Về Kết Quả Đánh Giá Tác Dụng Chống Oxy Hóa Trên Chuột Mang Khối U Rắn Sarcoma

miễn dịch ở lô dùng cao giàu saponin từ Tam thất hấp là tương đương so với ở lô dùng Lentinan, và tốt hơn có ý nghĩa thống kê so với ở các lô dùng cao giàu saponin từ Tam thất không hấp (p < 0,05). Kết quả này cũng tương đồng với kết quả của Trần Thị Hải Vân và cộng sự [54].

4.2.5. Về kết quả đánh giá tác dụng chống oxy hóa trên chuột mang khối u rắn sarcoma TG 180.

Nhiều bằng chứng đã chỉ ra rằng các loại oxy phản ứng (reactive oxygen species - ROS) đóng một vai trò quan trọng trong quá trình phát triển và di căn của khối u. ROS là nguyên nhân chính dẫn đến đột biến DNA và sự mất ổn định của hệ gen tế bào [182]. Trong môi trường vi mô khối u, ROS được tạo ra bởi các tế bào khối u tăng sinh nhanh chóng có thể gây ra phản ứng stress oxy hóa do làm rối loạn chất nền tế bào, dẫn đến việc kích hoạt các tín hiệu tạo mạch, giải phóng các enzyme tham gia vào các quá trình phát triển và xâm lấn của khối u và điều hòa biểu hiện cytokine, thúc đẩy sự dung nạp miễn dịch và sự phát triển của khối u [183].

Để đánh giá tác dụng chống oxy hóa, chúng tôi tiến hành đánh giá các chỉ số về oxy hóa gồm malondialdehyd (MDA), superoxid dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathion (GSH) trong gan và định lượng men gan đánh giá mức độ tổn thương tế bào gan trên chuột mang khối u rắn sarcoma TG 180. Gan là một cơ quan dễ bị tổn thương trong stress oxy hóa. Trên chuột mang khối u, sự tồn tại và phát triển liên tục của khối u làm sự gia tăng stress oxy hóa, căn nguyên gây tổn thương gan tồn tại liên tục. Stress oxy hóa trong gan làm giảm các chất chống oxy hóa như superoxid dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathion (GSH) và tăng sự peroxid hóa lipid (LPO) trong gan [184], [185]. Nhiều nghiên cứu đánh giá về tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ gan của các chế phẩm sử dụng trong hỗ trợ điều trị ung thư [133], [134]. Mặc dù tổn thương gan không mang tính cấp tính như ở các mô hình gây viêm gan bằng hóa chất, nhưng tổn thương gan ở chuột mang khối u diễn biến âm ỉ, liên tục, kéo dài. Kết quả các enzym AST, ALT ở lô mô hình tăng có ý nghĩa

thống kê so với lô chứng, tuy nhiên mức độ tăng không nhiều như các mô hình gây tổn thương gan bằng hóa chất. Kết quả này phù hợp so với báo cáo của Senthilkumar và cs (2008) [134]. Trong nghiên cứu của Senthilkumar và cs, chuột mang khối u báng Ehrlich cũng có tăng các enzym AST, ALT có ý nghĩa thống kê so với lô chứng không mang u, tuy nhiên mức độ tăng không quá cao.

Kết quả nghiên cứu cho thấy, cao định lượng Tam thất thể hiện rõ tác dụng chống oxy hóa và tác dụng bảo vệ gan. Không có sự khác biệt khi so sánh giữa lô dùng liều thấp và lô dùng liều cao. Ren-Bo Ding và cs. (2015) [88] đánh giá tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ gan của cao định lượng saponin từ Tam thất trên chuột nhắt gây tổn thương gan cấp do rượu cũng cho kết quả tương tự. Kết quả đánh giá của của Ren-Bo Ding cũng cho thấy không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ gan khi so sánh giữa hai lô dùng thuốc liều cao và liều thấp cũng hoàn toàn tương tự với kết quả nghiên cứu mà chúng tôi thu được.

Tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ gan ở lô dùng cao định lượng từ Tam thất hấp NP(H) tốt hơn so với ở các lô dùng cao định lượng từ Tam thất không hấp NP(O) khi so sánh cùng mức liều (p< 0,05). Quá trình hấp hơi nóng làm tăng hàm lượng các ginsenosid Rg3, Rh1, giảm hàm lượng các ginsenosidRb, Rd, Rg1, Re [81], [82]. Kết quả phân tích hàm lượng các saponin trong các mẫu nghiên cứu của chúng tôi cũng cho kết quả tương tự. Do có các biến đổi về thành phần như vậy, Tam thất ở dạng chưa hấp và Tam thất ở dạng hấp có những khác biệt về tác dụng. Tam thất dạng hấp có tác dụng “bổ”, giúp bổ máu, tăng cường miễn dịch, chống lão hóa, chống oxy hóa.Tam thất hấp với các thành phần Rg3, Rh1 tăng cao đi kèm với tác dụng chống oxy hóa mạnh hơn so với Tam thất chưa hấp [81], [82]. Khả năng của ginsenosides loại bỏ ROS được sắp xếp theo thứ tự giảm dần: Rc> Rb2> Rg2> Rh2> Rh1> Rf> Rg3> Rg1> Rb1> Re> Rd [186]. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy rõ sự khác biệt về tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ gan của Tam thất hấp so

với Tam thất không hấp, phù hợp với lý thuyết dược học cổ truyền cũng như kết quả nghiên cứu của các tác giả đã công bố [82], [186].

Trong nghiên cứu chúng tôi sử dụng Lentinan làm thuốc tham chiếu. Lentinan là một β-1,3 β-glucan với phân nhánh β-1,6, có tác dụng chính là tăng cường miễn dịch, chống khối u. Tác dụng chống oxy hóa của Lentinan cũng được một số tác giả báo cáo [164], [165]. Trong nghiên cứu này, tác nhân gây tăng oxy hóa, tổn thương tế bào gan chính là khối u gây ra trên chuột. Vì vậy, thuốc ức chế sự phát triển của khối u cũng sẽ tạo nên tác dụng hạn chế sản sinh các gốc tự do và làm giảm tổn thương tế bào gan. Đồng thời, cả Tam thất và Lentinan đều có tác dụng chống oxy hóa, một cơ chế quan trọng trong bảo vệ tế bào gan. Kết quả của chúng tôi cho thấy Lentinan làm giảm AST, ALT máu, giảm MDA gan, tăng SOD, GSH và CAT gan chuột gây u so với lô so với lô gây u không điều trị (p< 0,05), tuy nhiên tác dụng này của Lentinan kém hơn so với cao Tam thất hấp (p< 0,05), tương đương so với cao Tam thất không hấp. Ren-Bo Ding và cs (2015) [88] báo cáo tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ gan của cao saponin từ Tam thất trên chuột nhắt gây tổn thương gan cấp do rượu. Cũng trên đối tượng nghiên cứu này, tác dụng kháng u của cao định lượng từ Tam thất hấp tốt hơn không có ý nghĩa thống kê so với Lentinan. Với tác dụng kháng u tương đương, kết quả Tam thất hấp có tác dụng bảo vệ gan tốt hơn Lentinan có thể được lý giải nhờ vào tác dụng chống tổn thương oxy hóa tế bào của ginsenosid Rg3 [187].

4.2.6. Về tác dụng kéo dài thời gian sống thêm của chuột mang khối u rắn sarcoma TG 180.

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 222 trang tài liệu này.

Thời gian sống thêm sau điều trị là một chỉ số có ý nghĩa lâm sàng, được coi là yếu tố quan trọng nhất để đánh giá hiệu quả chung của các liệu pháp điều trị ung thư. Kết quả trong Bảng 3.27, 3.28 và Hình 3.16 cho thấy các chuột ở những lô gây u có điều trị có thời gian sống thêm kéo dài hơn có ý nghĩa thống kê so với lô gây u không điều trị. Trong đó, các lô gây u điều trị bằng cao định lượng Tam thất hấp

thể hiện tác dụng kéo dài thời gian sống thêm của chuột tốt hơn, thông qua một số chỉ số như chuột đầu tiên cũng như chuột cuối cùng bị chết ở các lô này đều muộn hơn so với các lô uống Lentinan hoặc cao định lượng Tam thất không hấp. So với lô UT, các lô NP(H)-1 và NP(H)-2 có tỷ lệ chuột sống sót tích lũy theo thời gian cũng như thời gian sống trung bình của chuột lớn hơn có ý nghĩa thống kê với p < 0,01. Các lô NP(O)-1 và NP(O)-2 và Lentinan cũng có tỷ lệ chuột sống sót tích lũy theo thời gian và thời gian sống trung bình của chuột lớn hơn so với lô UT, nhưng với p < 0,05. Thời gian sống kéo dài thêm ở hai lô NP(H)-1 và NP(H)-2 là cao nhất, tương ứng là 48,20% và 55,12 %. Thời gian sống kéo dài thêm ở các lô LTN, NP(O)-1 và NP(O)-2 nhỏ hơn, lần lượt là 40,68, 35,61% và 41,27%. So với các lô LTN, NP(O)-1, NP(O)-2, tỷ lệ chuột sống sót tích lũy cũng như thời gian sống trung bình của chuột ở các lô NP(H)-1 và NP(H)-2 lớn hơn có xu hướng có ý nghĩa thống kê (0,1 > p > 0,05). Kết quả này là phù hợp với với các kết quả nghiên cứu đã chứng minh cao định lượng Tam thất hấp cho kết quả về các tác dụng ức chế phát triển khối u, tác dụng tăng cường miễn dịch và tác dụng chống oxy hóa trên chuột mang khối u tốt hơn so với cao định lượng Tam thất không hấp. Kết quả nghiên cứu cũng phù hợp với nghiên cứu của một số tác giả cho thấy tam thất, đặc biệtginsenosid Rg3 (là saponin tăng lên trong quá trình hấp Tam thất) có tác dụng làm tăng thời gian sống thêm của chuột mang khối u [169], [188], [189].

4.2.7. Về cơ chế tác dụng kháng u của rễ củ tam thất.

Từ rễ củ tam thất, nghiên cứu đã phân lập được 6 saponin và bào chế ra cao định lượng NP(O), NP(H) từ rễ củ tam thất chưa hấp và rễ củ tam thất hấp. Phần lớn các saponin phân lập từ rễ củ tam thất đều thể hiện hoạt tính ức chế đối với các dòng tế bào ung thư người thử nghiệm (gồm HT29, HepG2, RD và MCF7, SK LU-1 và A549) trong đó hoạt tính của hai saponin Rg3 và Rh1 thu được từ Tam thất hấp qua nhiệt (hơi nóng) có tác dụng mạnh hơn so với 4 saponin Rg1, Re, Rd và Rb1 thu được khi nguyên liệu không qua hấp hơi nóng (bảng 3.12). Cao định

148

lượng NP(H) thể hiện hoạt tính ức chế tương đối mạnh sự phát triển của 5 dòng tế bào ung thư là HT29, HepG2, MCF7, SK LU1 và A549 đã thử với giá trị IC50 từ 7,03 đến 9,11 µg/ml (bảng 3.12). Như vậy, các thành phần hoạt chất saponin, trong đó hai thành phần có hoạt tính kháng u mạnh là Rg3 và Rh1 có tác dụng trực tiếp ức chế sự phát triển của tế bào ung thư. Apoptosis - khả năng kích thích tế bào chết theo chương trình - được công nhận là một cơ chế thiết yếu ức chế sự phát triển của tế bào ung thư. Kết quả nghiên cứu cho thấy cao định lượng NP(H), là cao có hàm lượng saponin Rg3 và Rh1 cao, thể hiện rõ tác dụng cảm ứng, kích thích tế bào ung thư Sarcoma TG180 chết theo chương trình (bảng 3.14). Tác dụng apoptosis của cao định lượng NP(H) được đánh giá cả đối với apoptosis sớm (bảng 3.15) và apoptosis muộn (bảng 3.16). Tế bào apoptosis sớm là những tế bào mà sự chết được cảm ứng, khởi phát ở giai đoạn sớm của quá trình apoptosis, lúc này trong tế bào mọi hoạt động sống vẫn diễn ra [107]. Quá trình apoptosis giai đoạn sớm có những biến đổi của tế bào bao gồm thay đổi màng Plasma, thay đổi ty thể, hoạt hóa Caspases, chưa có sự phân mảnh DNA [108]. Tế bào apoptosis muộn là những tế bào mà quá trình apoptosis đã ở giai đoạn muộn, có những thay đổi đáng kể về hình thái xảy ra và một đặc trưng cơ bản là sự phân mảnh DNA trong nhân.

Những thay đổi trong màng sinh chất (màng Plasma) là một trong những đặc điểm sớm nhất của quá trình apoptosis. Khi đó, màng phospholipid, phosphatidylserine (PS) được chuyển vị trí từ trong ra ngoài của màng sinh chất, bộc lộ PS với môi trường tế bào bên ngoài. Annexin V là một protein liên kết phospholipid phụ thuộc Ca2+, có ái lực cao với PS và liên kết với các tế bào có PS bộc lộ ra ngoài. Trong nghiên cứu này, các tế bào apoptosis được nhận biết bằng sự dương tính với Annexin V (Annexin V-FITC+), một dấu hiệu cho thấy có sự biến đổi của màng sinh chất. Thay đổi ty thể, với dấu hiệu sớm của quá trình apoptosis qua trung gian ty thể là sự thay đổi điện thế màng ty thể, sau đó giải phóng các protein liên màng hòa tan khác nhau vào tế bào chất, như cytochrome C, AIF,

149

Smac/DIABLO và nhiều pro-caspases khác nhau [109]. Hoạt hóa Caspases là sự kích hoạt một loạt các protease tế bào, các caspase, phân cắt nhiều cơ chất protein, dẫn đến mất cấu trúc và chức năng tế bào, và cuối cùng dẫn đến chết tế bào. Đặc biệt, các caspase -3, -8 và -9 có liên quan đến quá trình apoptosis: caspase-9 trong con đường ty thể, caspase-8 trong con đường Fas/CD95, và caspase-3. Hoạt hoá Caspase-3 là dấu hiệu các tế bào đang trải qua quá trình apoptosis, caspase-3 là một protease quan trọng được kích hoạt trong giai đoạn đầu của quá trình apoptosis [110]. Mặc dù nghiên cứu này chưa đánh giá cụ thể đối với sự thay đổi ty thể và hoạt hóa Caspases, một số nghiên cứu trước đó đã báo cáo về cơ chế tác dụng theo các con đường này của Ginsenoside Rg3. Cụ thể, 20 (S) - ginsenoside Rg3 có thể gây ra apoptosis nội sinh, điều chỉnh sự biểu hiện của các protein proapoptotic Bcl- 2, làm giảm khả năng xuyên màng của ty thể, giải phóng CytC và tiếp theo là hoạt hóa caspase-9 [149]. Ginsenosides Rg3 cũng có thể gây ra quá trình apoptosis ngoại sinh của các tế bào khối u bằng cách điều chỉnh sự biểu hiện của p53, TRAIL-R1 (DR4), TRAIL-R2 (DR5), Fas và phối tử của nó (FasL) để kích hoạt Casp-8 [150]. Ginsenosides Rg3 và Rh1 còn được chứng minh có khả năng cảm ứng quá trình apoptosis tế bào theo một số cơ chế khác như: điều chỉnh sự biểu hiện của proto-oncogene Pim-3, thúc đẩy quá trình phosphoryl hóa yếu tố Bad [151]; làm giảm sự biểu hiện của Bcl-2 bằng cách bất hoạt các tín hiệu của kinase ERK/Akt điều hòa tín hiệu ngoại bào và ngăn chặn các tín hiệu của NF-κB [152]; ức chế con đường PI3K/Akt [155]...

Phân mảnh DNA là kết quả của việc kích hoạt các endonuclease, làm suy giảm cấu trúc nhiễm sắc bậc cao thành các đoạn có kích thước ~ 300 kb và sau đó thành các đoạn DNA nhỏ hơn khoảng 50 bp. Khi quá trình apoptosis đã ở giai đoạn muộn, DNA trong nhân bị phân mảnh sau sự cô đặc thể nhiễm sắc, các hoạt động sống của tế bào gần như đã dừng, màng tế bào lúc này không còn các phản ứng chọn lọc. Khi đó, ngoài dương tính với Annexin V (Annexin V-FITC+), tế bào còn

150

dương tính với thuốc nhuộm nhân 7- aminoactinomycin (7-AAD+), là thuốc nhuộm huỳnh quang có ái lực cao với DNA sợi kép, khi được kích thích bằng nguồn sáng thích hợp, tế bào chết biểu hiện cường độ huỳnh quang, dễ dàng nhận biết và đếm bằng phương pháp đo tế bào dòng chảy [111]. Cao định lượng NP(H) làm tăng tỷ lệ tế bào Appotosis muộn (bảng 3.16) được nhận biết thông qua dấu hiệu dương tính với thuốc nhuộm nhân 7- aminoactinomycin.

Ngoài cơ chế ức chế trực tiếp sự phát triển của tế bào ung thư thông qua tác dụng cảm ứng, kích thích tế bào chết theo chương trình, tác dụng kháng u của rễ củ tam thất có liên quan mật thiết với một số tác dụng quý của dược liệu này trên cơ thể sống, đặc biệt là tác dụng tăng cường miễn dịch và tác dụng chống oxy hóa.

Liệu pháp miễn dịch ung thư (Cancer imunotherapy, CI), là kỹ thuật kích thích hệ miễn dịch của cơ thể chống lại các tế bào ác tính, đang là biện pháp điều trị mở ra nhiều triển vọng. Thay vì nhắm trực tiếp để tiêu diệt tế bào ung thư, liệu pháp CI có thể tạo ra khả năng cho tế bào miễn dịch của cơ thể tấn công chống lại tế bào ung thư [19]. Nghiên cứu này, cao định lượng NP(H) bào chế từ rễ củ tam thất hấp đã được chứng minh có tác dụng rõ rệt làm tăng cường miễn dịch trên chuột mang khối u (tăng số lượng bạch cầu, hồi phục các chỉ số huyết học; tăng IL- 2 và TNF-α máu; tăng cân nặng lách, tuyến ức - mục 3.2.4). Các nghiên cứu của một số tác giả khác cũng cho thấy rễ củ tam thất ức chế sự phát triển của khối u thông qua cơ chế miễn dịch như kích hoạt đại thực bào thành phân cực M1 [74], điều hòa chức năng các tế bào ức chế miễn dịch dòng tủy trong vi môi trường khối u [75]...

Tác nhân gây ung thư có nhiều bản chất khác nhau nhưng hậu quả chung là chúng đều làm tăng các dạng oxy hoạt động (reactive oxygen species – ROS), gây stress oxy hóa [27]. Ở mặt ngươc lại, mức ROS cao lại gây độc tế bào, có thể thúc đẩy cũng như ngăn chặn sự tồn tại của các tế bào ung thư [33]. Do đó, cả hai chiến lược làm tăng ROS và loại bỏ ROS đã được phát triển để ứng dụng trong điều trị

ung thư [36]. Chiến lược làm tăng ROS trong điều trị ung thư thể hiện rõ trong hóa trị liệu và xạ trị liệu, và liên quan đến rất nhiều tác dụng phụ. Việc bổ sung chất chống oxy hóa giúp làm giảm bớt các độc tính từ những phương pháp điều trị ung thư như hóa trị, xạ trị hoặc phẫu thuật. Ngoài ra, nó cũng giúp ngăn ngừa quá trình oxy hóa trong cơ thể, từ đó ngăn chặn các gốc tự do tiếp tục làm tổn thương tới những tế bào khỏe mạnh khác trong cơ thể và giúp kìm hãm sự phát triển ồ ạt của khối u. Việc bổ sung chất chống oxy hóa trong quá trình hóa trị liệu được chứng minh tiềm năng vượt trội trong việc cải thiện độc tính, giúp hiệu quả điều trị cao hơn và tăng thời gian sống cho bệnh nhân [38]. Trong nghiên cứu này, cao định lượng NP(H) bào chế từ rễ củ tam thất hấp đã được chứng minh có tác dụng rõ rệt chống oxy hóa, làm giảm MDA (sản phẩm của quá trình oxy hóa), tăng các enzym chống oxy hóa (GSH, SOD và CAT), làm giảm tổn thương gan (một cơ quan quan trọng trong cơ thể nhưng rất dễ bị tổn thương trong stress oxy hóa). Tác dụng chống oxy hóa của tam thất giúp làm giảm độc tính, từ đó có thể nâng cao hiệu quả điều trị và thời gian sống của bệnh nhân ung thư. Khác với các chất chống oxy hóa thông thường có thể làm giảm mức độ gây độc của hóa trị liệu và xạ trị liệu lên tế bào ung thư, một số nghiên cứu đã chứng minh tam thất có tác dụng làm tăng độ nhạy cảm của tế bào ung thư với các liệu pháp hóa học hoặc bức xạ, do đó làm tăng giá trị và hứa hẹn hiệu quả điều trị của dược liệu quý này [174], [175], [176].

Tóm lại, nghiên cứu đã chứng minh được rễ củ tam thất thể hiện tác dụng kháng u thông qua cơ chế cảm ứng và kích thích apoptosis, gây ức chế sự phát triển của tế bào ung thư. Ngoài ra, tam thất cũng đã được chứng minh có các cơ chế bổ trợ như tăng cường miễn dịch, chống oxy hóa giúp làm tăng hiệu quả điều trị, giảm độc tính trên cơ thể mang khối u. Kết quả khối u trên cơ thể chuột bị ức chế sự phát triển, và chuột mang khối u có thời gian sống dài hơn.