Ảnh Hưởng Của Các Điều Kiện Hấp Nhiệt Đến Hàm Lượng Saponin Của Rễ Củ

Kết quả nghiên cứu của nhiều nhóm nghiên cứu cho thấy hàm lượng các saponin trong Tam thất phụ thuốc nhiều yếu tố, như độ tuổi, kích thước, vùng trồng, thời gian thu hái.

4.1.2. Hàm lượng saponin của Tam thất sau hấp

Kết quả định lượng các mẫu trong quá trình chế biến cho thấy hàm lượng các saponin của Tam thất biến đổi trong quá trình hấp. Cụ thể, các saponin chính trong Tam thất chưa chế biến là Rg1, Rb1 và Rd giảm dần. Trong khi đó hàm lượng các saponin mới như Rh1 và Rg3 tăng lên. Sự biến đổi này phù hợp với các nghiên cứu về ảnh hưởng của quá trình hấp đến sự biến đổi saponin của Tam thất đã được công bố [10],[63], [81], [147].

Sự biến đổi các saponin này xảy ra từ rất sớm, ngay từ khi bắt đầu quá trình hấp. Tại thời điểm 4 giờ từ khi bắt đầu hấp, hàm lượng Rg1, Re, Rb1 và Rd đã bắt đầu giảm. Thậm chí, đối với các mẫu được hấp ở 120°C, sau 4 giờ, Rg1 và Re đã giảm đến mức không phát hiện được. Hàm lượng Rg3 và Rh1 cũng tăng dần ngay từ khi bắt đầu hấp.

Sự biến đổi về thành phần saponin trong Tam thất có thể giải thích dựa trên cấu tạo của chúng.

Các hợp chất saponin của Tam thất có cấu trúc glycosid triterpenoid tetracyclic với nhóm glycosyl dễ bị thuỷ phân. Khi hấp, quá trình thủy phân của rhamnosyl tại C-6 của ginsenosid Re hình thành ginsenosid Rg1. Tương tự, notoginseng R1 bị thuỷ phân xylosyl tại vị trí C-6 cũng tạo thành Rg1. Hợp chất này bị thuỷ phân nhóm glucosyl tại vị trí C-20 để tạo thành Rh1, sau đó có thể tiếp tục bị loại nước tại vị trí C-20 để tạo thành Rh4 và Rk3. Quá trình biến đổi tương tự của các hợp chất Rb1, Rb2, Rc để hình thành Rd và Rg3 (hình 4.1).

Hình 4.1. Sơ đồ biến đổi một số saponin trong Tam thất

Có thể bạn quan tâm!

Xem toàn bộ 222 trang tài liệu này.

4.1.3. Ảnh hưởng của các điều kiện hấp nhiệt đến hàm lượng saponin của rễ củ Tam thất

Các saponin mới thu được sau hấp là Rh1 và Rg3, là những saponin thể hiện tác dụng kháng u thực nghiệm mạnh hơn các saponin cũ (khi chưa hấp) (bảng 3.12). Để thu được mẫu hấp có hàm lượng Rg3 và Rh1 cao nhất, chúng tôi xem xét 3 yếu tố: nhiệt độ, thời gian, loại mẫu hấp.

Ảnh hưởng của nhiệt độ hấp:

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy nhiệt độ có ảnh hưởng khá rõ rệt đến tốc độ biến đổi các saponin. Đối với mẫu hấp ở 100°C, sau 24 giờ, vẫn phát hiện được các saponin ban đầu như Rg1, Re hay Rd. Trong khi đó, đối với các mẫu hấp ở 120°C, sau 8 giờ hay thậm chí 4 giờ đã không thể phát hiện được Rg1, sau 12 giờ không phát hiện được hợp chất Rd. Tốc độ hình thành các sản phẩm mới như Rg3, Rh1 ở các mẫu Tam thất hấp ở 120°C cũng nhanh hơn rất nhiều ở các mẫu được hấp ở 100°C. Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu đã được công bố.

Ảnh hưởng của loại mẫu đem hấp:

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng 2 dạng nguyên liệu là củ Tam thất tươi và củ Tam thất đã được sấy khô để nghiên cứu ảnh hưởng của lượng nước trong nguyên liệu đến sự biến đổi saponin trong quá trình hấp. Kết quả cho thấy, ở giai đoạn đầu, các mẫu tươi có sự thay đổi về thành phần saponin nhanh hơn so với mẫu khô, ở cùng điều kiện nhiệt độ. Ví dụ như hợp chất Rg1 trong mẫu chưa chế biến có hàm lượng 4,52%, trong mẫu khô hấp ở 100°C trong 4 giờ là 4,51%, và ở mẫu tươi hấp ở 100°C trong 4 giờ chỉ còn 2,44%. Hoặc hàm lượng Rh1 tăng từ 0,03% ở mẫu chưa chế biến, lên 1,13% ở mẫu khô hấp 4 giờ ở 120°C, trong khi đó mẫu tươi hấp 4 giờ ở 120°C có hàm lượng saponin này là 1,45%. Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu khác đã được công bố. Nghiên cứu năm 2012 của Wang Dong và cộng sự cho thấy ở giai đoạn đầu của quá trình hấp, tốc độ giảm các saponin cũ và hình thành saponin mới ở các mẫu khô thấp hơn nhiều so với mẫu tươi ở cả 2 điều kiện nhiệt độ là 100°C và 120°C.

Tuy nhiên, ở giai đoạn sau của quá trình hấp, có sự khác biệt về hàm lượng các saponin mới ở mẫu tươi và mẫu khô ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau. Cụ thể, khi hấp ở 100°C, sau 24 giờ hấp, hàm lượng Rh1 và Rg3 cao hơn mẫu khô hấp ở điều kiện tương ứng (1,00% và 4,44% so với 0,58% và 9,02%). Trong khi đó, mẫu hấp ở 120°C, sau 24 giờ, mẫu tươi có hàm lượng Rh1 và Rg3 thấp hơn so với mẫu khô (0,37% và 7,52% so với 0,58% và 8,36%).

Kết quả này có thể do các hợp chất Rh1 và Rg3 ở mẫu tươi hấp ở 120°C đã tiếp tục bị biến đổi thành các saponin khác. Quá trình này được khẳng định rõ ràng hơn khi chúng ta phân tích sự biến đổi hàm lượng Rh1. Các mẫu được hấp ở điều kiện 100°C, hàm lượng Rh1 liên tục tăng trong suốt quá trình hấp, thậm chí sau 24 giờ hấp, hàm lượng Rh1 vẫn tiếp tục tăng. Trong khi đó, đối với các mẫu được hấp ở 120°C, Rh1 chỉ tăng lên trong giai đoạn đầu hấp, từ thời điểm 8 giờ trở về sau, hàm lượng saponin này giảm dần. Điều này gợi ý rằng có thể một quá trình tương tự đã diễn ra với hợp chất Rg3 ở mẫu tươi hấp ở 120°C. Cũng có thể, quá trình biến

đổi các saponin mới tạo thành diễn ra ở cả mẫu tươi và mẫu khô, và ở cả 2 mức nhiệt độ hấp. Tuy nhiên, có thể tốc độ biến đổi của 2 hợp chất này ở các mẫu được hấp ở 100°C thấp hơn tốc độ tạo thành nên hàm lượng của chúng vẫn tiếp tục tăng lên trong quá trình hấp. Như vậy, sử dụng mẫu khô để hấp hơi nóng sẽ thu được hàm lượng 2 saponin là Rg3 và Rh1 ổn định hơn và cao hơn mẫu tươi

Ảnh hưởng của thời gian hấp:

Theo thời gian hấp quá trình biến đổi hóa học xảy ra càng hoàn toàn. Như đã xác định 2 điều kiện tối ưu ở trên, chúng tôi chỉ xem xét kết quả định lượng saponin theo thời gian đối với mẫu khô hấp ở 1200C, trong khi Rg3 tăng dần trong quá trình hấp thì Rh1 chỉ tăng trong 8 giờ đầu và sau 12 giờ bắt đầu giảm xuống. Như vậy 8h là khoảng thời gian tối ưu.

Như vậy, để có được mẫu Tam thất có hàm lượng Rh1 và Rg3 cao nhất, chúng tôi lựa chọn phương pháp hấp mẫu khô ở 120°C trong 8 giờ. Đây cũng là phương pháp chế biến với thời gian hấp không quá dài, có thể dễ dàng áp dụng để chế biến lượng mẫu lớn hơn cho nghiên cứu phát triển sản phẩm cũng như trong sử dụng.

4.2. Về tác dụng kháng u thực nghiệm của các dạng cao định lượng và một số saponin phân lập từ rễ củ Tam thất.

4.2.1. Về tác dụng kháng u của 6 saponin đã phân lập và cao định lượng NP(O), NP(H) trên một số dòng tế bào ung thư người

Tác dụng kháng u thực nghiệm trong nghiên cứu của chúng tôi được thực hiện theo từng bước. Bước đầu tiên là đánh giá tác dụng ức chế 06 dòng tế bào ung thư người của 6 saponin đã phân lập dược liệu Tam thất hấp và Tam thất không hấp và 2 cao định lượng NP(O), NP(H). Sáu dòng tế bào ung thư người được đánh giá bao gồm tế bào ung thư vú MCF7, tế bào ung thư gan HepG2, tế bào ung thư đại trực tràng HT29, tế bào ung thư cơ vân RD, tế bào ung thư phổi SK-LU-1 và tế bào ung thư phổi A549. Tế bào SK-LU-1 là tế bào ung thư biểu mô tuyến phổi có nguồn gốc từ phụ nữ, tế bào A549 là tế bào ung thư biểu mô tuyến phổi có nguồn gốc từ đàn ông. Với 06 dòng tế bào ung thư người đã sử dụng trong nghiên cứu cho

132

phép đánh giá tác dụng kháng u của mẫu thử trên các loại ung thư với những đặc điểm mô bệnh học và sinh lý bệnh khác nhau, và cũng là những ung thư thường gặp với tỷ lệ cao hiện nay. Việc đánh giá tác dụngkháng u trên các tế bào ung thư người cho phép suy diễn kết quả của mẫu thử trên lâm sàng chính xác hơn.

Kết quả nghiên cứu cho thấy 2 Ginsenoside Rg3 và Rh1 (thu được từ Tam thất đã xử lý hấp qua hơi nóng ở 120 độ C trong vòng 8 giờ) có hoạt tính kháng các dòng tế bào ung thư mạnh hơn so với 4 Ginsenoside Rb1, Rd, Re và Rg1 (thu được từ Tam thất không xử lý hấp) khi được thử trên 6 dòng tế bào ung thư trong cùng điều kiện (bảng 3.12). Kết quả nghiên cứu hoàn toàn phù hợp với báo cáo của một số tác giả về tác dụng kháng u của Rg3 và Rh1 trên nhiều loại ung thư khác nhau. Ginsenoside Rg3 có tác dụng điều chỉnh chu kỳ tế bào khối u, cụ thể là điều chỉnh sự biểu hiện của đột biến mất điều hòa giãn mạch (ataxia telangiectasia mutation - ATM), p53, p27, p21, p15, pRb2/p130, và hoạt động phiên mã của E2F1 trong giai đoạn điều chỉnh của các protein liên quan đến chu kỳ tế bào đối với một số khối u như ung thư vú, ung thư dạ dày, ung thư phổi và ung thư tuyến tiền liệt [148]. Ginsenoside Rg3 có thể điều chỉnh quá trình apoptosis của tế bào khối u. Cụ thể, 20

(S) - ginsenoside Rg3 có thể gây ra apoptosis nội sinh, điều chỉnh sự biểu hiện của các protein pro-apoptotic Bcl-2, làm giảm khả năng xuyên màng của ty thể, giải phóng CytC và tiếp theo là hoạt hóa caspase-9 [149]. Ginsenosides Rg3 cũng có thể gây ra quá trình apoptosis ngoại sinh của các tế bào khối u bằng cách điều chỉnh sự biểu hiện của p53, TRAIL-R1 (DR4), TRAIL-R2 (DR5), Fas và phối tử của nó (FasL) để kích hoạt Casp-8 [150]. Hai con đường trên có thể kích hoạt các phân tử Casp-3 và 7 và phân hủy PARP, dẫn đến quá trình apoptosis của các tế bào khối u. Ginsenoside Rg3 cũng gây ra quá trình apoptosis của tế bào khối u thông qua hai con đường khác. Đầu tiên là ginsenoside Rg3 điều chỉnh sự biểu hiện của proto- oncogene Pim-3, chất này phosphoryl hóa nhiều cơ chất cụ thể trong tế bào ung thư tuyến tụy để thúc đẩy quá trình phosphoryl hóa yếu tố Bad [151]. Thứ hai là ginsenoside Rg3 làm giảm sự biểu hiện của Bcl-2 trong các tế bào ung thư vú bằng cách bất hoạt các tín hiệu của kinase ERK/Akt điều hòa tín hiệu ngoại bào và ngăn chặn các tín hiệu của NF-κB [152]. Thứ ba là Ginsenoside Rg3 còn được chứng

133

minh gây tác dụng lên tế bào gốc khối u, ngăn chặn sự phát triển của tế bào ung thư đại trực tràng (CRC) cả in vitro và in vivo [153]. Ginsenoside Rh1 ức chế sự tăng sinh, di chuyển và xâm nhập của các tế bào ung thư đại trực tràng trong thử nghiệm in vitro và sự phát triển của khối u trong cơ thể sống. Sự ức chế này ít nhất một phần do sự ức chế biểu hiện MMP1 và MMP3, sự gia tăng mức độ biểu hiện TIMP3 và sự bất hoạt đường truyền tín hiệu MAPK [154]. Rh1 tạo ra tác dụng chống ung thư tiềm năng trên các tế bào ung thư vú bằng cách gây ra quá trình bắt giữ chu kỳ tế bào, quá trình apoptosis và autophagy thông qua ức chế con đường PI3K/Akt [155]. Ginsenoside Rh1 ức chế sự phát triển khối u,ngăn chặn sự di cư và xâm lấn của các tế bào ung thư vú MDA-MB-231 [156], [157].

Kết quả thử nghiệm với 2 cao định lượng NP(H) và NP(O) cho thấy cao định lượng NP(H) có hoạt tính ức chế sự phát triển của 5 dòng tế bào ung thư là HT29, HepG2, MCF7, SK LU1 và A549 đã thử với giá trị IC50 từ 7,03 đến 9,11 µg/ml, còn NP(O) có giá trị IC50>10 µg/ml với cả 6 dòng tế bào ung thư đã được thử (bảng 3.12). Kết quả này là hoàn toàn phù hợp do cao định lượng NP(H) được chiết xuất từ Tam thất hấp, khi các ginsenosideRg1, Re, Rb1 và Rd trong Tam thất chưa hấp được chuyển hóa thành cácginsenoside Rg3 và ginsenoside Rh1 với tác dụng kháng u tốt hơn (bảng 3.11).

4.2.2. Về kết quả đánh giá khả năng kích thích chết tế bào theo chương trình (apoptosis) của cao định lượng NP(H) trên dòng tế bào ung thư mô liên kết chuột sarcoma TG180.

Sau khi sàng lọc tác dụng ức chế sự tăng sinhtrên 6 dòng tế bào ung thư người của 6 saponin đã phân lập và cao định lượng NP(O), NP(H), nghiên cứu này đã xác định được Tam thất hấp với các ginsenoside Rg3 và ginsenoside Rh1 cũng như cao định lượng NP(H) chiết xuất từ Tam thất hấp có tác dụng ức chế tốt sự phát triển của các dòng tế bào ung thư thử nghiệm. Từ kết quả này, chúng tôi định hướng nghiên cứu vào cao định lượng NP(H), với triển vọng ứng dụng thực tiễn về tác dụng kháng u của cao định lượng này. Khác với các hoạt chất hóa tổng hợp, các

134

cao chiết từ dược liệu thường có nhiều thành phần hóa học và có nhiều tác dụng khác nhau. Ngoài tác dụng ức chế tăng sinh tế bào ung thư, Tam thất hấp đã được chứng minh có tác dụng bổ máu, tăng cưỡng miễn dịch, chống oxy hóa đều có vai trò quan trọng trong dự phòng và điều trị ung thư [81], [82], [84]. Các mô hình chuột mang khối u tế bào ung thư của người trên chuột suy giảm miễn dịch mặc dù cho kết quả sát với thực tế lâm sàng hơn so với mô hình chuột mang khối u tế bào ung thư của chuột, tuy nhiên khó đánh giá về tác dụng tăng cường miễn dịch là tác dụng mà Tam thất hấp được mong chờ với tác dụng bổ máu, tăng miễn dịch đóng vai trò quan trọng trong điều trị ung thư. Với định hướng đánh giá tác dụng của cao định lượng NP(H) trên chuột mang khối u tế bào ung thư mô liên kết chuột sarcoma TG180, chúng tôi tiến hành bước tiếp theo là đánh giá tác dụng trên invitrocủa cao định lượng NP(H), cụ thể là tác dụng kích thích chết tế bào theo chương trình (apoptosis) trên dòng tế bào ung thư mô liên kết chuột sarcoma TG180. Apoptosis được biết đến như là cách thức mà tế bào tự chết theo chương trình, đảm bảo sự cân bằng của cơ thể trong quá trình phát triển, chống lại quá trình sinh ung thư [107]. Việc tìm kiếm các tác nhân mới có khả năng nhắm đích vào các con đường tín hiệu apoptosis luôn được quan tâm trong việc phát triển các liệu pháp chống ung thư hiện nay [158]. Hiệu quả kháng ung thư của nhiều loại thảo dược khác nhau đã được nghiên cứu thông qua khả năng cảm ứng quá trình apoptosis tế bào, cho thấy nhiều loại thảo dược có khả năng can thiệp vào sự điều hòa chu kỳ của tế bào, đưa những tế bào ung thư mất kiểm soát phân chia vào chu trình chết apoptosis [159]. Các ginsenoside Rg3 và Rh1 cũng đã được chứng minh có khả năng cảm ứng quá trình apoptosis tế bào [149], [150], [155]. Kết quả nghiên cứu cho thấy cao định lượng NP(H) làm tăng tỷ lệ tế bào apoptosis sớm, apoptosis muộn và apoptosis tổng số (bảng 3.14-3.16). Kết quả này là hoàn toàn phù hợp với các kết quả nghiên cứu nêu trên về khả năng cảm ứng quá trình apoptosis tế bào của các ginsenoside Rg3 và Rh1.

135

4.2.3. Về kết quả nghiên cứu tác dụng kháng u của các cao định lượng NP(H) và NP(O) trên chuột nhắt trắng mang khối u rắn sarcoma TG 180.

Với kết quả nghiên cứu cho thấy tác dụng tốt của cao định lượng NP(H) trên quá trình apoptosis tế bào ung thư mô liên kết chuột sarcoma TG180, chúng tôi tiến hành nghiên cứu tác dụng kháng u của cao định lượng NP(H) trên chuột nhắt trắng dòng Swissmang khối u rắn sarcoma TG 180, có so sánh với cao định lượng NP(O) và thuốc tham chiếu Lentinan.

4.2.3.1. Về mô hình nghiên cứu

Dòng tế bào ung thư Sarcoma TG180 là dòng tế bào chuẩn đã được nhiều viện nghiên cứu ung thư trên thế giới sử dụng do tế bào này có thể sống trong dịch ổ bụng, mô liên kết, dễ xác định đặc tính di truyền và nhạy cảm với các trị liệu chống ung thư. Dòng tế bào này do ATCC lưu trữ , được bảo quản trong nitơ lỏng ở -198oC, sau đó được rã đông rồi nuôi in vitro trong môi trường RPMI, bổ sung 10% FBS. Tế bào sarcoma TG 180 trong môi trường nuôi cấy ở dạng trôi nổi, có dạng hình cầu, khi đạt được số lượng trên 100 triệu tế bào mỗi đợt nuôi cấy sẽ được lưu trữ làm tế bào giống gốc và cấy ghép để gây u cho chuột thí nghiệm. Dòng tế bào này có thể được tiêm vào khoang bụng chuột để gây u báng hoặc tiêm vào cơ đùi, dưới da để gây u rắn. Với mô hình gây u báng, dòng tế bào ung thư phát triển rất nhanh nên phù hợp với nghiên cứu động học nhưng lại làm cho đời sống động vật (thời gian sống thêm) khá ngắn [160]. Với mô hình gây u rắn, chuột sau gây u sống thời gian dài hơn, khối u rắn phát triển dưới da thích hợp với nghiên cứu hình thái và chức năng u [161]. Mặt khác, mô hình chuột nhắt trắng mang khối u rắn sarcoma TG 180 là mô hình được tiến hành trên chuột nhắt trắng không gây suy giảm miễn dịch, do đó các đáp ứng của cơ thể sinh học với diễn biến bệnh lý của khối u, và với các thuốc tác dụng làm tăng miễn dịch, chống oxy hóa...được đánh giá chính xác và thuận tiện hơn so với mô hình gây khối u trên chuột suy giảm miễn dịch. Với tỷ lệ gây u thành công cao (khoảng 98%), chuột sau gây u sống thời gian

136