Giới Thiệu Về Ngũ Gia Bì Chân Chim (Schefflera Octophylla Lour. Harms)

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Giới thiệu về Ngũ gia bì chân chim (Schefflera octophylla Lour. Harms)

1.1.1. Nguồn gốc và phân bố

Giới : Plantae Ngành: Magnoliopsida Lớp : Magnoliopsida Bộ : Apiales

Họ : Araliaceae Chi : Schefflera

Loài : Schefflera octophylla

Hình 1.1. Hình thái một số bộ phận của cây NGBCC (Schefflera octophylla)

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 180 trang tài liệu này.

A. Lá; B. Hoa; C. Quả

(Nguồn: A: Wikipedia – Việt Nam; B,C: Wang và cộng sự, 2021[25])

Họ Ngũ gia bì/họ Nhân sâm (Araliaceae) là họ rất đa dạng về thành phần loài, có khoảng 70 chi, 900 loài, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và á nhiệt đới, rất ít đại diện ở vùng ôn đới, phần lớn các chi và loài phân bố ở Đông nam Á, châu Úc, châu Mỹ nhiệt đới. Ở Việt Nam thực vật thuộc họ Ngũ gia bì cũng khá đa dạng về thành phần loài, đặc điểm sinh thái – sinh học, hiện thống kê được 141 loài thuộc 19 chi, phân bố rộng thường mọc rải rác ở vùng rừng núi nhưng mọc tập trung nhiều ở những vùng núi cao có khí hậu ôn hòa, có nhiều loài sống ở những nơi quang đãng, ẩm ướt, ven rừng, ven suối…Thực vật họ Ngũ gia bì còn rất đa dạng và phong phú về các hợp chất thứ cấp, có khả năng tổng hợp và tích lũy các hợp chất triterpenoid saponin, steroidal saponin, ginsenosides, polysaccharid, các flavonoid, tinh dầu, các hợp chất

hữu cơ khác…[1]. Đây chính là nguồn hợp chất sinh học có hoạt tính rất tốt, vì thế rất nhiều loài trong họ này đã được sử dụng làm nguồn dược liệu quý có giá trị cao trong ứng dụng bảo vệ sức khỏe cho con người.

Chi Schefflera là chi lớn nhất trong họ Ngũ gia bì, thành phần loài rất đa dạng với khoảng 450 loài, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới châu Á như Nhật Bản, Trung Quốc, Việt Nam, Lào, Campuchia, Thái Lan, Malaysia, Ấn Độ, Sri Lanka, Philippines, Indonesia, New Zealand, Singapore, Australia và một số đảo ở Thái Bình Dương [10]. Ở Việt Nam cũng đã thống kê được 56 loài (chiếm 39,7% tổng số loài của họ Ngũ gia bì), 4 thứ [1]. Nhiều loài trong chi này đã được sử dụng làm thuốc chữa trị bệnh phong thấp, đau nhức xương khớp ngoài ra còn có tác dụng điều trị bệnh tiêu hóa, ho, cầm máu…như NGBCC (Schefflera octophylla Lour. Harms), Chân chim Bắc bộ (Schefflera tonkinensis R. Vig), Chân chim lá nhỏ (Schefflera pes-avis R. Vig), Ngũ gia bì lá láng (Schefflera nitidifolia Harms), Chân chim Sapa (Schefflera vietnamensis Grush, N. Skvorts/Schefflera chapana Hamrs), ở loài Chân chim núi – Chân chim Petelot (Schefflera petelotii Merr.) còn được sử dụng chữa gãy xương [10].

NGBCC có danh pháp khoa học là Schefflera octophylla (Lour.) Harms [26], tên khoa học khác Schefflera heptaphylla (L.) Frodin, Aralia octophylla Lour, còn có tên gọi khác là Sâm nam, cây Đáng, Lá lằng, Kotan (Lào). Đây là loài thực vật thường xanh, có hoa, có nguồn gốc từ Đông Á là Nhật Bản và miền nam Trung Quốc. Ở Nhật Bản NGBCC mọc hoang từ miền nam Kyushu đến Okinawa, nó là loài thực vật đại diện cho vùng Yanbaru của Okinawa Nhật Bản. Ở Trung Quốc NGBCC phân bố chủ yếu ở Quảng Đông, Quảng Tây, Vân Nam, Phúc Kiến [8]. Ở Việt Nam, NGBCC mọc rải rác ở vùng núi cao phía bắc, phía nam của dãy Trường Sơn, có nơi mọc tập trung có diện tích lớn khoảng 5 - 10 hecta, gặp ở các tỉnh như Lạng Sơn, Cao Bằng, Lào Cai, Vĩnh Phúc, Phú Thọ, Bắc Cạn, Thái Nguyên, Hòa Bình, Hà Tây, Tuyên Quang, Ninh Bình, Quảng Ngãi, Đắc Lắc, Bình Phước, Lâm Đồng [27][10].

1.1.2. Đặc điểm sinh học – sinh thái

NGBCC thuộc loài cây nhỏ hoặc cây to, cao khoảng 2 - 8 m. Lá chét hình chân vịt, mọc so le có 6 - 8 lá chét, cuống lá dài 8 - 30 cm, lá chét nguyên, hình trứng, đầu nhọn hay hơi tù, dài 7 - 17 cm, rộng 3 - 6 cm, cuống lá chét ngắn 1,5 - 2,5 cm, cuống lá chét giữa dài hơn có thể tới 5 cm, mặt trên lá xanh sẫm bóng, mặt dưới lá nhạt hơn.

Cụm hoa mọc thành chùm tán, hoa nhỏ màu trắng thơm, mẫu 5, bao phấn có 2 ngăn, bầu dưới, trên cuống phụ của cụm hoa đôi khi có hoa riêng lẻ. Quả mọng hình cầu, đường kính ~ 5 mm, khi chín có màu tím sẫm đen, cây thường ra hoa vào tháng 2 - 3, ra quả vào tháng 4 - 5 [27][10].

NGBCC thuộc cây gỗ trung sinh, ưa ẩm, ưa sáng nhưng ở giai đoạn còn nhỏ cây chịu bóng, chịu hạn, mọc xen với một số loài cây gỗ, cây bụi ven suối, ven rừng, ẩm ướt…ngoài ra còn gặp ở rừng non phục hồi hoặc vùng nương rẫy. NGBCC sống được ở nhiều loại đất khác nhau, thích hợp nhất ở đất feralit vàng đỏ. Đây là loài cây gỗ phát triển nhanh, nhất là giai đoạn từ 5 - 15 năm tuổi, cây có thể sống đến 45 năm tuổi, chiều cao khoảng 20 m, đường kính thân khoảng 43 cm, NGBCC có khả năng tái sinh bằng hạt và bằng chồi rất tốt, những cây tái sinh từ hạt có bộ rễ phát triển tốt hơn cây tái sinh từ chồi [10].

1.1.3. Thành phần hóa học và công dụng

1.1.3.1. Thành phần hóa học

Đã có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học của NGBCC thông qua chiết xuất, phân tách và phân lập các chất từ các bộ phận lá, thân, rễ. Kết quả thu được nhiều hợp chất tự nhiên có hoạt tính tốt được sử dụng trong y học. Chen và cộng sự (2015) cho rằng thành phần hóa học chính là triterpenoid, đã có hơn 40 loại triterpenoid được chiết xuất từ các bộ phận của loài thực vật này [7], bao gồm oleanane [29][30], ursane [31], lupane [2][29][30].

Lá

Phân lập hoạt chất từ lá NGBCC thu được 2 triterpenoid glycoside mới là 3- epi-betulinic acid 3-O-β-D-glucopyranoside (1); 3α-hydroxylup-20(29)-ene-23,28- dioic acid 28-O-[α-L-rhamnopyranosyl (1→4)-O-β-D-glucopyranosyl (1→6)]-β-D- glucopyranoside (2); khác với lup-20(29)-ene-23,28-dioic acid [2].

Nghiên cứu của Sung và cộng sự (1991) phân lập hoạt chất từ lá khô, thu nhận một glucoside triterpenoid sulfate mới, từ dữ liệu quang phổ và biến đổi hóa học đã xác định là 3-epi-betulinic axid 3-O-sulfate 28-O-[α-L- rhamnopyranosyl (1→4)-O- β-D-glucopyranosyl (1→6)]-β-D-glucopyranoside [28]. Tiếp tục phân lập từ lá, Sung và cộng sự thu nhận được một saponin triterpenoid 3,28-bidesmosidic mới, một trisaccharid mới và oleanonic acid. Dựa trên dữ liệu quang phổ và sự biến đổi hóa học, các thành phần mới được xác định là 3-epi-betulinic acid 3-O-β-D-

glucopyranoside 28-O-[α-L-rhamnopyranosyl (1→4)-O-β-D-glucopyranosyl (1→6)]-β-D-glucopyranoside; α-L-rhamnopyranosyl (1→4)-O-D-glucopyranosyl (1→6)-β-D-glucopyranoside [29]. Phân lập lá, dùng dữ liệu quang phổ và biến đổi hóa học, Sung và cộng sự thu nhận được 28-O-[α-L-rhamnopyranosyl (1→4)-O-β- D-glucopyranosyl (1→6)]-β-D-glucopyranoside của 3α-hydroxylup-20(29)-ene- 23,28-dioic acid (1); 3α,11α-dihydroxylup-20(29)-ene-23,28-dioic acid (2); 3-epi- betulinic acid (3), trong đó hợp chất (2) và (3) được tìm thấy lần đầu tiên trong giới thực vật [29].

Li và cộng sự (2005) đã phân lập từ cuống lá NGBCC thu được ba dẫn xuất caffeoylquinic acid là 3,4-di-O-caffeoylquinic axid (1); 3,5-di-O-caffeoylquinic axid (2); 3-O-caffeoylquinic axid (3). Những hợp chất này có hoạt tính kháng virus - chống lại virus thể hợp bào gây bệnh hô hấp Respiratory Syncytial Virus (RSV), trong đó 3,4-di-O-caffeoylquinic axid, 3,5-di-O-caffeoylquinic acid có hoạt tính chống RSV rất mạnh mẽ. Các hợp chất này phát huy tác dụng chống RSV, thông qua việc ức chế sự dung hợp tế bào-virus trong giai đoạn đầu và ức chế sự dung hợp tế bào-virus ở giai đoạn cuối [4]. Li và cộng sự (2007) chiết xuất từ lá, tiến hành phân đoạn và phân lập đã thu được hai triterpenoid tinh khiết có hoạt tính cao, kháng virus hợp bào hô hấp (RSV) rất mạnh, là 3α-hydroxylup-20(29)-ene-23,28-dioic acid (1); 3-epi- betulinic acid 3-O-sulfate (2), và một saponin không hoạt động là 3α-hydroxylup- 20(29)-ene-23,28-dioic acid 28-O-[α-L-rhamnopyranosyl (1→4)-O-β-D- glucopyranosyl-(1→6)]-β-D-glucopyranoside [5]. Tiếp tục phân tích thành phần hóa học tinh dầu được chiết xuất từ lá, Li và cộng sự (2009) đã thu được 27 hợp chất dễ bay hơi, trong đó có 17 hợp chất thuộc về monoterpene hoặc sesquiterpene. Tinh dầu này có hoạt tính kháng sinh với ba dòng tế bào ung thư: tế bào MCF-7, A375 và Hep G2 [6].

Từ nguyên liệu lá tươi của NGBCC, Liu và cộng sự (2019) đã phân lập và xác định được 03 lupanine triterpenes có tác dụng đông máu hiệu quả, đó là 3α-hydroxy- lup-20(29)-ene-23,28-dioic acid (1); betulinic acid 3-0-sulfate (2); 3α-hydroxylup- 20(29)-ene-23,28-dioic acid 28-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-O-β-D- glucopyranosyl-(1→6)]-β-D-glucopyranoside (3). Trong đó chất betulinic acid 3-0- sulfate thúc đẩy sự đông máu rất đáng kể, tác dụng cầm máu hiệu quả cao [9].

Thân

Một triterpenoid mới và glycoside được phân lập từ vỏ thân của NGBCC là asiatic acid; và các asiaticoside được xác định là 3α-hydroxy-urs-12-ene-23,28-dioic acid; 3α-hydroxy-urs-12-ene-23,28-dioic acid 28-O-[α-L-rhamnopyranosyl (1→4)- O-β-D-glucopyranosyl (1→6)]-β-D-glucopyranoside. Lần đầu tiên asiaticoside được phân lập từ một loài thực vật không phải của Centella Asiatica [31].

Wu Chun và cộng sự (2013) đã phân lập từ vỏ thân, trên cơ sở phân tích quang phổ và phương pháp hóa học đã thu được chín saponin triterpenoid mới gồm bốn saponin triterpenoid loại ursane là heptursosides AD (1-4), saponin triterpenoid loại oleanane là heptoleosides AD (5-8), một saponin triterpenoid loại damarane, heptdamoside A, cùng với hai saponin đã biết là asiaticoside D và scheffoleoside B. Lần đầu tiên sự hiện diện của saponin triterpenoid tetracyclic từ Schefflera, các saponin có vai trò chống viêm [32]. Tiếp tục nghiên cứu các hợp chất chiết xuất từ vỏ thân, Wu Chun và cộng sự (2014) phân lập được năm saponin triterpenoid loại ursane mới (1-5), các hợp chất được phân lập từ cây này đều được đánh giá về các hoạt động ức chế sản xuất oxide nitric do lipopolysaccharide gây ra trong tế bào RAW264.7, và các hợp chất 2 và 5 cho thấy hoạt động chống viêm yếu ở nồng độ không gây độc tế bào của chúng [33].

Trung tâm Sâm Việt Nam đã hợp tác với Đại học Hiroshima Nhật Bản đã chiết xuất từ vỏ thân đã xác định được 12 glycozid triterpenoid trong đó có 3 hợp chất đã biết là asiaticozid, caulozid, 3-α-hydroxylup-ene-23,28-dioic acid 28-α-rhamnosyl (1→4)-β-D-glucopyranozid (1→6)-β-D-glucopyranozid và chín hợp chất mới. Trong 12 hợp chất được xác định từ vỏ thân có 6 cặp có cấu trúc ursen và oleanen tương ứng, các cặp glycozid ursen và oleanen tương ứng được đặt tên là scheffursozid A, B, C, D, E, F và scheffoleozid A, B, C, D, E, F [27].

Rễ

Rễ NGBCC dùng làm thuốc bổ nên còn gọi là Sâm nam [10]. Từ nguồn nguyên liệu là vỏ rễ của NGBCC được thu thập từ Quảng Châu, tỉnh Quảng Đông, Trung Quốc, Chen và cộng sự (2015) đã phân lập, dùng kỹ thuật sắc ký, phân tích dữ liệu quang phổ đã xác định được 6 triterpenoid là taraxerone (1), 3-epi-taraxerol (2), aleuritolic acid (3), 3-oxofriedelan-28-oic acid (4), 3β,19α-dihydroxy-urs-12-ene- 24,28-dioic acid (5), asiatic aicd (6). Trong đó, các hợp chất từ 1-5 lần đầu tiên thu

được từ loài cây này. Những chất hóa học này có vai trò chống viêm, chống ung thư và chống viêm khớp dạng thấp [7].

1.1.3.2. Công dụng

Trung tâm Sâm Việt Nam hợp tác với Viện nghiên cứu cây thuốc Poznan (Ba Lan) cho thấy NGBCC có nhiều tác dụng [32].

Tác dụng trên hệ thần kinh trung ương: NGBCC tác động hai hướng trên hệ thần kinh trung ương liều nhỏ (1/500 của LD50) kích thích nhẹ trên hệ thần kinh trung ương, liều cao (1/20 của LD50) làm ức chế hệ thần kinh trung ương.

Tác dụng trên nội tiết tố sinh dục: Thực hiện trên hai nhóm súc vật có cơ địa bình thường, trưởng thành và nhóm súc vật bị suy nhược sinh dục. Nhóm súc vật có cơ địa bình thường, trưởng thành kết quả cho thấy sự tác động không có biểu hiện rõ rệt. Ở nhóm súc vật bị suy nhược sinh dục đều có sự gia tăng trọng lượng cơ quan sinh dục so với đối chứng, đồng thời sự tác động của oestrogen và androgen đều biểu hiện ở liều thấp. Sự tác động của bộ phận lá mạnh hơn so với tác động của bộ phận thân NGBCC.

Tác dụng kháng viêm, giảm đau: Nghiên cứu tiến hành trên bột chiết từ lá NGBCC có tính kháng viêm rõ ở 2 liều thử 0,1 g/kg và 0,5 g/kg trong đó ở liều 0,1 g/kg tác dụng điển hình hơn. Nghiên cứu về tác dụng giảm đau cho kết quả 50% - 60%.

Những nghiên cứu về dược lý những năm gần đây cho thấy, các chất hóa học được chiết xuất, phân tách, phân lập từ các bộ phận của NGBCC có nhiều hoạt tính sinh học khác nhau như: kháng virus rất mạnh [3][4][5], tác dụng chống các tế bào ung thư [6][7], chống viêm [7][32][33], chống viêm khớp [7], giảm đau [7], ngoài ra NGBCC còn được sử dụng theo cách truyền thống để chữa chảy máu do chấn thương, và tác dụng tăng đông máu có liên quan đến việc điều hòa mạch hoạt chất nội mô và các thông số huyết học [8].

Trong nghiên cứu về dược lý saponin triterpenoid loại damarane cũng như các dẫn xuất của chúng có hoạt tính sinh học chống khối u, chống viêm, kích thích miễn dịch, tăng sinh tế bào thần kinh, chống lão hóa, chống vi khuẩn, chống tiểu đường, chống loãng xương.

Từ lâu trong dân gian ở Trung Quốc, Việt Nam các bộ phận của cây NGBCC (lá, vỏ thân, vỏ rễ, rễ nhỏ) được sử dụng làm thuốc, như rễ dùng làm thuốc bổ, vỏ

thân chữa thấp khớp, viêm họng, cảm sốt, vết thương sưng đau, ngoài ra vỏ còn giúp ăn ngon, ngủ tốt, phục hồi và tăng cường sức khỏe, hạ nhiệt, chống viêm, giảm đau, trị thấp khớp, đau xương, chữa bệnh gan, tác dụng tốt đến hệ thần kinh trung ương, chống suy nhược thần kinh, giúp tăng cường trí nhớ [27][10].

1.2. Tình hình nghiên cứu về phôi vô tính, rễ bất định ở một số loài thuộc các chi quan trọng ở họ Ngũ gia bì (Araliaceae)

1.2.1. Chi Panax

1.2.1.1. Phôi vô tính

Qua sử dụng phôi hợp tử non Panax ginseng, Arya và cộng sự (1993) đã nghiên cứu sự hình thành phôi vô tính và mô sẹo có khả năng sinh phôi. Các phôi sơ cấp đã tạo phôi thứ cấp cấp 1, cấp 2 và sự sinh trưởng của chúng phụ thuộc vào chất điều hòa sinh trưởng (ĐHST). Một số loại auxin được sử dụng như 2,4-D, NAA và IAA 1 mg/L rất thích hợp cho tạo phôi thứ cấp; ngược lại, kinetin, BA ức chế tạo phôi thứ cấp [34].

Choi và cộng sự (2003) đã sử dụng các mảnh lá mầm phôi hợp tử sâm Panax ginseng tạo phôi vô tính trực tiếp trên môi trường đặc MS không bổ sung chất ĐHST, có 30 g/L đường; ngược lại, môi trường có nồng độ khoáng NH4NO3 cao (60 mM) chỉ cảm ứng tạo mô sẹo có khả năng sinh phôi. Mô sẹo có khả năng sinh phôi được cấy chuyển nhiều lần trên môi trường vẫn có khả năng phát triển tiếp tục dù không bổ sung chất ĐHST. Mô sẹo được nuôi cấy trong bình tam giác (V500 mL) chứa môi trường MS/½MS có 30 g/L đường để nhân lên phục vụ cho nuôi cấy quy mô lớn hơn trong bioreactor (V20 lít); khối lượng tươi mô tăng lên 7,1 lần sau 5 tuần nuôi cấy trong bioreactor chứa môi trường 1/3MS có 30 g/L đường. Hàm lượng ginsenoside tổng số thấp hơn 6 lần so với rễ cây sâm sinh trưởng ở điều kiện tự nhiên [35].

Cũng từ vật liệu mảnh lá mầm phôi hợp tử, Zhou và Brown (2006) đã xây dựng được quy trình tạo cây sâm Bắc Mỹ (Panax quinquefolius) có hiệu quả thông qua nuôi cấy tạo phôi vô tính. Tiền xử lý mảnh lá mầm với 1 M đường ở 4oC đã cải thiện được số lượng phôi hình thành. Việc kết hợp tiền xử lý với nuôi cấy dùng nồng độ đường cao (7%) cũng đã nâng cao được tỷ lệ phát sinh phôi từ 40% lên 75%, số lượng phôi/mẫu cấy từ 10 lên 21. Tỷ lệ hình thành phôi thứ cấp đạt 90% khi mô phôi vô tính sơ cấp được nuôi cấy trên môi trường MS có 1 mg/L 2,4-D và 1 mg/L NAA. Phôi phát triển đến giai đoạn trưởng thành (trong đó có ½ lượng phôi nẩy chồi) trên

môi trường SH có 1% than hoạt tính và 85% phôi phát triển thành cây con (đầy đủ rễ thân và lá) khi được nuôi cấy trên môi trường ½SH có 0,5% than hoạt tính. Cây con có kiểu hình bình thường ở giai đoạn ex vitro [36].

Nghiên cứu của Kim và cộng sự (2012) đã thiết lập hệ thống tái sinh phôi vô tính thứ cấp Panax ginseng trực tiếp từ phôi vô tính sơ cấp, nuôi cấy trên môi trường MS không bổ sung chất ĐHST. Môi trường EM (1/3MS, với ½ lượng NH4NO3 và KNO3, có 20 - 30 g/L sucrose) tạo điều kiện thích hợp cho sự phát triển của phôi thứ cấp đến giai đoạn cây con. Cây con có rễ cọc hoàn chỉnh khi được nuôi cấy trên môi trường ½SH có 0,5% than hoạt tính. Tần suất cao của hệ thống tái sinh này thông qua quá trình phát sinh phôi thứ cấp theo chu kỳ (cyclic manner). Sự tăng sinh liên tục của phôi vô tính thông qua tạo phôi thứ cấp, nên rất hữu ích cho nhân giống.[37].

Kỹ thuật nuôi cấy lát mỏng tế bào (LMTB) đã được sử dụng trong tạo phôi trực tiếp từ một số bộ phận khác nhau của cây sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis) in vitro (3 tháng tuổi) như lá, cuống lá và củ. Mô được nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung NAA và 2,4-D ở các nồng độ 0,1; 0,2; 0,5; 1,0 và 2,0 mg/L. Sau 10 tuần nuôi cấy, kết quả thu được cho thấy nguồn mẫu từ lá là thích hợp nhất cho sự hình thành phôi trực tiếp. Mẫu cấy lá được nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung 2 mg/L NAA cho hiệu quả phát sinh phôi trực tiếp cao nhất (29,49 phôi/mẫu). Kết quả khảo sát hình thái giải phẫu cho thấy phôi phát triển trực tiếp từ các mẫu nuôi cấy [38]. Trong nghiên cứu của Vũ Thị Hiền và cộng sự (2015) đã nghiên cứu sự phát sinh hình thái từ LMTB (TCL) mẫu lá, cuống lá và thân rễ sâm Ngọc Linh in vitro. Mẫu được nuôi cấy trên môi trường đặc MS có bổ sung 30 g/L đường, các chất ĐHST (NAA, 2,4-D, BA và TDZ riêng lẻ hoặc kết hợp). Sau 10 tuần nuôi cấy, kết quả cho thấy mẫu lá tTCL_L, mẫu cuống lá lTCL_C, mẫu thân rễ tTCL_R đều cho sự phát sinh phôi, mô sẹo, rễ, trong khi mẫu cuống lá tTCL_C chỉ cho sự phát sinh mô sẹo và rễ. Trong đó, tỷ lệ phát sinh phôi cao nhất (89,6%), tỷ lệ phát sinh mô sẹo cao nhất (91 - 98,8%), tỷ lệ phát sinh rễ cao nhất (98,8%) đã được ghi nhận tương ứng khi mẫu lá tTCL_L được nuôi cấy trên môi trường bổ sung 2 mg/L NAA và được đặt dưới điều kiện chiếu sáng 16 h/ngày; lá tTCL_L, cuống lá tTCL_C, lTCL_C, thân rễ tTCL_R được nuôi cấy trên môi trường có 2,4-D kết hợp với BA dưới điều kiện chiếu sáng 16 h/ngày, điều kiện tối hoàn toàn; môi trường có bổ sung 1 mg/L NAA và đặt trong điều kiện tối hoàn toàn. Điều kiện chiếu sáng có tác động đáng kể lên khả năng phát sinh hình