Về Tác Dụng Ức Chế Sự Phát Triển U Rắn Sarcoma Tg180 (In Vivo)

dài hơn cho phép sử dụng thuốc dài hơn, điều kiện chăm sóc đơn giản hơn, chi phí nghiên cứu rẻ hơn nhiều so với mô hình gây khối u trên chuột suy giảm miễn dịch. Các đặc điểm trên cho thấy sự phù hợp của mô hình để nghiên cứu tác dụng chống ung thư của dược liệu.

Mô hình chuột nhắt trắng mang khối u rắn sarcoma TG 180 đã được sử dụng trong nhiều công trình nghiên cứu sàng lọc và ứng dụng tìm kiếm các thuốc chống ung thư từ dược liệu ở Việt Nam cũng như trên thế giới [54], [162], [163]. Đặc biệt trên mô hình này, chúng tôi đã tiến hành đánh giá đồng bộ từ tác dụng ức chế sự phát triển của khối u, tác dụng tăng cường miễn dịch, tác dụng chống oxy hóa trên chuột mang u, và tác dụng làm kéo dài thời gian sống thêm của chuột. Tác dụng làm kéo dài thời gian sống thêm của chuột được coi là kết quả tổng hợp có được từ các tác dụng ức chế sự phát triển của khối u, tăng cường miễn dịch, chống oxy hóa...của mẫu thử trên chuột mang khối u. Với định hướng đánh giá đồng bộ các tác dụng liên quan đến hiệu quả điều trị ung thư (ức chế sự phát triển của khối u, tăng cường miễn dịch, chống oxy hóa, kéo dài thời gian sống thêm của chuột) trên chuột mang u, thuốc tham chiếu được lựa chọn cần là thuốc đã được phê duyệt và chứng nhận về mặt khoa học có những đặc điểm tác dụng sát với các nội dung đánh giá. Vì vậy, trong nội dung nghiên cứu tác dụng kháng u trên động vật thực nghiệm, chúng tôi lựa chọn thuốc tham chiếu là Lentinan. Lentinan là một beta-1,3 beta-glucan với phân nhánh β-1,6, được phân lập từ nấm L. edodes. Các nghiên cứu trên động vật thực nghiệm cho thấy Lentinan ức chế khối u tăng trưởng bằng cách điều chỉnh hệ thống miễn dịch thông qua việc kích hoạt các tế bào miễn dịch, thúc đẩy sự gia tăng tế bào lympho T và B và tăng cường các hoạt động của tế bào NK, kích thích sản xuất các cytokine khác nhau. Lentinan đã được sử dụng lâm sàng để điều trị ung thư các bệnh ung thư khác nhau, bao gồm cả ung thư phổi, ung thư dạ dày, ung thư đại trực tràng và các bệnh ung thư khác, và đã được phê duyệt như

một chất hỗ trợ điều trị ung thư dạ dày ở Nhật Bản vào năm 1985 [47], [48].

137

Lentinan cũng được chứng minh có tác dụng chống oxy hóa, được xem là một trong những cơ chế góp phần quan trọng trong điều trị ung thư [164], [165].

Trong nghiên cứu đánh giá tác dụng kéo dài thời gian sống thêm của chuột, chuột được cho uống thuốc bắt đầu từ khi khối u hình thành rõ (ngày 6 kể từ khi tiêm tế bào gây ung thư) và theo dõi liên tục cho đến khi chết. Kết quả của nghiên cứu này cho thấy vào ngày 22 ở lô gây u không uống thuốc bắt đầu có 1 chuột chết. Trong các nghiên cứu về tác dụng ức chế phát triển u, tác dụng lên hệ miễn dịch, tác dụng chống oxy hóa, chuột cũng được cho uống thuốc bắt đầu từ khi khối u hình thành rõ (ngày 6 kể từ khi tiêm tế bào gây ung thư), và cho chuột uống liên tục trong 16 ngày tức là đến ngày thứ 21 thì dừng và giết chuột để đánh giá các chỉ tiêu nghiên cứu ở thời điểm kết thúc thí nghiệm. Việc dừng cho uống thuốc (sau 16 ngày uống thuốc) và kết thúc thí nghiệm ở ngày 21 kể từ khi tiêm tế bào gây ung thư nhằm đảm bảo chuột ở các lô chưa có chuột nào bị chết, thời gian uống thuốc ở tất cả các lô như nhau ở tất cả các chuột, giúp cho kết quả đánh giá được chính xác.

4.2.3.2. Về liều dùng của cao định lượng NP(H) và NP(O)

Trong nghiên cứu đánh giá tác dụng kháng u của cao định lượng từ rễ Tam thất, chúng tôi sử dụng 2 mức liều là 300 mg/kg và 900 mg/kg. Cơ sở để xác định liều dùng trong nghiên cứu này được dựa vào kết quả đánh giá độc tính cấp, cũng như dựa trên các nghiên cứu của các tác giả trước đó đã công bố.

Theo kết quả đánh giá độc tính cấp đường uống trên chuột nhắt trắng của cao Tam thất hấp NP(H), liều dung nạp tối đa của chuột nhắt được xác định là 6000 mg/kg. Việc xác định liều khởi đầu có tác dụng dược lý có thể được ước tính từ mức liều cao nhất chưa gây biểu hiện độc tính, bằng cách chia cho hệ số an toàn (safety factor). Hệ số an toàn mặc định được chấp nhận trong phần lớn các trường hợp có giá trị là 10. Tuy nhiên, hệ số an toàn có thể được nâng lên khi có lý do gia tăng mối quan tâm và giảm xuống khi mối quan tâm được giảm bớt vì dữ liệu có

sẵn cung cấp thêm đảm bảo an toàn [166]. Theo các tác giả Đỗ Trung Đàm, 138

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 222 trang tài liệu này.

Arunachalam K và cs, liều có tác dụng dược lý dao động trong giới hạn từ 1/20 đến 1/5 LD50 hoặc liều dung nạp tối đa [167], [168]. Trên cơ sở đó, nghiên cứu của chúng tôi sử dụng cao chiết từ Tam thất với liều 1 là 300 mg/kg (bằng 1/20 liều dung nạp tối đa) và liều 2 là 900 mg/kg (gần 1/6,7 liều dung nạp tối đa). So sánh mức liều dùng trong nghiên cứu của chúng tôi với liều dùng trong nghiên cứu của một số tác giả cũng cho thấy có sự tương đồng. Jizhou Zhang và cộng sự (2020)

[169] cho chuột uống saponin chiết từ Tam thất ở 3 mức liều 50 mg/kg, 100 mg/kg và 200 mg/kg đều thể hiện tác dụng làm giảm thể tích khối u so với lô không dùng thuốc và tác dụng này tăng theo mức liều. Nghiên cứu của Ren-Bo Ding và cs. (2015) [88] dùng liều saponin chiết từ Tam thất là 100 mg/kg và 300 mg/kg trên chuột nhắt cho thấy có tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ gan. Hàm lượng saponin trong cao chiết Tam thất không hấp NP(O) là 32,32 ± 0,41%, trong cao chiết Tam thất hấp NP(H) là 24,62 ± 0,20% (Bảng 1). Với liều 300 mg/kg và 900 mg/kg cao chiết, quy ra lượng saponin dùng ở mỗi mức liều của NP(O) khoảng 96,96 mg/kg và 290,88 mg/kg; lượng saponin dùng ở mỗi mức liều của NP(H) khoảng 73,86 mg/kg và 221,58 mg/kg. Như vậy ở các mức liều dùng cao chiết trong nghiên cứu của chúng tôi, lượng saponin ở các mức liều dùng gần tương đương so với các mức liều dùng của các tác giả Ren-Bo Ding và Jizhou Zhang [88], [169].

4.2.3.3. Về tác dụng ức chế sự phát triển u rắn sarcoma TG180 (in vivo)

Trong nghiên cứu của chúng tôi, sự phát triển của khối u được đánh giá bằng cách đo kích thước khối u với thước cặp có độ chính xác 0,1 mm. Thể tích khối u có thể được ước tính tương đối chính xác từ đường kính lớn nhất và nhỏ nhất theo công thức tính toáncủa Bagley và cộng sự [119]. Vào ngày 21, trọng lượng chính xác của khối u được xác định sau khi mổ xẻ. Kết quả ở bảng 3.20 cho thấy mối tương quan giữa thể tích khối u đo được và trọng lượng khối u, cụ thể là tỷ số ức chế u tính theo thể tích (%) gần như không khác biệt nhiều so với tỷ số ức chế u tính theo cân nặng (%). Như vậy, việc đo kích thước và thể tích khối u để

139

đánh giá sự phát triển của khối u được sử dụng trong nghiên cứu là phù hợp và có độ chính xác cao.

Kết quả đánh giá sự thay đổi thể tích khối u cho thấy ở các lô dùng Lentinan (LTN), cao Tam thất không hấp NP(O)-1 và NP(O)-2, cao Tam thất hấp NP(H)-1 và NP(H)-2, thể tích trung bình khối u tăng chậm hơn rõ rệt so với ở lô gây ung thư không dùng thuốc. Hình ảnh mô bệnh học khối u cũng cho thấy ở các lô điều trị các tế bào u với nhân quái nhân chia giảm rõ rệt so với lô ung thư không điều trị (hình 3.13). Các kết quả này chứng tỏ hiệu quả rõ rệt của các cao Tam thất cũng như thuốc tham chiếu trong ức chế sự phát triển khối u. Cao Tam thất cả loại hấp NP(H) và không hấp NP(O) ở cả hai mức liều 300 mg/kg và 900 mg/kg đều thể hiện tác dụng ức chế sự phát triển của khối u. Tuy nhiên, cao Tam thất hấp thể hiện tác dụng kháng u rõ nhất, khác biệt có ý nghĩa thống kê so với loại không hấp với p< 0,01 (Bảng 3.19). Hiệu lực kháng u của cao Tam thất hấp là (++) theo thang đánh giá của H. Itokawa, còn của cao Tam thất không hấp chỉ là (+) (Bảng 3.20). Kết quả này hoàn toàn phù hợp với kết quả nghiên cứu trước đó về tác dụng kháng u in vitro của Tam thất trồng tại Việt Nam [68]. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả đánh giá tác dụng ức chế các dòng tế bào ung thư in vitro, cao định lượng Tam thất hấp luôn thể hiện tác dụng tốt hơn so với cao định lượng Tam thất không hấp (bảng 3.12), cũng như kết quả về tác dụng rõ rệt của cao định lượng Tam thất hấp gây kích thích apoptosis đối với tế bào Sarcoma TG180 (Bảng 3.14-3.16). Kết quả này được lý giải bởi khi sau khi hấp hơi nóng, hàm lượng các saponin có tác dụng kháng u tốt là Rg3 và Rh1 trong NP(H) lần lượt là 16,16% và 2,57%, cao hơn hẳn so với trong NP(O) (lần lượt là 0,38% và 0,3%) (Bảng 3.11).

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng hoàn toàn phù hợp với kết quả nghiên cứu của các tác giả trên thế giới về tác dụng kháng u của Tam thất. Nhiều bệnh nhân bị u xơ hoặc ung thư vú, tử cung, tuyến tiền liệt được điều trị bằng Tam

thất trong thời gian dài cho thấy kích thước khối u không tăng lên đáng kể [170], 140

[171]. Một số nghiên cứu đã chỉ ra việc hấp rễ củ Tam thất làm tăng hoạt tính kháng u [81], [172], [173]. Ngoài ra, Tam thất còn được chứng minh có tác dụng làm tăng độ nhạy cảm của tế bào ung thư với các liệu pháp hóa học hoặc bức xạ, vì vậy nó có thể được sử dụng kết hợp với chúng trong điều trị bệnh nhân ung thư [174], [175], [176].

4.2.4. Về tác dụng của cao định lượng NP(H) và NP(O) lên miễn dịch trên chuột mang khối u rắn Sarcoma TG180

Nghiên cứu đánh giá các chỉ số huyết học bao gồm hồng cầu, huyết sắc tố, hematocrit (đánh giá mức độ thiếu máu); bạch cầu và công thức bạch cầu (đánh giá đáp ứng miễn dịch ở máu ngoại vi); và tiểu cầu (tế bào máu ngoại vi liên quan tới đông chảy máu). Kết quả nghiên cứu ở bảng 3.23 cho thấy ở chuột mang khối ung thư sarcoma 180 (lô UT), có hiện tượng thiếu máu biểu hiện bằng số lượng hồng cầu, hemoglobin và hematocrit giảm so với lô chứng sinh lý. Quá trình bệnh lý ung thư thường diễn ra với tình trạng khối u phát triển lấy đi dinh dưỡng của cơ thể, quá trình chống đỡ bệnh lý cũng gây tiêu hao năng lượng và dinh dưỡng, trong khi cơ thể mệt mỏi làm ăn uống kém, giảm khả năng hấp thu...gây ra tình trạng thiếu máu. Lentinan mặc dù không phải thuốc bổ máu nhưng có tác dụng kháng u, tăng cường miễn dịch [177] giúp cải thiện tình trạng bệnh trên chuột, vì vậy làm giảm tình trạng thiếu máu trên chuột mang khối u (p < 0,05 so với lô UT). Cao chiết giàu saponin từ Tam thất hấp và không hấp (ở cả hai mức liều) đều thể hiện tác dụng làm tăng số lượng hồng cầu, hemoglobin và hematocrit trên chuột mang khối u, khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô gây u không điều trị (p < 0,05). Trong đó, cao chiết giàu saponin từ Tam thất không hấp có tác dụng tương đương với Lentinan, còn cao chiết giàu saponin từ Tam thất hấp thể hiện tác dụng tốt hơn có ý nghĩa thống kê so với Lentinan cũng như so với cao chiết giàu saponin từ Tam thất không hấp (p < 0,05). Kết quả nghiên cứu có thể giải thích do Tam thất hấp hơi nóng làm thay đổi thành phần hoạt chất, từ đó làm thay đổi tác dụng của Tam thất.

141

Cụ thể Tam thất hấp hơi nóng có tác dụng tốt làm bổ máu, tăng cường miễn dịch, chống oxy hóa, và kháng u [82], [115]. Kết quả đánh giá trên tác dụng kháng u trên nhóm chuột mang u cho thấy Letinan 240 mg/kg/ngày cũng như NP(O) và NP(H) liều 300 mg/kg/ngày và 900 mg/kg/ngày đều làm giảm thể tích trung bình khối u (p

< 0,001 so với lô không dùng thuốc), trong đó NP(H) có tác dụng tốt hơn so với NP(O) (mục 3.2.3.3). Ngoài tác dụng bổ máu của các hoạt chất trong Tam thất, tác dụng kháng u cũng góp phần trong cơ chế làm giảm tình trạng thiếu máu trên chuột mang khối u. Tác dụng vượt trội làm giảm tình trạng thiếu máu trên chuột mang khối u của Tam thất hấp hơi nóng là một trong những cơ sở khoa học cần quan tâm trong hỗ trợ điều trị ung thư.

Kết quả đánh giá số lượng tiểu cầu cho thấy chuột ở lô UT có số lượng tiểu cầu tăng cao hơn so với lô SL (p < 0,05, Bảng 3.23). Có thể giải thích đây là tình trạng tăng tiểu cầu phản ứng thường gặp khi chuột bị cấy truyền tế bào ung thư. Các lô gây ung thư có dùng thuốc (Lentinan, cao Tam thất cả loại hấp và không hấp) số lượng tiểu cầu bình thường, tương đương với lô SL. Các thuốc dùng thể hiện tác dụng làm giảm, mất tình trạng tăng tiểu cầu phản ứng ở chuột cấy truyền tế bào ung thư. Tăng số lượng tiểu cầu có thể gây rối loạn về đông máu chảy máu, do đó việc bình thường hóa số lượng tiểu cầu trên chuột mang khối u có ý nghĩa tốt trong điều trị.

Số lượng bạch cầu trong máu ngoại vi phản ánh cả hai phương thức đáp ứng miễn dịch tự nhiên và đáp ứng miễn dịch đặc hiệu. Trên chuột bị cấy truyền tế bào ung thư (lô UT), số lượng bạch cầu máu ngoại vi tăng cao (p < 0,05 so với lô SL, Bảng 3.21). Chuột ở các lô gây ung thư có dùng thuốc (Lentinan, cao Tam thất cả loại hấp và không hấp) có số lượng bạch cầu giảm so với ở lô UT (p < 0,05), trở về tương đương với lô SL. Cơ chế thay đổi của bạch cầu máu ngoại vi ở lô UT có thể do tình trạng phản ứng của cơ thể chuột khi bị tiêm truyền tế bào ung thư. Ở chuột sử dụng thuốc, có thể do tác động điều chỉnh của thuốc đối với quá trình bệnh nên

142

số lượng bạch cầu được điều chỉnh về tương đương với lô SL. Kết quả đánh giá công thức bạch cầu không thấy có sự biến đổi tỷ lệ % các loại bạch cầu (Bảng 3.21). Kết quả đánh giá về tác dụng lên số lượng bạch cầu chuột mang khối u sarcoma 180 của chúng tôi tương đồng với kết quả của tác giả Trần Thị Hải Vân và cộng sự (2013) khi đánh giá về tác dụng kháng u của cốm sói rừng [54].

Một số chỉ số miễn dịch được đánh giá trong nghiên cứu là nồng độ IL-2 và TNF-α trong máu chuột và cân nặng lách, tuyến ức của chuột. Hệ thống miễn dịch ngoài các cơ quan miễn dịch và các tế bào có thẩm quyền miễn dịch còn có sự tham gia của các cytokine. Đây là những chất tiết quan trọng của các tế bào miễn dịch đã được hoạt hóa bởi kháng nguyên. Trong số đó thì IL-2 và TNF-α là 2 cytokine có vai trò quan trọng trong đáp ứng miễn dịch với các tế bào ung thư [178], [179]. Interleukin-2 (IL-2) do tế bào lympho Th hoạt hóa tiết ra, có tác dụng kích thích tế bào lympho T cụ thể là các tế bào TCD4 và TCD8, đồng thời kích thích tế bào lympho B phát triển và biệt hóa, tăng cường tế bào NK (Natural killer cells) và tế bào LAK (Lymphokine – activated killer cells). Những kết quả nghiên cứu tiền lâm sàng và lâm sàng đều cho thấy, IL-2 có khả năng kích thích, phát triển các tế bào miễn dịch, tăng khả năng tiêu diệt các tế bào ung thư [178], [179]. TNF- α (yếu tố hoại tử khối u) là một cytokine đa chức năng tham gia vào quá trình apoptosis, quá trình viêm và đáp ứng miễn dịch của cơ thể, được tổng hợp chủ yếu ở đại thực bào. Một số loại tế bào khác cũng tham gia vào tổng hợp TNF- α như các tế bào giết tự nhiên, bạch cầu hạt, lympho bào T, B, tế bào mô mỡ, tế bào sao và nội mạc mạch máu [178]. Sự tổng hợp và tiết TNF- α chủ yếu do sự kích thích khi tế bào tiếp xúc với kháng nguyên. TNF- α ảnh hưởng đến các tế bào đích thông qua các thụ thể đặc hiệu. Định lượng nồng độ IL-2 và TNFα trong huyết thanh chuột nhằm đánh giá tác dụng của thuốc thử lên khả năng chế tiết cytokine. Kết quả nghiên cứu cho thấy ở lô gây u không điều trị, nồng độ IL-2 và TNF-α máu tăng so với lô chứng sinh lý (p

< 0,05). Ở các lô dùng thuốc lentinan cũng như cao chiết giàu saponin từ Tam thất 143

(cả hấp và không hấp), nồng độ IL-2 và TNF-α máu tiếp tục tăng và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô UT (Bảng 3.22). Thuốc tham chiếu Lentinan là một beta1,3 beta-glucan với phân nhánh β-1,6, có tác dụng chính là tăng cường miễn dịch, chống khối u, đã được nhiều nghiên cứu chứng minh [47], [180]. Việc làm tăng nồng độ IL-2 và TNF-α máu trên chuột mang u của Lentinan và cao Tam thất thể hiện tác dụng tăng cường miễn dịch theo định hướng chống khối u của thuốc thử. Ở các lô NP(O)-1 và NP(O)-2, nồng độ IL-2 và TNF-α máu chuột thấp hơn có ý nghĩa thống kê so với ở các lô LTN, NP(H)-1 vàNP(H)-2 (p < 0,05). Điều này là phù hợp do Tam thất không hấp chủ yếu có tác dụng “tả”, làm tan máu đông, thúc đẩy lưu thông máu, cầm máu và giảm viêm; còn Tam thất hấp có tác dụng “bổ”, giúp bổ máu, tăng cường miễn dịch, chống lão hóa, chống oxy hóa.

Tuyến ức và lách là hai cơ quan quan trọng của hệ thống miễn dịch. Tuyến ức là cơ quan miễn dịch trung ương chính của sinh vật, có vai trò điều hòa quan trọng đối với các cơ quan miễn dịch ngoại vi và tế bào miễn dịch. Lá lách, với tư cách là cơ quan miễn dịch ngoại vi lớn nhất, điều hòa miễn dịch trên sinh vật bằng hoạt động thực bào của đại thực bào, miễn dịch tế bào qua trung gian tế bào T và miễn dịch dịch thể qua trung gian tế bào B. Tế bào lympho T chủ yếu được biệt hóa, phát triển và trưởng thành trong tuyến ức, nhưng tất cả các tế bào lympho T và B ở trên đều được hoàn thiện trong lá lách. Khi hai cơ quan này được kích thích tăng cường hoạt động trong đáp ứng tăng cường miễn dịch của cơ thể, khối lượng của hai cơ quan sẽ tăng lên. Vì vậy, đánh giá khối lượng tương đối của lách và tuyến ức được xem là một chỉ số để đánh giá tác dụng tăng cường miễn dịch [181]. Kết quả nghiên cứu cho thấy: ở lô gây u không điều trị (UT), khối lượng tương đối của lách và tuyến ức chuột tăng so với lô chứng sinh lý (SL) (p < 0,05); ở các lô dùng thuốc, khối lượng tương đối của lách và tuyến ức chuột tiếp tục tăng và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô UT (Bảng 3.24). Thông qua khối lượng tương đối của lách và tuyến ức, ta thấy sự tăng cường hoạt động của lách và tuyến ức trong đáp ứng

144