Tổng Quan Về Các Mô Hình Thực Nghiệm Đánh Giá Tác Dụng Kháng U

biểu hiện MMP-9 trong các dòng tế bào HCT-116 so với nhóm đối chứng (100%) (p <0,01). Kết quả nói trên chỉ ra rằng notoginsenosid R1 ức chế sự di chuyển và xâm nhập của tế bào ung thư đại trực tràng người HCT-116 bằng cách điều chỉnh sự biểu hiện MMP-9 trong các dòng tế bào này [67]. Nghiên cứu tổng quan của Ming-Ming Tan và cộng sự (2021) cho thấy các ginsenosid chiết xuất từ Tam thất có tác dụng ức chế nhiều dòng tế bào ung thư khác nhau như ung thư gan, ung thư vú, ung thư đại trực tràng, ung thư tử cung, ung thư buồng trứng, ung thư thần kinh đệm [8]. Sáu saponin chính chiết xuất từ Tam thất bao gồm ginsenosid Rb1, Rd, Rg3, Rh2, Rh4 và notoginsenosid R1 được chứng minh làm thay đổi đáng kể các dấu hiệu chết tế bào theo chương trình (apoptotic) bao gồm caspase-3, Bax, p53, p21, ROS và TEER, ngăn ngừa sự hình thành khối u [8].

Tác dụng chống ung thư của rễ Tam thất đã được chứng minh là tăng cường đáng kể sau khi hấp hơi nóng. Sun và cộng sự (2010) báo cáo cao chiết của rễ Tam thất ức chế đáng kể sự tăng sinh của tế bào ung thư đại trực tràng ở người SW-480, trong khi cao chiết Tam thất không hấp ức chế không đáng kể. IC50của dịch chiết rễ Tam thất hấp trong 1, 2, 4 và 6 giờ ở 120°C lần lượt là 259,2, 131,4, 123,7 và 127,1μg/ ml. Phân tích sự di chuyển của tế bào đã chứng minh rằng tỷ lệ cảm ứng tế bào apoptotic của tế bào SW-480 là 56,3% và 64,4% với nồng độ lần lượt 150,0 và 200,0 μg/ml cao chiết Tam thất hấp trong 6 giờ [10]. Nghiên cứu của Toh và cộng sự (2011) cũng cho thấy Tam thất hấp có tác dụng chống tăng sinh tế bào ung thư gan (SNU449, SNU182 và HepG2) nhiều hơn so với dạng chưa hấp [11]. Tác dụng chống ung thư của rễ Tam thất được tăng cường có liên quan mật thiết đến sự biến đổi thành phần hóa học khi hấp. Hấp làm giảm hàm lượng notoginsenosid R1, ginsenosid Rg1, Re, Rb1, Rc, R2, Rb3 và Rd, nhưng làm tăng hàm lượng Rh1, Rg2, 20R-Rg2, Rg3 và Rh2. Đặc biệt hấp có ảnh hưởng đáng kể đến sự biến đổi của Rg3, một hợp

chất chống ung thư, trong rễ Tam thất [10], [11]. Saponin chiết xuất từ Tam thất trồng ở Việt Nam được chứng minh có tác dụng chống ung thư vú gây ra do 7,12- dimethylbenz(a) anthracene ở chuột với bằng chứng là giảm thể tích khối u [68].

1.2.3.2.Tác dụng tăng cường miễn dịch

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra các polysaccharid và saponin chiết xuất từ Tam thất thể hiện tác dụng tăng cường miễn dịch. Sanchinan A, một polysaccharid được phân lập từ rễ của Tam thất có tác dụng kích hoạt hệ thống lưới nội mô [69]. Polysaccharid của Tam thất kích thích sự tăng trưởng của tế bào lympho T in vivo và in vitro. Ngoài ra, nó thúc đẩy sự hình thành kháng thể và sự sản xuất interleukin [70]. Bốn polysaccharid (PF3111, PF3112, PBGA11 và PBGA12) có trọng lượng phân tử 27 đến 760 kDa được cấu trúc bởi các phân tử đường như glucose, galactose, arabinose, mannose và xylose với các tỷ lệ mol khác nhau; ngoại trừ PBGA11, các polysaccharid này đều có tác dụng trong việc sản xuất interferon-γ khi có concanavalin A.Notoginsenosid-D, -G, -H và –K làm tăng nồng độ IgG huyết thanh trong ovalbumin gà gây miễn dịch ở chuột. Saponin từ Tam thất kích thích sự tăng sinh của bạch cầu nội biểu bì khi có concanavalin A và bổ trợ hoạt động miễn dịch của cơ thể [71]. Sun HX và cộng sự (2003) đánh giá tác dụng của saponin chiết xuất từ Tam thất (PNS) trên các đáp ứng miễn dịch đối với chuột được tiêm dưới da ovalbumin (OVA). Kết quả cho thấy nhóm chuột được tiêm OVA và PNS (liều 50,

100, 200 µg/kg thể trọng) có nồng độ kháng thể IgG cao hơn đáng kể (p<0,01) so với

nhóm chuột chỉ nhận được chủng ngừa OVA [72]. Dịch chiết nước từ rễ Tam thất được chứng minh có tác dụng chống lại sự lây nhiễm của virus Cúm A bằng cách tăng cường các phản ứng miễn dịch qua trung gian kháng virus và hoạt động của tế bào giết tự nhiên [73]. Tác dụng tăng cường miễn dịch của Tam thất cũng được xem là một trong những cơ chế tác dụng trong điều trị ung thư. Nghiên cứu của Bosung Kim và cộng sự (2018) cho thấy Panax notoginseng ức chế sự phát triển của khối u thông qua việc kích hoạt đại thực bào thành phân cực M1 [74]. Các Ginsenosid được

chứng minh có tác dụng điều hòa chức năng các tế bào ức chế miễn dịch dòng tủy trong vi môi trường khối u [75].

Tác dụng tăng cường miễn dịch của Tam thất được thể hiện tốt hơn khi được chế biến hấp. Zejun Zhang và cộng sự (2020) đã báo cáo kết quả nghiên cứu cho thấy Tam thất hấp làm giảm tình trạng thiếu máu ở chuột mắc hội chứng thiếu máu thông qua việc điều chỉnh các yếu tố tạo máu và con đường JAK-STAT [76]. Các Ginsenosid Rg3 có tác dụng nổi trội trong việc thúc đẩy miễn dịch tế bào ở chuột mang u gan H22 [77]. Ginsenosid Rk3 và ginsenosid Rh4 có tác dụng rõ rệt chống thiếu máu trên chuột bị thiếu máu do ribavirin [78]. Các Ginsenosid Rg3, Rk3 và Rh4 là các saponin mới được tạo ra trong Tam thất sau quá trình hấp [64], [65].

1.2.3.3. Tác dụng chống oxy hóa và bảo vệ tế bào gan

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 222 trang tài liệu này.

Dịch chiết toàn phần của Tam thất thể hiện hoạt động chelat ion sắt mạnh và các hoạt động quét các gốc tự do chống lại hydro peroxit, các gốc hydroxyl, đồng thời cũng thể hiện hoạt động chống lại anion superoxid và các gốc tự do DPPH [79]. Saponin chiết xuất từ Tam thất được chứng minh có tác dụng tốt dọn dẹp gốc tự do 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl và gốc hydroxyl trong thử nghiệm chống oxy hóa in vitro [80]. Tác dụng chống oxy hóa của Tam thất hấp tốt hơn so với Tam thất chưa hấp [81], [82], [83].

Tác dụng chống oxy hóa của Tam thất có vai trò quan trọng trong dự phòng và điều trị nhiều bệnh lý. Saponin chiết xuất từ rễ Tam thất có tác dụng chống oxy hóa mạnh đối với quá trình lão hóa ở tế bào thần kinh, giúp cải thiện triệu chứng bệnh lý trên mô hình gây bệnh Alzheimer ở chuột [84]. Các saponin trong Tam thất giúp bảo vệ thận khỏi bệnh tiểu đường thông qua kích hoạt các protein chống oxy hóa ở chuột [85]. Trilinolein là một triacylglycerol tự nhiên được phân lập từ Tam thất, có tác dụng chống thiếu máu cục bộ, chống loạn nhịp tim và chống oxy hóa, được sử dụng trong điều trị các bệnh lý tim mạch [86]. Saponin chiết xuất từ Tam thất có tác dụng bảo vệ tế bào nội mô vi mạch não chống lại sự suy giảm chức năng

rào cản do oxy-glucose/tái tưới máu thông qua việc kích hoạt đường dẫn tín hiệu chống oxy hóa PI3K/Akt/Nrf2 [87]. Trên mô hình gây ung thư vú thực nghiệm, saponin chiết xuất từ Tam thất trồng ở Việt Nam làm giảm thể tích khối u kèm theo giảm mức độ peroxy hóa lipid và tăng trọng lượng cơ thể, và tăng hoạt động chống oxy hóa của enzym superoxide dismutase, catalase, glutathione peroxidase trong mô vú chuột [68]. Tác dụng bảo vệ của saponin chiết xuất từ Tam thất trên tổn thương gan cấp tính do etanol có liên quan đến cải thiện sự tích tụ lipid ở gan và giảm stress oxy hóa qua trung gian etanol [88].

Gan là cơ quan chính bị các loại oxy phản ứng (ROS) tấn công [89]. Các tế bào nhu mô là các tế bào nguyên sinh bị tổn thương do stress oxy hóa trong gan. Ti thể, microsome và peroxisome trong tế bào nhu mô có thể tạo ra ROS, điều hòa PPARα, liên quan chủ yếu đến biểu hiện gen oxy hóa axit béo ở gan. Hơn nữa, tế bào Kupffer, tế bào sao gan và tế bào nội mô có khả năng tiếp xúc hoặc nhạy cảm hơn với các phân tử liên quan đến stress oxy hóa. Một loạt các cytokine như TNF-α có thể được tạo ra trong tế bào Kupffer do stress oxy hóa gây ra, có thể làm tăng chứng viêm và quá trình apoptosis. Đối với tế bào gan hình sao, sự tăng sinh và tổng hợp collagen của tế bào hình sao gan được kích hoạt bởi quá trình peroxy hóa lipid gây ra bởi stress oxy hóa [90],[91],[92]. Khi ROS tăng quá mức, cân bằng nội môi sẽ bị rối loạn, dẫn đến stress oxy hóa, đóng vai trò quan trọng trong các bệnh gan và các rối loạn thoái hóa và mạn tính khác [91]. Stress oxy hóa không chỉ gây ra tổn thương gan bằng cách gây ra sự thay đổi không thể phục hồi của lipid, protein và nội dung DNA và quan trọng hơn, điều chỉnh các con đường kiểm soát các chức năng sinh học bình thường [89]. Vì vậy, những chất có tác dụng chống oxy hóa như GSH, vitamin E, silymarin...được sử dụng làm thuốc bảo vệ gan. Tam thất cũng thể hiện tác dụng bảo vệ gan thông qua tác dụng chống oxy hóa. Dịch chiết nước nóng của Tam thất được chứng minh có tác dụng bảo vệ tế bào gan chuột bị gây nhiễm độc gan mạn tính bằng ethanol, thông qua việc ức chế sản xuất các gốc oxy tự do gây ra quá trình peroxy hóa lipid [93]. Các chuột được

điều trị bằng saponin chiết xuất từ Tam thất (100 hoặc 300 mg/kg) một lần mỗi ngày trong 7 ngày liên tục trước khi uống ethanol làm giảm đáng kể tổn thương gan do nhiễm độc ethanol cấp gây ra, thông qua chỉ tiêu làm giảm các enzym AST và ALT trong máu chuột. Đồng thời, saponin chiết xuất từ Tam thất ngăn chặn sự gia tăng sản xuất các loại oxy phản ứng (ROS) và hàm lượng malondialdehyde (MDA), giảm mức TNF-α và IL-6, khôi phục mức glutathione (GSH), tăng cường hoạt động của superoxide dismutase (SOD) trong gan, và loại bỏ cảm ứng cytochrome P450 2E1 (CYP2E1) [88]. Các chiết xuất từ methanol và nước của Tam thất cho thấy có tác dụng bảo vệ tế bào gan rõ rệt trên chuột bị tổn thương gan bằng carbon tetrachloride [94], [95]. Nhiều hoạt chất chiết xuất từ Tam thất như acidic polysaccharid, ginsenosid-Re và ginsenosid Rk3 được chứng minh có tác dụng tốt trong bảo vệ tế bào gan trên các mô hình gây tổn thương gan khác nhau cũng như theo nhiều cơ chế khác nhau nhưng đều có liên quan đến tác dụng chống oxy hóa [95], [96], [97]. Các saponin trong Tam thất còn được chứng minh có tác dụng thúc đẩy quá trình tái tạo gan thông qua việc kích hoạt con đường tăng sinh tế bào PI3K/AKT/mTOR và điều chỉnh con đường sống sót của tế bào AKT/Bat ở chuột [98].

1.2.3.4. Các tác dụng khác

Tam thất có một số tác dụng sinh học khác như: chống huyết khối [99], ngăn ngưng kết tiểu cầu [100], chống viêm [101], hạ đường huyết [102], hạ lipid máu [103], chống béo phì [104]...

Các tác dụng của Tam thất liên quan chặt chẽ với sự biến đổi hoạt chất sau hấp. Tam thất ở dạng thô chưa hấp có tác dụng cầm máu, chống đông máu và chống viêm tốt hơn, trong khi Tam thất hấp thể hiện các tác dụng kháng u, tăng sinh tế bào máu, tăng miễn dịch, chống oxy hóa và bảo vệ tế bào gan tốt hơn [10], [83], [84]. Đối với bệnh nhân bị ung thư, ngoài tác dụng kháng u thì các tác dụng tăng sinh tế bào máu, tăng miễn dịch, chống oxy hóa và bảo vệ tế bào gan đều có

vai trò quan trọng và hỗ trợ điều trị. Vì vậy, Tam thất hấp được xem là một đối tượng tiềm năng giúp hỗ trợ điều trị ung thư cần được nghiên cứu đánh giá.

1.3. TỔNG QUAN VỀ CÁC MÔ HÌNH THỰC NGHIỆM ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG KHÁNG U

Để nghiên cứu tác dụng kháng u trên thực nghiệm của các chế phẩm nghiên cứu, các nghiên cứu thường tiến hành trên mô hình nuôi cấy tế bào in vitro và trên mô hình động vật thực nghiệm in vivo.

1.3.1. Các mô hình nghiên cứu in vitro

In vitro là phương pháp nghiên cứu đối với các vi sinh vật, tế bào, hoặc các phân tử sinh học trong điều kiện trái ngược với bối cảnh sinh học bình thường của chúng, được gọi là "thí nghiệm trong ống nghiệm". Các nghiên cứu in vitro cho phép sàng lọc nhanh các hoạt chất có tác dụng chống ung thư, phân tích chi tiết cụ thể, đơn giản hơn, thuận tiện hơn so với việc thực hiện với toàn bộ cơ thể [105]. Tuy nhiên, các kết quả thu được từ các thí nghiệm trong ống nghiệm có thể không dự đoán đầy đủ hoặc chính xác tác động trên toàn bộ cơ thể.

Trong mô hình in vitro, các chế phẩm được thử bằng cách ủ trực tiếp với các dòng tế bào ung thư có nguồn gốc từ người hay động vật. Các tế bào ung thư này được nuôi cấy ở điều kiện đặc biệt và môi trường thích hợp để tạo dạng đơn lớp (2D) hay dạng khối cầu (3D). Phương pháp nuôi cấy 2D là phương pháp cơ bản nhất nhưng có nhiều hạn chế vì không mô phỏng được điều kiện in vivo của cơ thể. Các tế bào trong mô hình nuôi cấy 3D phát triển trong không gian ba chiều, mô phỏng lại cấu trúc tự nhiên của các mô, cơ quan trong cơ thể do đó việc thử nghiệm phản ánh đầy đủ các mối quan hệ giữa tế bào với tế bào, tế bào với chất nền ngoại bào và tế bào với môi trường dinh dưỡng như trong cơ thể bình thường. Nghiên cứu bước đầu có thể tiến hành sàng lọc trên mô hình 2D, thu được kết quả khả quan bước đầu tạo tiền đề để tiếp tục thử nghiệm trên mô hình 3D. Nghiên cứu sử dụng mô hình 3D để đánh giá sàng lọc, tuyển chọn các chất tự nhiên có khả năng kháng

u [106]. Trong mô hình này, các chỉ số như tỷ lệ tế bào sống/chết, chỉ số IC50, tỷ số tăng/giảm kích thước khối cầu các tế bào ung thư và các ảnh hưởng của chế phẩm lên hình thái tế bào sẽ được đánh giá.

Trong phương pháp đánh giá in vitro, các bước tiến hành như sau:

- Hoạt hóa và nhân nuôi dòng tế bào ung thư: dòng tế bào ung thư thường được lưu trữ ở trạng thái đông lạnh. Khi triển khai thử nghiệm, tế bào được rã đông ở 37oC sau đó đem ly tâm để thu cặn tế bào, hoạt hóa và đưa và nhân nuôi ở các môi trường nuôi cấy phù hợp.

- Đánh giá khả năng gây độc tế bào của mẫu thử nghiệm trên dòng tế bào ung thưnuôi cấy. Các mẫu thử nghiệm được chuẩn bị ở nồng độ gốc, sau đó được pha loãng trong điều kiện vô trùng để có dải nồng độ ở các đĩa pha mẫu. Tại các giếng thử, tế bào ung thư được ủ với mẫu thử ở các nồng độ khác nhau. Giếng không có chất thử nhưng có tế bào ung thư (180 µl) được sử dụng làm đối chứng. Sau một thời gian ủ nhất định, tế bào được cố định, nhuộm và đo quang để đánh giá các chỉ số như tỷ lệ tế bào sống/chết, chỉ số IC50...

Để đánh giá sâu hơn về khả năng kích thích chết tế bào theo chương trình (apoptosis), các kỹ thuật Flow cytometry hoặc nhuộm hóa mô miễn dịch được áp dụng. Apoptosis là một quá trình diễn ra tự nhiên trong cơ thể, bao gồm một chuỗi các bước được kiểm soát để cuối cùng tế bào tự hủy diệt (tự sát) một cách có chủ đích. Cơ thể dùng apoptosis để giám sát và cân bằng tự nhiên quá trình phân chia tế bào (nguyên phân) hoặc tiếp tục phát triển và tái tạo tế bào. Quá trình apoptosis được đặc trưng bởi các đặc điểm hình thái nhất định, bao gồm: những thay đổi trong màng sinh như mất đối xứng màng và mất sự gắn kết màng, sự cô đặc của tế bào chất và nhân và sự phân cắt DNA. Trong giai đoạn cuối, các phân mảnh tế bào, được loại bỏ nhanh chóng bởi tế bào thực bào mà không tạo ra đáng kể tổn thương viêm cho các tế bào xung quanh. Suy giảm apoptosis làm tăng tỷ lệ sống sót của tế bào, dẫn đến ung thư phát triển. Do đó mục tiêu apoptosis là một tiêu chuẩn mới

Hoạt hoá Caspases

Tế bào còn hoạt động sống (Live Cells)

Thay đổi màng Plasma

Chết tế bào theo chương trình

(Apoptosis)

Thay đổi ty thể

Tế bào dừng hoạt động sống (Fixed Cells)

Hoạt hoá Caspases

Phân mảnh ADN

trong phát triển thuốc điều trị ung thư. Các thuốc thử và công nghệ phát hiện apoptosis, đo lường các chỉ số về apoptosis tại các giai đoạn khác nhau đã được phát triển dựa trên các đặc điểm đặc biệt của quá trình apoptosis, gồm: thay đổi màng Plasma, thay đổi ty thể, hoạt hoá Caspases, sự phân mảnh AND [107].

Hình 1.3. Các đặc điểm phân tích chết tế bào theo chương trình (Apoptosis) Thay đổi màng Plasma

Những thay đổi trong màng sinh chất là một trong những đặc điểm sớm nhất của quá trình apoptosis. Trong tế bào apoptotic, màng phospholipid, phosphatidylserine (PS), được chuyển vị trí từ trong ra ngoài của màng sinh chất, do đó bộc lộ PS với môi trường tế bào bên ngoài. Annexin V là một protein liên kết phospholipid phụ thuộc Ca2+, có ái lực cao với PS và liên kết với các tế bào có PS bộc lộ ra ngoài. Annexin V có thể được liên hợp với các fluorochromes như FITC và PE, hoặc với biotin hoặc được gắn với EGFP (protein huỳnh quang xanh tăng cường). Việc liên hợp này vừa giữ lại ái lực cao của chúng với PS, vừa cung cấp tín hiệu để phân tích các tế bào đang trải qua quá trình apoptosis. Sự hình thành bên ngoài PS xảy ra trong giai đoạn sớm hơn của quá trình apoptosis, phương pháp nhuộm Annexin V có thể xác định được quá trình apoptosis ở giai đoạn sớm hơn so với các thử nghiệm dựa trên những thay đổi ở nhân như phân mảnh DNA. Do đó, nhuộm Annexin V kết hợp với thuốc nhuộm propidium iodide (PI) hoặc 7-amino-actinomycin D (7-AAD)