Về Kết Quả Đánh Giá Độc Tính Của Cao Định Lượng Np(H).

4.3. Về kết quả đánh giá độc tính của cao định lượng NP(H).

Các kết quả nghiên cứu về tác dụng, cho thấy tác dụng vượt trội của cao định lượng chiết từ Tam thất hấp (NP(H)) cho các tác dụng hỗ trợ điều trị ung thư. Vì vậy, nhóm nghiên cứu lựa chọn cao định lượng NP(H) để đánh giá độc tính, từ đó đưa ra cơ sở về tính an toàn của cao nhằm định hướng cho việc sử dụng trên lâm sàng. Theo hướng dẫn của Bộ y tế, ngoại trừ các bài thuốc cổ phương được chiết xuất theo phương pháp truyền thống, tất cả các thuốc có nguồn gốc từ dược liệu đều phải đánh giá độc tính cấp và bán trường diễn trên động vật thực nghiệm trước khi đưa vào thử nghiệm trên người. Cao định lượng NP(H) được bào chế theo phương pháp hiện đại từ dược liệu hấp, do đó là đối tượng cần được đánh giá về độc tính cấp và bán trường diễn [124].

4.3.1. Về độc tính cấp của cao định lượng NP(H).

Độc tính cấp là những tác dụng không mong muốn xảy ra sau khi một chất được sử dụng trong một hoặc nhiều liều trong khoảng thời gian không quá 24 giờ [190]. Chuột nghiên cứu được lựa chọn bao gồm cả chuột đực và chuột cái, kết quả nghiên cứu vì thế bao hàm cho cả 2 giống. Đường đưa thuốc sử dụng là đường uống, theo đúng như đường dự kiến sử dụng trên người. Việc theo dõi biểu hiện độc tính và số chuột chết sau khi cho chuột dùng mẫu thử là 14 ngày, trong đó cần theo dõi liên tục trong 72 giờ đầu để có thể phát hiện kịp thời và chính xác dấu hiệu ngộ độc [191]. Việc phẫu tích chuột được tiến hành với các chuột chết hoặc biểu hiện ngộ độc nhưng không chết, nhằm đánh giá nguyên nhân gây độc hoặc gây chết chuột. Các nguyên nhân gây độc hay gây chết chuột có thể là do độc tính của thuốc như gây kích thích thần kinh làm chuột co giật, suy hô hấp và chết; hoặc gây suy gan, suy thận; nhưng cũng có thể do đi lỏng nhiều gây rối loạn điện giải mà chết; do tắc ruột; do tổn thương gây chảy máu trong…[167], [191]. Trong nghiên cứu về độc tính cấp của cao định lượng NP(H), không có chuột nào bị chết nên không có bất kỳ các nguyên nhân nào kể trên.

Nghiên cứu độc tính cấp đường uống trên chuột nhắt trắng,chuột được cho uốngcao định lượng NP(H) liều tăng dần từ 1000 mg/kg thể trọng/ngày đến 6000 mg/kg thể trọng/ngày. Chuột đã uống đến liều 6000 mg/kg thể trọng nhưng không có chuột nào có biểu hiện độc tính hoặc bị chết. Như vậy liều dung nạp tối đa là 6000 mg/kg thể trọng và LD50 >6000 mg/kg thể trọng. Theo phân loại LD50 dựa trên phạm vi liều, với LD50 trong khoảng 5000-15000 mg/kg được xếp vào là không có độc [192]. Như vậy cao định lượng NP(H) được đánh giá là không có độc trong đánh giá thử nghiệm độc tính cấp đường uống trên chuột nhắt trắng.

4.3.2. Về độc tính bán trường diễn của cao định lượng NP(H).

Nghiên cứu độc tính bán trường diễn được thực hiện bằng cách cho động vật thí nghiệm uống thuốc thử hàng ngày, lặp lại liên tục trong một khoảng thời gian nhất định. Thời gian dùng thuốc thử phụ thuộc vào thời gian dùng trên lâm sàng. Theo hướng dẫn của Tổ chức Y tế thế giới [125] và quy định của Bộ y tế Việt Nam [124], thời gian nghiên cứu bán trường diễn trên động vật thường gấp 4 lần thời gian dự kiến dùng trên người. Tuy nhiên, nếu nghiên cứu trên động vật trong thời gian quá dài, đặc biệt khi cho động vật dùng thuốc cưỡng bức (qua kim cong đầu tù), một số yếu tố nhiễu có thể ảnh hưởng đến kết quả nghiên cứu. Vì vậy, nếu thời gian dự định sử dụng trên người là dùng hàng ngày trên 30 ngày thì thời gian nghiên cứu bán trường diễn trên động vật là 3 tháng [126], [193]. Nghiên cứu bán trường diễn của cao định lượng NP(H) được thực hiện trong thời gian 3 tháng, với mục tiêu nhằm bảo đảm việc đánh giá được tính an toàn của chế phẩm khi dự kiến sử dụng trên người hàng ngày trên 30 ngày.

Độc tính bán trường diễn của cao định lượng NP(H) được thực hiện trên chuột cống trắng, số lượng chuột mỗi lô là 10, và gồm 3 lô: lô chứng sinh lý uống nước cất; lô trị 1 dùng NP(H) với mức liều 1 là 200mg/kg/ngày; lô trị 2 dùng NP(H) với mức liều 2 là 900mg/kg/ngày. Theo kết quả nghiên cứu đánh giá tác dụng, NP(H) dùng với liều 300 mg/kg/ngày trên chuột nhắt trắng có tác dụng kháng u,

154

tăng miễn dịch, chống oxy hóa rõ. Như vậy liều 300 mg/kg/ngày được xem là liều tác dụng trên chuột nhắt trắng. Quy đổi ra liều trên có tác dụng trên người (hệ số qui đổi là 12) thì liều có tác dụng trên người là 25 mg/kg/ngày. Qui đổi ra liều trên chuột cống (hệ số qui đổi là 7) thì liều có tác dụng trên chuột cống là 175 mg/kg [177]. Với khoảng liều dùng tương đối rộng của dược liệu, để bảo đảm khảo sát được độc tính của mẫu thử, chúng tôi lựa chọn mức liều 1 (liều tương đương với liều có tác dụng) là 200 mg/kg/ngày, cao hơn 1 chút so với liều tính toán 175 mg/kg. Mức liều 2 theo qui định gấp từ 3 đến5, có thể lên đến 10 lần mức liều 1 [167], [124]. Trong nghiên cứu này chúng tôi lựa chọn mức liều 2 là 900 mg/kg/ngày, gấp 4,5 lần mức liều 1. Việc lựa chọn liều ngoài dựa trên cơ sở về liều đánh giá độc tinh theo qui định trên, còn dựa sự thuận tiện và khả thi để có được nồng độ và thể tích cho chuột uống hàng ngày. Việc thiết kế các mức liều cho chuột uống và số lượng chuột sử dụng trong môi lô nghiên cứu như vậy nhằm đảm bảo độ tin cậy của nghiên cứu và tuân theo qui định của Bộ Y tế trong đánh giá tính an toàn của thuốc từ dược liệu [167], [124].

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 222 trang tài liệu này.

Các chỉ tiêu để đánh giá độc tính bán trường diễn bao gồm: tình trạng chung và thay đổi thể trọng, các chỉ số huyết học, các chỉ số sinh hoá đánh giá chức năng gan, thận và đặc điểm giải phẫu bệnh của gan, lách, thận.

Tình trạng chung và cân nặng của động vật thực nghiệm là các chỉ số nghiên cứu bắt buộc theo dõi trước khi dùng thuốc và định kỳ trong thời gian dùng thuốc [193]. Trong suốt thời gian nghiên cứu, chuột ở cả ba lô đều hoạt động bình thường, lông mượt, da niêm mạc bình thường, ăn uống bình thường, phân thành khuôn. Sự phát triển cân nặng của chuột ở các lô bình thường.

Các chỉ số trong xét nghiệm tế bào máu ngoại vi có giá trị lớn trong việc đánh giá chức năng tạo máu [194]. Vì vậy, chúng tôi đánh giá ảnh hưởng của cao định lượng NP(H) đến chức phận tạo máu thông qua các chỉ số huyết học gồm: số lượng hồng cầu, thể tích trung bình hồng cầu, hàm lượng hemoglobin, hematocrit, số lượng bạch cầu,

155

công thức bạch cầu và số lượng tiểu cầu. Ngoài ra, hình ảnh đại thể và vi thể lách, một cơ quan quan trọng phản ánh chức năng tạo máu và đời sống của các tế bào máu [194], cũng được đánh giá. Kết quả nghiên cứu cho thấy, xét nghiệm máu về các chỉ số huyết học tại các thời điểm sau uống cao định lượng NP(H) trong 30, 60 và 90 ngày không có sự khác biệt có ý nghĩa so với lô chứng và so với trước khi dùng thuốc ở tất cả các chỉ số nghiên cứu (p > 0,05). Hình ảnh vi thể và đại thể lách chuột bình thường. Các kết quả này phản ánh cao định lượng NP(H) ở cả hai mức liều đã dùng, không gây ảnh hưởng xấu lên chức năng tạo máu và đời sống hồng cầu của chuột sau 90 ngày uống mẫu thử.

Trong đánh giá độc tính, ảnh hưởng của mẫu thử tới gan và thận là yêu cầu bắt buộc phải đánh giá [124], [191]. Thứ nhất, đây là 2 cơ quan rất quan trọng trong quá trình chuyển hóa và thải trừ thuốc. Thứ hai, đây là hai cơ quan dễ bị tổn thương nhất khi dùng thuốc. Gan là một tạng lớn nhất, là trung tâm chuyển hóa quan trọng của cơ thể. Một chất khi đưa vào cơ thể, nếu có độc tính thường sẽ gây độc với gan, làm tổn thương tế bào gan. Sự tổn thương tế bào gan làm tăng hoạt độ của một số enzym có nguồn gốc gan trong huyết thanh, quan trọng nhất là 2 enzym ALT (Alanin transaminase) và AST (Aspartat transaminase). ALT là enzym có nhiều nhất ở gan, khu trú trong bào tương của tế bào nhu mô gan. Khi tổn thương hủy hoại tế bào gan, thậm chí chỉ cần thay đổi tính thấm của màng tế bào gan, hoạt độ ALT trong máu đã tăng cao. Khác với ALT, 2/3 AST khu trú trong ty thể (mitochondria) và chỉ ít hơn 1/3 lượng AST khu trú ở bào tương của tế bào. Khi tổn thương tế bào gan ở mức độ dưới tế bào, AST trong ty thể được giải phóng ra. Do đó, khi tổn thương gan, AST và ALT đều tăng rất cao so với bình thường, nhưng mức độ tăng của ALT cao hơn so với AST, tăng sớm trước khi có vàng da, ở tuần đầu vàng da [195]. Trong nghiên cứu này, hoạt độ ALT và AST trong máu chuột ở hai lô uống cao định lượng NP(H) không có sự khác biệt có ý nghĩa so với lô chứng và khi so sánh giữa các thời điểm trước và sau khi uống thuốc thử 30, 60 và 90

156

ngày, chứng tỏ cả 2 liều cao định lượng NP(H) đã dùng đều không gây tổn thương hủy hoại các tế bào gan. Kết quả mô bệnh học cũng phù hợp với kết quả xét nghiệm hóa sinh máu. Hình ảnh đại thể và vi thể gan ở cả hai lô uống cao định lượng NP(H) đều có cấu trúc tế bào gan bình thường, khoảng cửa và mạch máu bình thường giống như lô chứng, không thấy hình ảnh tổn thương vi thể gan.

Albumin là loại protein quan trọng nhất của huyết thanh. Albumin tham gia vào hai chức năng chính là duy trì từ 70 đến 80% áp lực thẩm thấu trong huyết tương, đồng thời liên kết vận chuyển các chất có dạng phân tử nhỏ như bilirubin, các acid béo hoặc thuốc có bên trong máu. Gan là nơi tổng hợp protein chính cho nên khi nội tạng này bị tổn thương thì sẽ kéo theo chức năng gan bị suy giảm, dẫn đến việc hấp thụ các chất dinh dưỡng protein không tốt hoặc bị đình trệ dẫn tới sự tổng hợp Albumin kém [194]. Vì vậy, việc xét nghiệm chỉ số nồng độ Albumin có trong máu có giá trị trong đánh giá tổn thương chức năng gan [195]. Kết quả nghiên cứu cho thấy cao định lượng NP(H) dùng ở cả 2 mức liều dùng, trong 90 ngày không gây ảnh hưởng lên chỉ số Albumin máu chuột, chứng tỏ mẫu thử không ảnh hưởng chức năng tổng hợp Albumin của gan.

Thận là cơ quan thải trừ, đào thải các chất ra ngoài cơ thể qua nước tiểu. Để tạo thành nước tiểu, quá trình lọc ở thận các mô thận sẽ có nhiều máu qua nhất, thời gian và lượng các chất chuyển hoá mà mô thận tiếp xúc thường là nhiều [194]. Mẫu thử khi qua thận có thể gây độc và làm tổn thương thận, từ đó ảnh hưởng đến chức năng thận. Creatinin là thành phần đạm trong máu ổn định nhất, gần như không phụ thuộc vào chế độ ăn hoặc những thay đổi sinh lý mà chỉ phụ thuộc vào khả năng đào thải của thận, do đó là chỉ số thường được dùng để đánh giá và theo dõi chức năng thận [195]. Khi cầu thận bị tổn thương, nồng độ creatinin máu tăng sớm và tin cậy. Trong thí nghiệm này, kết quảđịnh lượng creatinin trong máu chuột ở cả 2 lô uống cao định lượng NP(H) ở cả 2 mức liều dùng, sau 30, 60 và 90 ngày uống mẫu thử không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô chứng cũng

như so sánh giữa các thời điểm (p > 0,05). Kết quả về xét nghiệm creatinin hoàn toàn phù hợp với kết quả về mô bệnh học thận. Quan sát đại thể và cấu trúc vi thể thận của chuột nghiên cứu ở hai lô uống cao định lượng NP(H) cũng như ở lô chứng không có dấu hiện của tổn thương.

Kết quả nghiên cứu về độc tính của cao định lượng NP(H) chứng tỏ mẫu thử có tính an toàn cả trong đánh giá độc tính cấp và độc tính bán trường diễn 90 ngày. Một số nghiên cứu cũng cho thấy Tam thất cũng như các ginsenosid chiết xuất từ Tam thất hầu như không gây độc tính [196], [197].

KẾT LUẬN

1. Về ảnh hưởng của phương pháp chế biến hấp nhiệt đến hàm lượng saponin của rễ củ Tam thất

Từ cao n-buthanol của dịch chiết MeOH 80%, đã phân lập được 4 hợp chất từ rễ củ Tam thất chưa chế biến là ginsenosid Rg1 (1), ginsenosid Re (2), ginsenosid Rd (3) và ginsenosid Rb1 (4) và 2 hợp chất ginsenosid Rg3 (5) và ginsenosid Rh1

(6) từ rễ củ Tam thất sau khi hấp ở nhiệt độ 120oC trong 8h.

Khảo sát các yếu tố hấp: thời gian hấp (0, 4, 8, 12, 16, 20, 24h), nhiệt độ hấp (1000C, 1200C), mẫu Tam thất tươi hoặc khô. Trong quá trình hấp, hàm lượng các saponin chính trong Tam thất chưa xử lý qua hấp hơi nóng là Rg1, Rb1 và Rd, Re giảm dần; hàm lượng các saponin mới như Rh1 và Rg3 tăng lên.

Đã lựa chọn được điều kiện chế biến hấp nhiệt để cho hàm lượng Rh1 và Rg3 cao nhất là: mẫu khô, hấp 120oC trong 8h.

Từ cao định lượng cồn ethanol, đã bào chế được hai loại cao định lượng NP(O) từ Tam thất chưa hấp và cao định lượng NP(H) từ Tam thất đã hấp, với hiệu suất chiết cao và hàm lượng saponin trong cao như sau:

2.Về tác dụng kháng u thực nghiệm của các dạng cao định lượng và một số saponin phân lập từ rễ củ Tam thất.

*Đánh giá tác dụng kháng ung thư của 6 saponin đã phân lập và cao định lượng NP(O), NP(H) trên một số dòng tế bào ung thư người.

Trong cùng điều kiện thí nghiệm: So sánh hoạt tính in vitro đối với 6 dòng tế bào ung thư người được thử gồm HT29, HepG2, RD và MCF7, SK LU-1 và A549 hoạt tính của hai saponin Rg3 và Rh1 thu được từ Tam thất hấp qua nhiệt (hơi nóng) có tác dụng mạnh hơn so với 4 saponin Rg1, Re, Rd và Rb1 thu được khi nguyên liệu không qua hấp hơi nóng. Hoàn toàn thể hiện cùng chiều hướng khi so

sánh hoạt tính của cao định lượng NP(H) có tác dụng mạnh hơn cao định lượng NP(O).

* Đánh giá độc tính và khảo sát khả năng kích thích apoptosis của cao định lượng NP(H) trên dòng tế bào ung thư mô liên kết chuột sarcoma TG180.

- Chế phẩm NP(H) tác dụng gây độc với tế bào Sarcoma TG180, với giá trị IC50 thu được:IC50=206, 65±10,11µg/ml.

- Chế phẩm NP(H) ở nồng độ 103,3µg có tác dụng cảm ứng và kích thích tế bào Sarcoma TG180 chết theo chương trình apoptosis ngay từ giai đoạn sớm thể hiện tỷ lệ dương tính rất cao cụ thể: Tại thời điểm 24h tăng 134,4% và 48h là 193,4%, xấp xỉ tăng 200% so với đối chứng.

*Đánh giá tác dụng kháng u trên thực nghiệm in vivo

Trên mô hình chuột mang u sarcoma TG 180, cao định lượng NP(H) có tác dụng kháng u tốt làm giảm kích thước khối u, tăng cường miễn dịch, chống oxy hoá bảo vệ gan, kéo dài thời gian sống của chuột. Các tác dụng này của cao định lượng NP(H) đều mạnh hơn so với của cao định lượng NP(O).

3.Nghiên cứu độc tính cấp, độc tính bán trường diễn của cao định lượng NP(H)

* Độc tính cấp: Chưa tìm thấy LD50 của cao định lượng NP(H) theo đường uống trên chuột nhắt trắng. Với mức liều cao nhất có thể cho chuột uống trong 24 giờ là 6000mg/kg thể trọng đã không thể hiện độc tính cấp.

* Độc tính bán trường diễn: Khi cho chuột cống trắng uống cao định lượng NP(H) với 2 mức liều là 200mg/kg/ngày và 900mg/kg/ngày liên tục trong 90 ngày đã không ảnh hưởng tới sự phát triển cân nặng và hoạt động của chuột, không ảnh hưởng tới các chỉ số huyết học (số lượng hồng cầu, hemoglobin, hematocrit, thể tích trung bình hồng cầu, số lượng bạch cầu và số lượng tiểu cầu); sinh hóa (AST, ALT, creatinin, albumin và cholesterol) và hình thái đại thể cũng như vi thể gan, lách và thận.