So Sánh Kiểu Hình Cây Chuyển Gen Và Cây Đối Chứng.

chứng cấy mô và nhỏ hơn nhiều so với cây đối chứng trồng từ hạt (hình 3.38, bảng 3.15). Các bộ phận của cây chuyển gen phát triển bình thường, lá xanh, gồm 3 lá mỗi nhánh, hình dạng phiến lá bình thường, thân thẳng, hoa màu tím nhạt, hình dạng cánh hoa như cây đối chứng. Thời gian từ khi trồng đến lúc quả chín, thu hạt khoảng 4 tháng, giống với cây đối chứng. Ngoài kiểu hình, đặc điểm khác biệt lớn giữa cây chuyển gen, đối chứng cấy mô so với cây đối chứng trồng từ hạt là khả năng sinh sản cây chuyển gen, đối chứng cấy mô thấp hơn nhiều so với cây đối chứng trồng từ hạt. Cây chuyển gen chỉ có khả năng đậu 1-2 quả, mỗi quả từ 1-2 hạt. Điều này gây hạn chế lớn đến khả năng thu nhận thể chuyển gen ở các thế hệ sau. Tuy cây chuyển gen T0 có kiểu hình nhỏ, năng suất hạt thấp nhưng ở thế hệ T1 trồng từ hạt phát triển bình thường cả về kích thước và năng suất. Hạt chuyển gen có màu đỏ, về kích thước không khác nhiều so với hạt đối chứng. Màu đỏ chỉ biểu hiện chuyên biệt ở hạt, các bộ phận khác như thân, lá, hoa màu sắc không bị thay đổi. Các giai đoạn sinh trưởng, phát triển, ra hoa, đậu trái bình thường như đối chứng. Một số nghiên cứu chuyển gen vào đậu tương cũng ghi nhận từ thế hệ T1, cây chuyển gen không khác biệt về hình thái và năng suất so với cây đối chứng không chuyển gen [122][194]. Sau đây là bảng so sánh một số thông số kiểu hình, năng suất của cây chuyển gen T0, T1 và đối chứng cấy mô, trồng từ hạt.

ảng 3 15. So sánh một số đặc điểm của cây chuyển gen và đối chứng.‌

Cây đậu tương

Chiều cao (cm)	Đường kính thân (mm)	Số nhánh	Số hạt	Đường kính (mm) - trọng lượng trung bình của hạt (g)
ĐC1	11	1,8	5	4	5,5 (0,12)
D2	9	1,6	4	2	5,4 (0,11)
D8	8,5	1,4	4	2	5,6 (0,13)
ĐC2	73	3,5	11	109	6,7 (0,18)
D2-1	76	3,2	10	99	6,5 (0,16)
D8-1	71	3,4	11	104	6,8 (0,18)

Có thể bạn quan tâm!

• Tạo Dòng Agrobacterium Tumefaciens Eha 105 Chứa Plasmid Pitb-Ast Ly Trích, Kiểm Tra Plasmid Pitb-Ast Từ E. Coli‌
• Chuyển Gen Bằng Vi Khuẩn A. Tumefaciens Sử Dụng Dao Mổ Kết Hợp Sóng Siêu Âm, Thấm Chân Không Tạo Vết Thương Mẫu‌
• Dòng Chuyển Gen D2 (A) Và D8 (B) Phát Triển Ngoài Vườn Ươm
• R.p. Mcquinn, B. Wong, J.j. Giovannoni, Atpds Overexpression In Tomato: Exposing Unique Patterns Of Carotenoid Self‐Regulation And An Alternative Strategy For The Enhancement Of Fruit
• Y. Hiei, S. Ohta, T. Komari, T. Kumashiro, Efficient Transformation Of Rice (Oryza Sativa L.) Mediated By Agrobacterium And Sequence Analysis Of The Boundaries Of The T‐Dna, The Plant Journal,
• Kết Quả Ảnh Hưởng Của Iba Đến Khả Năng Tạo Rễ Của Chồi Đậu Tương In Vitro (Tỉ Lệ Mẫu Tạo Rễ Đã Được Chuyển Đổi Sang Dạng Arcsin√X;

Xem toàn bộ 176 trang tài liệu này.

Hình 3.38. So sánh kiểu hình cây chuyển gen và cây đối chứng.

Cây chuyển gen To (a), đối chứng từ hạt (b), chuyển gen T1 (c) sau 6 tuần; cây chuyển gen To (d), đối chứng (e), chuyển gen T1 (f) sau 14 tuần.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ‌

KẾT LUẬN

Nội dung 1: Xây dựng hệ thống tạo cây con hoàn chỉnh in vitro từ đốt là mầm và một nửa hạt

Hạt đậu tương được khử trùng bằng khí clo trong 16 giờ giúp tạo mẫu sạch và giữ khả năng nảy mầm của hạt tốt nhất. BA 2 mg/l là nồng độ tối ưu để cảm ứng tạo chồi từ đốt lá mầm và một nửa hạt của ba giống MTĐ 176; HL 07-15 và OMĐN

29. Ngoài ra, IBA 1 mg/l và 1,5 mg/l lần lượt là nồng độ tối ưu để cảm ứng tạo rễ từ mẫu chồi của hai giống MTĐ 176; HL 07-15 và giống OMĐN 29.

Nội dung 2: Khảo sát các điều kiện thích hợp để ứng dụng trong qui trình chuyển gen tạo astaxanthin vào đậu tương

Nồng độ PPT tối ưu để chọn lọc chồi chuyển gen của giống MTĐ 176, OMĐN 29 và HL 07-15 lần lượt là 6, 5 và 5 mg/l. Ngoài ra, bổ sung PPT từ 1 mg/l trong môi trường nuôi cấy có thể giúp duy trì áp lực chọn lọc cho chồi chuyển gen. Kim châm nhiều mũi được sử dụng để đâm nhẹ 3 lần lên vùng đốt lá mầm sẽ tạo vết thương mẫu phù hợp cho các nghiên cứu chuyển gen.

Mẫu đốt lá mầm được tạo vết thương bằng dao mổ và kết hợp xử lý với sóng siêu âm 30s hoặc thấm hút chân không 60s (-20 in Hg) sẽ giúp tăng đáng kể hiệu quả chuyển gen gus vào đậu tương, từ 1,67% lên 10% (sóng siêu âm) và từ 1,67% lên 8,33% (thấm hút chân không).

Nội dung 3: Chuyển gen tạo astaxanthin vào đậu tương gián tiếp thông qua vi khuẩn A. tumefaciens và kiểm tra, đánh giá các dòng đậu tương chuyển gen.

Phương pháp tạo vết thương vùng đốt lá mầm (giống MTĐ 176) bằng cách sử dụng kim châm đâm nhẹ 3 lần để thay thế dao mổ đã giúp tăng hiệu quả chuyển gen tạo astaxanthin từ 0,33% lên 1%. Ngoài ra, việc kết hợp sử dụng sóng siêu âm 30s hoặc thấm chân không 60s (-20 in Hg) trong quá trình tạo vết thương mẫu đốt lá mầm cũng giúp tăng hiệu quả chuyển gen từ 0,67 % lên 2%.

Nghiên cứu đã tạo được nhiều dòng đậu tương biến đổi gen, trong đó 2 dòng có khả năng tạo hạt và sản xuất astaxanthin chuyên biệt ở hạt. Hàm lượng

astaxanthin trong hạt thế hệ T1 của hai dòng đậu tương chuyển gen lần lượt là 0,31

µg/g (D2) và 0,77 µg/g (D8). Các dòng đậu tương chuyển gen có khả năng di truyền và biểu hiện gen biến nạp qua nhiều thế hệ. Trong các giai đoạn sinh trưởng, phát triển cũng như năng suất hạt cho thấy cây chuyển gen và đối chứng không có nhiều khác biệt.

KIẾN NGHỊ

Nghiên cứu đã cho thấy bằng cách sử dụng các phương pháp tạo vết thương mẫu thích hợp như dùng kim châm đâm nhẹ vùng đốt lá mầm hoặc tạo vết thương có sự kết hợp của sóng siêu âm, thấm hút chân không có thể giúp nâng cao đáng kể hiệu quả chuyển gen vào giống MTĐ 176 nên có thể được áp dụng để tăng hiệu quả chuyển gen vào các giống đậu tương khác.

Phương pháp tạo vết thương bằng kim châm nhiều mũi hoặc tạo vết thương trong qui trình chuyển gen vào đốt lá mầm đã giúp nâng cao đáng kể hiệu quả chuyển gen vào giống đậu tương MTĐ 176 nên có thể được áp dụng

Các hạt đậu tương màu đỏ đậm cần tiếp tục được gieo trồng thêm nhiều thế hệ để nhận được các cây tạo hạt đỏ đậm, không phân ly. Sau đó các cây này cần được đánh giá về khả năng sinh trưởng, phát triển, năng suất tạo hạt, hàm lượng astaxanthin trong hạt nhằm định hướng khả năng ứng dụng tạo sản phẩm chứa astaxanthin nguồn gốc tự nhiên.

Việc tăng cường hơn con đường chuyển hóa hướng đến sự tạo astaxanthin có thể được thực hiện thông qua một số định hướng như chuyển thêm gen mã hóa phytoene desaturase, bất hoạt gen mã hóa enzyme lycopene e-cyclase để hướng tiền chất vào nhánh β,β hoặc bất hoạt gen mã hóa enzyme β-ring carotene hydroxylase. Mặc dù, một số nghiên cứu tạo cây bắp và lúa biến đổi gen sản xuất astaxanthin đã biến nạp thành công cấu trúc gồm 5 gen, tuy nhiên việc đưa thêm các yếu tố mới vào cấu trúc 4 gen hiện tại (bar, Zm-psy, cbfd2, hbfd1) cần được thực hiện lần lượt từng yếu tố nhằm đánh giá ảnh hưởng đến hiệu quả biến nạp gen cũng như sự biểu hiện ổn định của các gen này.

DANH MỤC CÔNG TRÌNH‌

1. Hoàng Văn Dương, Phan Tường Lộc, Lê Tấn Đức, Nguyễn Huỳnh Cẩm Tú, Nguyễn Hữu Hổ, Tăng hiệu quả chuyển gen vào cây đậu nành bằng phương pháp chuyển gen sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens kết hợp sóng siêu âm, thấm chân không, Công Nghệ Sinh Học, 2017, 15 (3A), 185-194.

2. Hoàng Văn Dương, Phan Tường Lộc, Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ, Sử dụng kim châm trên đốt lá mầm trong chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens tạo astaxanthin ở cây đậu nành, Công nghệ sinh học, 2017, 15 (4A), 55-62.

3. Hoàng Văn Dương, Phan Tường Lộc, Lê Tấn Đức, Nguyễn Huỳnh Cẩm Tú, Trần Thị Ngọc Hà, Nguyễn Hữu Hổ, Tạo cây đậu tương chuyển gen có khả năng sản xuất astaxanthin chuyên biệt ở hạt thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, Kỷ yếu Hội Nghị Công Nghệ Sinh Học Toàn Quốc 2020, NXB Đại Học Huế, 2020, 22-28.

TÀI LIỆU THAM KHẢO‌

1. G. Goswami, S. Chaudhuri, D. Dutta, The present perspective of astaxanthin with reference to biosynthesis and pharmacological importance, World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2010, 26 (11), 1925-1939.

2. R.G. Fassett, J.S. Coombes, Astaxanthin: a potential therapeutic agent in cardiovascular disease, Marine drugs, 2011, 9 (3), 447-465.

3. M. Shah, R. Mahfuzur, Y. Liang, J.J. Cheng, M. Daroch, Astaxanthin-producing green microalga Haematococcus pluvialis: from single cell to high value commercial products, Frontiers in plant science, 2016, 7, 531.

4. A. Molino, J. Rimauro, P. Casella, A. Cerbone, V. Larocca, S. Chianese, D. Karatza, S. Mehariya, A. Ferraro, E. Hristoforou, Extraction of astaxanthin from microalga Haematococcus pluvialis in red phase by using generally recognized as safe solvents and accelerated extraction, Journal of biotechnology, 2018, 283, 51-61.

5. J.L. Barredo, C. García-Estrada, K. Kosalkova, C. Barreiro, Biosynthesis of astaxanthin as a main carotenoid in the heterobasidiomycetous yeast Xanthophyllomyces dendrorhous, Journal of Fungi, 2017, 3 (3), 44.

6. F.X. Cunningham, E. Gantt, Elucidation of the pathway to astaxanthin in the flowers of Adonis aestivalis, The Plant Cell, 2011, 23 (8), 3055-3069.

7. J.C. Huang, Y.J. Zhong, J. Liu, G. Sandmann, F. Chen, Metabolic engineering of tomato for high-yield production of astaxanthin, Metabolic engineering, 2013, 17, 59-67.

8. Q. Zhu, D. Zeng, S. Yu, C. Cui, J. Li, H. Li, J. Chen, R. Zhang, X. Zhao, L. Chen, From golden rice to a STARice: bioengineering Astaxanthin biosynthesis in rice endosperm, Molecular plant, 2018, 11 (12), 1440-1448.

9. J. Alcaíno, M. Baeza, V. Cifuentes, Carotenoid distribution in nature, Carotenoids in Nature, 2016, 3-33.

10. G. Britton, Carotenoid research: History and new perspectives for chemistry in biological systems, Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular and Cell Biology of Lipids, 2020, 158699.

11. E. Alós, M.J. Rodrigo, L. Zacarias, Manipulation of carotenoid content in plants to improve human health. Carotenoids in Nature, Springer, 2016, 311-343.

12. D. Gayen, S. Ghosh, S. Paul, S.N. Sarkar, S.K. Datta, K. Datta, Metabolic regulation of carotenoid-enriched golden rice line, Frontiers in plant science, 2016, 7, 1622.

13. X. Zheng, G. Giuliano, S. Al-Babili, Carotenoid biofortification in crop plants: citius, altius, fortius, Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular and Cell Biology of Lipids, 2020, 1865 (11), 158664.

14. S. Fakhri, F. Abbaszadeh, L. Dargahi, M. Jorjani, Astaxanthin: A mechanistic review on its biological activities and health benefits, Pharmacological research, 2018, 136, 1-20.

15. S. Davinelli, M.E. Nielsen, G. Scapagnini, Astaxanthin in skin health, repair, and disease: A comprehensive review, Nutrients, 2018, 10 (4), 522.

16. B. Capelli, S. Talbott, L. Ding, Astaxanthin sources: Suitability for human health and nutrition, Functional Foods in Health and Disease, 2019, 9 (6), 430-445.

17. S.H.A. Raza, S.R.Z. Naqvi, S.A. Abdelnour, N. Schreurs, Z.M. Mohammedsaleh, I. Khan, A.F. Shater, M.E. Abd El-Hack, A.F. Khafaga, G. Quan, Beneficial effects and health benefits of Astaxanthin molecules on animal production: A review, Research in Veterinary Science, 2021, 138, 69- 78.

18. W. Xia, N. Tang, H.K. Varkaneh, T.Y. Low, S.C. Tan, X. Wu, Y. Zhu, The effects of astaxanthin supplementation on obesity, blood pressure, CRP, glycemic biomarkers, and lipid profile: A meta-analysis of randomized controlled trials, Pharmacological research, 2020, 105113.

19. N. Nisar, L. Li, S. Lu, N.C. Khin, B.J. Pogson, Carotenoid metabolism in plants, Molecular plant, 2015, 8 (1), 68-82.

20. T. Sun, H. Yuan, H. Cao, M. Yazdani, Y. Tadmor, L. Li, Carotenoid metabolism in plants: the role of plastids, Molecular plant, 2018, 11 (1), 58- 74.

116

21. R. Baranski, C. Cazzonelli, Carotenoid biosynthesis and regulation in plants. Carotenoids: Nutrition, Analysis and Technology, Wiley-Blackwell Hoboken, 2016, 161-189.

22. F. Cunningham, E. Gantt, Genes and enzymes of carotenoid biosynthesis in plants, Annual review of plant biology, 1998, 49 (1), 557-583.

23. C.A. Howitt, B.J. Pogson, Carotenoid accumulation and function in seeds and non‐green tissues, Plant, cell & environment, 2006, 29 (3), 435-445.

24. A.S. Hermanns, X. Zhou, Q. Xu, Y. Tadmor, L. Li, Carotenoid pigment accumulation in horticultural plants, Horticultural Plant Journal, 2020, 6 (6), 343-360.

25. P.D. Fraser, S. Römer, J.W. Kiano, C.A. Shipton, P.B. Mills, R. Drake, W. Schuch, P.M. Bramley, Elevation of carotenoids in tomato by genetic manipulation, Journal of the Science of Food and Agriculture, 2001, 81 (9), 822-827.

26. P.D. Fraser, P.M. Bramley, The biosynthesis and nutritional uses of carotenoids, Progress in lipid research, 2004, 43 (3), 228-265.

27. C.K. Shewmaker, J.A. Sheehy, M. Daley, S. Colburn, D.Y. Ke, Seed‐specific overexpression of phytoene synthase: increase in carotenoids and other metabolic effects, The Plant Journal, 1999, 20 (4), 401-412.

28. J.A. Paine, C.A. Shipton, S. Chaggar, R.M. Howells, M.J. Kennedy, G. Vernon,

S.Y. Wright, E. Hinchliffe, J.L. Adams, A.L. Silverstone, Improving the nutritional value of Golden Rice through increased pro-vitamin A content, Nature Biotechnology, 2005, 23 (4), 482.

29. G. Diretto, S. Al-Babili, R. Tavazza, V. Papacchioli, P. Beyer, G. Giuliano, Metabolic engineering of potato carotenoid content through tuber-specific overexpression of a bacterial mini-pathway, PLoS One, 2007, 2 (4), e350.

30. M. Aluru, Y. Xu, R. Guo, Z. Wang, S. Li, W. White, K. Wang, S. Rodermel, Generation of transgenic maize with enhanced provitamin A content, Journal of experimental Botany, 2008, 59 (13), 3551-3562.

31. G. Farré, L. Perez-Fons, M. Decourcelle, J. Breitenbach, S. Hem, C. Zhu, T. Capell, P. Christou, P.D. Fraser, G. Sandmann, Metabolic engineering of