiplication of somatic embryos and adventitious roots of Schefflera octophylla Lour. Harms” was carried out at the Institute of Tropical Biology (ITB) – Vietnam Academy of Science and Technology (VAST) from September of 2015 to September of 2019.
The general objective of this study was to generate directly/indirectly somatic embryos and multiply somatic embryos on solid and shaking liquid media, to generate directly adventitious roots and mutiply adventitious roots in shaking liquid medium. The specific objectives of the study were to identify: (1) The optimal culture conditions for inducing direct and indirect formation of somatic embryos and adventitious roots from leaf explants cultured in vitro; (2) The optimal culture conditions for multiplication of somatic embryos and adventitious roots originated from leaf explants on solid and/or shaking liquid media; (3) The condition for generation of in vitro plantlets from somatic embryos; (4) The condition for induction of adventitious roots from shoots originated from nodal explants/somatic embryos (5) The morphological and histological properties of somatic embryos at many different stages of development, cellular origin of somatic embryo and adventitious root
formation through double staining with carmine alum and iodine green.
The study comprised of four contents: (i) To generate directly/indirectly somatic embryos from leaf explants; (ii) To multiply somatic embryos on the solid and liquid media; (iii) To generate the plantlets originated from somatic embryos; (iv) To generate directly adventitious roots from leaf explants, from shoots originated from nodal explants/somatic embryos; (v) To multiply adventitious roots in liquid medium; (vi) To examine the morphology and histology of somatic embryo and adventitious root.
The results showed that the suitable medium for the direct induction of somatic embryos from the leaf explants cultured in vitro was SH + 5 mg/L NAA + 0.25 mg/L BA + 10% (v/v) coconut water, 50 g/L sucrose, in light condition ~ 4,000 lux. The suitable media for callus induction from the leaf explants, for regeneration of somatic embryos from callus, were SH + 2 mg/L 2,4-D; SH + 2 mg/L NAA + 0.25 mg/L BA, 30 g/L sucrose, respectively. Successfully in vitro multiplied somatic embryos on
solid and shaking liquid media through secondary embryogenesis by an adventitious mechanism. Somatic embryo multiplication in liquid medium was more efficient than on solid media. The suitable liquid medium for multiplication of somatic embryos was SH + 2 mg/L + 0.25 mg/L BA + 10% (v/v) coconut water, 50 g/L sucrose; the suitable somatic embryo inoculum density/size for culture was 2% (w/v), the suitable size of somatic embryos for multiplication in liquid medium was ~ 10 mm, light condition was 4,000 lux. The somatic embryos developed into plantlets with normal growth under in vitro/ex vitro conditions.
The suitable medium for direct adventitious roots from leaf explants was ½MS
+ 3 mg/L NAA, 30 g/L sucrose, light condition was ~ 4,000 lux. Through secondary rhizogenesis by an adventitious mechanism, successfully in vitro multiplied adventitious roots in liquid medium ½MS + 2 mg/L NAA, 30 g/L sucrose; suitable root inoculum density for culture was 2% (w/v), root biomass developed quickly at the period of 21-35 days, reaching the highest level at 42 days after culturing.
The adventitious roots from shoots originated from nodal explants (greenhouse and in vitro plants) and somatic embryos (with the tap roots removed), the morphology and anatomy of somatic embryos and adventitious roots via double staining method were also achieved.
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Ngũ gia bì chân chim (Schefflera octophylla Lour. Harms), là loài cây thuộc họ Ngũ gia bì/Nhân sâm (Araliaceae) – họ các loài thực vật có nguồn hoạt chất sinh học quan trọng, trong đó có Ngũ gia bì chân chim (NGBCC) [1]. Trong Đông y và y học hiện đại, có khá nhiều công trình công bố kết quả nghiên cứu về các hợp chất thứ cấp ở NGBCC với nhiều tác dụng như tăng cường sức khỏe [2], kháng virus [3][4][5] kháng một số dòng tế bào ung thư [6], làm giảm đau [7] kháng viêm [8], đông máu [9],... Ở Việt Nam, các vật liệu như lá, vỏ của thân/rễ và rễ nhỏ Ngũ gia bì chân chim đều được dùng để làm thuốc [10].
Đến nay, một số công trình có liên quan đến NGBCC đã được ghi nhận như nhân giống bằng phương pháp giâm cành, và bằng phương pháp nuôi cấy mô [3]. Đặng Thị Thanh Tâm (2012) đã nghiên cứu tạo rễ tơ thông qua biến nạp gen dùng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes và thử nghiệm sản xuất sinh khối loại rễ này bằng hệ thống bioreactor [11].
Trong những năm gần đây, nghiên cứu ở lĩnh vực sinh học nói chung, sinh lý học thực vật nói riêng đã đạt được nhiều thành tựu đáng kể, trong đó phương pháp nuôi cấy mô tế bào luôn được các nhà nghiên cứu quan tâm sử dụng như một công cụ nhằm tìm hiểu sâu các khía cạnh sinh lý của tính toàn thế của tế bào như vai trò sinh lý của chất điều hòa sinh trưởng (ĐHST) ngoại sinh, nội sinh và tương tác của chúng, vai trò của các hệ thống di chuyển và phân bố auxin trong mối quan hệ với hệ thống gene điều hòa, tuổi sinh lý của mẫu nuôi cấy,.. đối với sự hình thành, phát triển hai con đường phát sinh hình thái phôi vô tính/rễ bất định thông qua hai kiểu tái sinh trực tiếp/gián tiếp của hai dạng hình thái phát sinh nói trên [12][13][14][15].
Theo nhiều tài liệu, hệ thống phôi vô tính không chỉ là mục tiêu đối với nghiên cứu về phát sinh hình thái mà còn là vật liệu được sử dụng trong nhiều nghiên cứu nhằm các mục đích khác nhau như nhân giống [16], thu hợp chất thứ cấp [17], bảo quản nguồn gen in vitro [18], tạo hạt nhân tạo [19], biến nạp gen [20], nuôi cấy quang tự dưỡng [21], chuyển giao công nghệ và thương mại hóa sản phẩm phôi vô tính [22]. Tương tự phôi vô tính, rễ bất định cũng là mục tiêu trong các nghiên cứu về phát sinh hình thái; ngoài ra, nuôi cấy rễ bất định cũng là một trong các hướng nghiên cứu rất
quan trọng nhằm thu nhận các hợp chất thứ cấp. Hệ thống nuôi cấy này khắc phục được các nhược điểm của hệ thống nuôi cấy tế bào trong một số trường hợp, do các ưu điểm sau: một là, rễ là một tập hợp có hệ thống các tế bào biệt hóa và như vậy đã mang một nhiệm vụ nhất định đối với hoạt động sống của cây, do vậy cũng liên kết với năng lực sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp; hai là, đối với một số cây dược liệu, rễ là nơi sinh tổng hợp/tích tụ các hợp chất thứ cấp; ba là, có thể nhân nhanh sinh khối rễ trong môi trường lỏng mà không bị hạn chế vì hiện tượng hóa kính/hóa trong (vitrification) như trường hợp nuôi thể chồi; bốn là, tương tự như ở một số hệ thống nuôi cấy khác, có thể nuôi nhân quy mô lớn rễ trong điều kiện khống chế, không phụ thuộc vào điều kiện môi trường bên ngoài.
Đến nay đã ghi nhận được một số công bố về kết quả nghiên cứu nhân sinh khối rễ, phôi vô tính phục vụ chiết xuất, thu nhận hợp chất thứ cấp với nhiều quy mô khác nhau, ví dụ như ở trường hợp Panax ginseng, Panax vietnamensis, Panax quinquefolius [ 23][24][17]. Tuy nhiên, cho đến nay chưa ghi nhận được công bố nào trên thế giới và trong nước nghiên cứu về nuôi cấy phôi vô tính và rễ bất định cây NGBCC.
Dựa vào các cơ sở khoa học và thực tiễn nêu trên và góp phần phát triển nghiên cứu trên đối tượng NGBCC, luận án được thực hiện với tên đề tài: “Nghiên cứu tạo, nhân phôi vô tính và rễ bất định cây Ngũ gia bì chân chim (Schefflera octophylla Lour. Harms)” phục vụ định hướng dài hạn sử dụng nguồn phôi vô tính, rễ bất định cho các nghiên cứu về nhân giống, thu nhận hợp chất thứ cấp và cho một số nghiên cứu quan trọng khác trong tương lai.
2. Mục tiêu của đề tài
2.1. Mục tiêu tổng quát
Tạo được phôi vô tính tái sinh trực tiếp, gián tiếp và nhân được phôi vô tính trên môi trường đặc và trong môi trường lỏng lắc. Tạo được rễ bất định tái sinh trực tiếp và nhân được rễ bất định trong môi trường lỏng lắc.
2.2. Mục tiêu cụ thể
Xác định được điều kiện môi trường thích hợp cho sự cảm ứng hình thành phôi vô tính trực tiếp và gián tiếp từ mô lá (môi trường khoáng, loại và nồng độ auxin và cytokinin, nồng độ đường, tỷ lệ nước dừa, điều kiện chiếu sáng,…).
3
Xác định được điều kiện thích hợp (chất ĐHST, khối lượng/kích thước phôi, nồng độ đường, tỷ lệ nước dừa) cho sự nhân sinh khối và tăng sinh phôi.
Xác định được điều kiện thích hợp cho sự cảm ứng hình thành và tăng sinh rễ bất định từ mô lá (môi trường khoáng, loại và nồng độ auxin, nồng độ đường, điều kiện chiếu sáng,…).
Tạo được rễ bất định cho chồi có nguồn gốc đốt thân/phôi vô tính.
Xác định được hình thái giải phẫu của phôi vô tính ở một số giai đoạn phát triển khác nhau, nguồn gốc tế bào phát sinh phôi vô tính và rễ bất định thông qua kỹ thuật nhuộm hai màu.
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
3.1. Ý nghĩa khoa học
Cung cấp những dẫn liệu khoa học mới có giá trị nghiên cứu về hai con đường phát sinh hình thái phôi vô tính và rễ bất định, hai kiểu tái sinh trực tiếp/gián tiếp phôi vô tính và rễ bất định; về nhân phôi vô tính và rễ bất định thông qua cơ chế tạo phôi và rễ bất định thứ cấp ở NGBCC - một trong các đối tượng thực vật/cây dược liệu quan trọng thuộc họ Ngũ gia bì. Đồng thời, luận án cũng là tài liệu tham khảo hữu ích phục vụ cho nghiên cứu và giảng dạy về lĩnh vực sinh lý thực vật, nuôi cấy mô, tế bào thực vật.
3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả từ nghiên cứu này là tiền đề quan trọng cho nghiên cứu nhân sinh khối phôi vô tính, rễ bất định trên quy lớn và sản phẩm sinh khối tạo được có thể được sử dụng trong nghiên cứu nhân giống (phôi vô tính), thu hợp chất thứ cấp (rễ bất định) phục vụ lĩnh vực y dược và mỹ phẩm.
4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
4.1. Đối tượng nghiên cứu
Phôi vô tính từ nuôi cấy mảnh lá; rễ bất định từ nuôi cấy mảnh lá/chồi có nguồn gốc đốt thân/phôi vô tính.
4.2. Phạm vi nghiên cứu
Đề tài thực hiện trên cơ sở ứng dụng phương pháp nuôi cấy mô nhằm tạo và nhân phôi vô tính, tạo và nhân rễ bất định dưới ảnh hưởng của một số yếu tố như môi trường khoáng, chất điều hòa sinh trưởng, đường, ánh sáng,…, tạo cây con in vitro
hoàn chỉnh từ phôi vô tính và ứng dụng phương pháp khảo sát hình thái/hình thái giải phẫu mô tế bào nhằm xác định nguồn gốc phát sinh phôi vô tính và rễ bất định.
Do giới hạn về thời gian nên chưa đề cập đến nghiên cứu nhân rễ bất định từ chồi có nguồn gốc đốt thân/phôi vô tính bằng phương pháp nuôi lỏng lắc, nhân phôi vô tính/rễ bất định bằng hệ thống bioreactor cũng như không thu thập số liệu các chỉ tiêu sinh trưởng của cây từ phôi vô tính ở giai đoạn ex vitro.
5. Tính mới của đề tài
Nghiên cứu này đã xác định được môi trường nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sự phát sinh phôi vô tính trực tiếp từ mảnh lá NGBCC, đồng thời cũng xây dựng quy trình tạo phôi gián tiếp thông qua mô sẹo mảnh lá. Nhân in vitro phôi vô tính trên môi trường đặc và trong môi trường lỏng thông qua sự hình thành phôi thứ cấp theo cơ chế bất định. Phôi vô tính phát triển thành cây con có khả năng sinh trưởng bình thường trong điều kiện in vitro và ex vitro. Kết quả này có ý nghĩa rất lớn trong nhân giống loài dược liệu này.
Xác định được môi trường thích hợp cho tạo rễ bất định trực tiếp từ mảnh lá nuôi cấy in vitro. Nhân sinh khối rễ bất định thông qua sự hình thành rễ thứ cấp bằng phương pháp nuôi lỏng lắc. Kết quả này có thể ứng dụng cho hướng nghiên cứu sản xuất thu các hợp chất thứ cấp.