2.3.2. Phương pháp gây chuột nhắt ĐTĐ type 2
Trong nghiên cứu này chúng tôi đã áp dụng mô hình gây chuột nhắt ĐTĐ type 2 bằng cách nuôi chuột với chế độ ăn giàu chất béo kết hợp với tiêm STZ với liều 120 mg/kg của Sawant và cộng sự [137].
2.3.2.1. Nuôi chuột nhắt béo bằng chế độ ăn giàu chất béo (HFD-high fat diet) Chuột được nuôi ở điều kiện bình thường (12 giờ tối, 12 giờ sáng, nhiệt độ 28- 30°C), trong các lồng riêng để tránh lây nhiễm chéo. Chuột được chia thành 2 nhóm là nhóm ăn thường (ND - normal diet) được cho ăn thức ăn tiêu chuẩn (6% chất béo) cung cấp bởi cơ sở chăn nuôi Suối Dầu - Viện Vắc xin và Sinh phẩm y tế Nha Trang và nhóm ăn thức ăn giàu chất béo (35% chất béo) được tính theo bảng thành phần dinh dưỡng thực phẩm Việt Nam của Viện Dinh Dưỡng [22] gọi là nhóm nuôi béo (HFD - high fat diet). Các nhóm chuột được nuôi trong 8 tuần. Tại thời điểm 0 giờ và
8 tuần, tiến hành cân chuột để theo dòi sự tăng trọng của cơ thể.
Bảng 2.3. Thành phần dinh dưỡng trong khẩu phần ăn của chuột thí nghiệm
Carbohydrat | Protein | Chất béo | Các thành phần khác | |
Chuột ăn thường (ND) | 60% | 20% | 6% | 14% |
Chuột ăn béo (NFD) | 34% | 20% | 35% | 11% |
Có thể bạn quan tâm!
-
Các Hợp Chất Có Khả Năng Chống Viêm Hoặc Cải Thiện Tính Kháng Insulin -
Tình Hình Nghiên Cứu Về Thảo Dược Trong Điều Trị Đtđ Tại Việt Nam -
Các Loại Thực Vật (20 Loài) Được Thu Nhận Tại Miền Trung Việt Nam -
Chuẩn Bị Cao Hỗn Hợp Các Thảo Dược Có Khả Năng Hạ Đường Huyết -
Sự Khác Biệt Về Các Chỉ Số Mỡ Máu Chuột Ở Nhóm Nd Và Hfd -
Đường Huyết Của Chuột Đtđ Type 2 Sau 21 Ngày Điều Trị Bằng Cao Chiết Thực Vật
Xem toàn bộ 205 trang tài liệu này.
A: Nguyên liệu thức ăn chuột béo (1. Bột bắp; 2. Bột cá; 3. Mỡ heo; 4. Thức ăn tiêu chuẩn); B: Thành phẩm thức ăn của chuột béo
Hình 2.4. Nguyên liệu và thành phẩm thức ăn chuột béo
2.3.2.2. Xác định chỉ số hóa sinh
a. Cholesterol
Tiến hành theo phương pháp của Deeg và Zlegenhorn trên máy xét nghiệm hóa sinh máu bán tự động [65].
- Nguyên tắc:
Cholesterol este
Cholesterol esterase
→ Cholesterol + Acid béo (1)
Cholesterol oxidase
Cholesterol + O2 → Cholesten-3-on + H2O2 (2)
Hydroperoxidase
2H2O2 + 4-aminoantipyrine + pHB → Quinoneimin + 2H2O (3)
Cholesterol ester huyết thanh được thủy phân bởi Cholesterol esterase. Cholesterol tự do tạo ra sẽ bị oxy hóa bởi cholesterol oxidase để tạo thành cholest-4- en-3 one và hydrogen peroxidase (H2O2). H2O2 sẽ kết hợp với 4-aminoantipyrin và phenol với sự hiện diện của peroxidase để tạo thành chất quinoneimin. Cường độ màu đậm nhạt của quinoneimin có màu đỏ tỷ lệ thuận với nồng độ cholesterol toàn phần trong mẫu thử và được đo bằng máy đo quang phổ ở bước sóng 520 nm.
b. Triglyceride
- Nguyên tắc:
Triglyceride
Lipase
→ Glycerol + Acid béo (1)
Glycerol
Glycerol kinase
→ Glycerol 1 phosphate + ADP (2)
G 1 P oxidase
Glycerol 1 phosphate + O2→ Dihydroxyaceton phosphate + H2O2 (3)
Hydroperoxidase
H2O2 + 4-aminoantipyrine + pHBS → Quinoneimin + 2H2O (4)
Các xét nghiệm hóa sinh được tiến hành tại Trung tâm xét nghiệm Y khoa Phong Châu, TP. Huế.
2.3.2.3. Gây chuột nhắt ĐTĐ type 2 thực nghiệm
Để tạo chuột ĐTĐ type 2, các con chuột bị nhịn đói khoảng 12-14 giờ, sau đó tiến hành thí nghiệm theo như bố trí trên bảng 2.4.
Bảng 2.4. Bố trí thí nghiệm gây chuột ĐTĐ type 2
Tiêm hóa chất | Liều tiêm | Kết quả thí nghiệm | |
HFD | STZ (pha trong đệm citrate 0,01M; pH 4,3) | 120 mg/kg | HFD + STZ |
HFD | Đệm citrate 0,01M; pH 4,3 | 10 ml/kg | HFD + đệm |
ND | STZ (pha trong đệm citrate 0,01M; pH 4,3) | 120 mg/kg | ND + STZ |
ND | Đệm citrate 0,01M; pH 4,3 | 10 ml/kg | ND + đệm |
Sau khi tiến hành tiêm STZ, các con chuột tiếp tục được nuôi bằng chế độ ăn như ban đầu. Đo nồng độ đường huyết lúc đói tại 0 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 7 ngày, 10 ngày. Sau 10 ngày lấy máu định lượng nồng độ đường huyết và insulin.
2.3.2.4. Định lượng đường huyết
Định lượng đường huyết bằng kỹ thuật enzyme, glucose bị oxy hóa nhờ xúc tác của các enzyme có trên bề mặt của vùng phản ứng giấy thử và đọc kết quả trên máy.
Nguyên lý: Oxy hóa glucose thành acid gluconic theo phản ứng (1)
𝐺𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑒 𝑜𝑥𝑖𝑑𝑎𝑠𝑒
Glucose + H2O + O2 → Acid gluconic + H2O2 (1)
H2O2 tạo thành bị peroxidase phân hủy, giải phóng oxy, oxy hóa o-dianisidin để tạo thành phức chất có màu vàng nâu theo phản ứng (2).
Peroxidase
O-Dianisidin + H2O2 → Phức hợp vàng nâu + H2O (2)
Cường độ màu được xác định bằng phương pháp đo quang tương ứng với lượng glucose cần định lượng. Máu để định lượng glucose là máu toàn phần lấy từ tĩnh mạch đuôi chuột sau khi đã bỏ đi giọt máu đầu tiên.
2.3.2.5. Nghiệm pháp dung nạp glucose
Vào ngày thứ 10 sau khi tiêm STZ, chuột được chia làm 4 nhóm để nghiên cứu khả năng dung nạp glucose.
Nhóm 1: HFD+STZ
Nhóm 2: HFD+đệm
Nhóm 3: ND+STZ
Nhóm 4: ND+đệm
Chuột bị nhịn đói 12 tiếng trước khi thí nghiệm. Cho tất cả các con chuột uống glucose với liều 5 g/kg cân nặng, pha trong dung dịch nồng độ 20%. Định lượng đường huyết tại các thời điểm 0 giờ, 1 giờ, 2 giờ sau khi cho uống dung dịch glucose [137].
2.3.2.6. Định lượng insulin máu chuột bằng kỹ thuật ELISA
* Nguyên tắc: Insulin trong mẫu thử phản ứng với kháng thể kháng insulin liên kết với enzym peroxidase và kháng thể kháng insulin cố định trên giếng phản ứng. Sau khi rửa các giếng với dung dịch đệm rửa (PBS - Tween 20) để loại bỏ các kháng thể không gắn, phát hiện các kháng thể gắn bằng phản ứng với 3,3’,5,5’- tetramethylbenzidin. Dừng phản ứng bằng dung dịch acid sulfuric 1 N, đo màu ở bước sóng 450 nm và 550 nm
Hình 2.5. Tóm tắt quy trình định lượng insulin
1.4
1.2
1.0
y = 0.042x + 0.0024 R² = 0.9942
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
0
50
100
150
200
250
300
350
Nồng độ insulin chuẩn (μIU/ml)
OD
* Cách tiến hành: Tất cả 4 lô chuột được lấy máu đuôi, sau đó cho vào các ống eppendorf, đem mẫu ly tâm để thu huyết tương làm xét nghiệm định lượng insulin bằng phản ứng ELISA. Đo mật độ quang của insulin chuẩn ở các nồng độ 300; 150; 75; 37,50; 18,75; 9,38; 4,69 và 0,00 µIU/ml. Từ kết quả đo mật độ quang của insulin chuẩn tại bước sóng 550 nm, xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính để xác định nồng độ insulin trong huyết tương của chuột thể hiện ở hình 2.6.
Hình 2.6. Đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa mật độ quang và nồng độ insulin
2.3.3. Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của 20 mẫu thực vật trên chuột nhắt ĐTĐ type 2
Tiến hành: Với kết quả xây dựng thành công mô hình chuột ĐTĐ type 2, chúng tôi tiến hành nghiên cứu khả năng hạ đường huyết của 20 cao chiết các mẫu thực vật. Những con chuột được xác định là bị ĐTĐ type 2 được phân thành các lô riêng biệt, mỗi lô gồm 7 con chuột ĐTĐ được cho uống cao chiết với liều 500 mg/kg thể trọng (cao chiết được hòa trong nước cất) hoặc uống nước cất (10 ml/kg) trong vòng 21 ngày. Thí nghiệm được chia thành 4 đợt cụ thể và được bố trí theo bảng 2.5.
Bảng 2.5. Bố trí thí nghiệm nghiên cứu tác dụng của hạ đường huyết của 20 mẫu thực vật
Lô chuột | Thí nghiệm trên chuột | Đợt | Lô chuột | Thí nghiệm trên chuột | |
I | 1 | Đối chứng (10 ml/kg) | II | 1 | Đối chứng (10 ml/kg) |
2 | Chè dây | 2 | Lá đu đủ | ||
3 | Chuối hột | 3 | Hạt đu đủ | ||
4 | Tầm bóp | 4 | Ké đầu ngựa | ||
5 | Lá nếp | 5 | Nở ngày đất | ||
6 | Chè vằng | 6 | Quả sung | ||
III | 1 | Đối chứng (10 ml/kg) | IV | 1 | Đối chứng (10 ml/kg) |
2 | Dây thìa canh | 2 | Lá đắng | ||
3 | Cỏ ngọt | 3 | Giảo cổ lam | ||
4 | Quế | 4 | Lược vàng | ||
5 | Râu bắp | 5 | Lá sen | ||
6 | Húng quế | 6 | Lá sa kê |
Chuột được uống cao chiết vào buổi sáng hằng ngày và đo nồng độ đường huyết vào các thời điểm 0 giờ và 21 ngày. Trong 21 ngày thí nghiệm chuột vẫn được cho ăn chế độ ăn béo như ban đầu.
2.3.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của cao chiết thực vật lên cấu trúc mô tụy và gan chuột ĐTĐ type 2
Bệnh phẩm tươi có bề dày 3 mm bảo quản trong formol sau đó được cố định bằng dung dịch Bouin, chuyển đúc trong parafin, tiếp tục được cắt thành những tiêu bản có bề dày 3 µm và nhuộm theo phương pháp hematoxylin-eosin (HE) thường quy. Nhân tế bào bắt màu xanh đen, bào tương bắt màu hồng. Các tiêu bản được đọc dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần để đánh giá tổn thương với phương pháp mù đơn (người đọc không biết ký hiệu của các lô chuột thực nghiệm). Kỹ thuật vi thể được thực hiện tại bộ môn Mô phôi trường ĐH Y Huế.
2.3.5. Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của cao chiết phân đoạn mẫu lá chè dây, lá đắng trên chuột nhắt ĐTĐ type 2
Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của các cao chiết phân đoạn CHe, CEtOAC, CBuOH các mẫu lá chè dây và lá đắng. Chuột ĐTĐ type 2 được chia thành 7 lô và mỗi lô gồm 7 con chuột. Cho chuột uống cao chiết các phân đoạn với liều 500 mg/kg/ngày. Bố trí thí nghiệm được trình bày ở bảng 2.6.
Bảng 2.6. Bố trí thí nghiệm nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của cao chiết phân đoạn chè dây và lá đắng
Cao chiết cho chuột uống | Lô | Cao chiết cho chuột uống | |
1 | Đối chứng (10 ml/kg.) | 5 | CHe lá đắng |
2 | CHe chè dây | 6 | CEtOAC lá đắng |
3 | CEtOAC chè dây | 7 | CBuOH lá đắng |
4 | CBuOH chè dây |
Chuột được uống vào buổi sáng hằng ngày và đo nồng độ đường huyết
vào các thời điểm 0 giờ, 3 ngày, 7 ngày, 14 ngày và 21 ngày.
2.3.6. Phương pháp khảo sát khả năng giảm hoạt tính enzyme α-glucosidase và α-amylase của các hợp chất phân lập
2.3.6.1. Nghiên cứu khả năng làm giảm hoạt tính enzyme α-glucosidase
Dựa trên nguyên tắc khả năng ức chế phản ứng thủy phân cơ chất p-nitrophenyl α-D-glucopyranosid (p-NPG) của enzym α-glucosidase sinh ra α-D-glucose và p- nitrophenol (PNP) [133].
Tiến hành: Hỗn hợp phản ứng về khả năng ức chế enzyme α-glucosidase gồm có: các mẫu thử ( hòa tan trong dung môi DMSO) và acarbose được pha với các nồng độ khác nhau lần lượt là 5, 10, 25, 50, 100 μM. Hỗn hợp gồm có: 20 μl α-glucosidase (0,4 U/ml), 110 μl dung dịch đệm phosphate 0,1 M (pH=6,9), 20 μl mẫu thử ở các nồng độ như trên được ủ trong 15 phút ở 37°C. Cho tiếp 20 μl cơ chất p-NPG sau đó ủ tiếp 15 phút ở 37°C. Kết thúc phản ứng bằng 80 μl Natri cacbonat 0,2 M. Sau đó hỗn hợp phản ứng được đo mật độ quang ở bước sóng 405 nm [118]. Hoạt tính ức chế được tính bằng phần trăm ức chế theo công thức sau:
% Ứ𝑐 𝑐ℎế = (Đối chứng dương − Đối chứng âm) − (𝑀ẫ𝑢 𝑑ươ𝑛𝑔 − 𝑀ẫ𝑢 𝑡𝑟ắ𝑛𝑔) ∗ 100
(Đố𝑖 𝑐ℎứ𝑛𝑔 𝑑ươ𝑛𝑔 − Đố𝑖 𝑐ℎứ𝑛𝑔 â𝑚)
- Đối chứng dương: Đệm + enzyme + cơ chất + kit
- Đối chứng âm: Đệm + đệm + cơ chất + kit
- Mẫu dương: Mẫu + enzyme + cơ chất + kit
- Mẫu trắng: Mẫu + đệm + cơ chất + kit
Mỗi thử nghiệm được thực hiện trong ba lần. Phần trăm ức chế và giá trị IC50 được xác định. Mẫu đối chứng dương được thực hiện bằng thuốc acarbose.
2.3.6.2. Nghiên cứu khả năng làm giảm hoạt tính enzyme α-amylase
Phản ứng ức chế sự thủy phân tinh bột của enzyme α-amylase bởi các mẫu thử được thực hiện theo phương pháp của Manaharan [103] có hiệu chỉnh. Enzyme α- amylase (Sigma Type IV-B) được hòa tan trong nước cất để cho nồng độ 2 U/ml. Các hợp chất thử nghiệm đã được hòa tan với DMSO (10%) và được hòa tan thêm trong dung dịch đệm photphat 20 mM ở pH 6,9. Thuốc thử là dung dịch chứa 30 g natri kali tartrate tetrahydrat trong 100 ml dung dịch NaOH 2 M và 1 g 3,5-dinitrosalicylic acid (DNSA). Hỗn hợp phản ứng gồm có: 80 μl mẫu thử ở các nồng độ khác nhau, 40 μl α-amylase được thêm vào và ủ trong 10 phút ở 37°C. Sau đó, 40 μl dung dịch tinh bột (1%) được thêm vào và ủ trong 10 phút. Dừng phản ứng bằng cách thêm thuốc thử 80 μl DNSA và dung dịch phản ứng được ủ trong bể nước 85-90°C trong 10 phút. Hỗn hợp phản ứng được làm lạnh và hoạt tính của α-amylase được xác định bằng cách đo độ hấp thụ của hỗn hợp ở bước sóng 540 nm bằng máy Multiskan Sky. Tất cả các phép đo đều được thực hiện trong ba lần. Mẫu đối chứng dương được thực hiện bằng thuốc acarbose.
2.3.7. Phương pháp đánh giá hoạt động chống viêm và cải thiện tính kháng
insulin của các hợp chất tinh sạch dựa trên dòng tế bào Raw 264.7 và 3T3-L1
2.3.7.1. Quy trình nuôi hoạt hóa tế bào [48]
Tế bào Raw 264.7, 3T3-L1 được lấy từ tủ đông. Sau đó, tế bào được phân chia từ 5 đến 7 ngày trong môi trường DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) đã được bổ sung cùng với 10% FBS, 1 mM sodium pyruvate, 50 U/ml penicinin, 50 μg streptomycin, và 5 x 10-5 M 2-mercaptoethanol. 105 tế bào được chia vào đĩa 96 giếng,