Chuẩn Bị Cao Hỗn Hợp Các Thảo Dược Có Khả Năng Hạ Đường Huyết

ủ qua đêm và thay bằng môi trường không có huyết thanh vào sáng hôm sau. Riêng đối với tế bào 3T3-L1 sau khi được hoạt hóa 2 ngày sẽ được bổ sung 0,5 mmol/l 3-isobutyl-1-metylxanthine (IBMX), 0,5 μg/ml dexamethasone, 5 μg/ml insulin và 10% huyết thanh trong 3 ngày. Sau đó thay môi trường DMEM bổ sung 10% huyết thanh từ 7–14 ngày.

2.3.7.2. Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của các hợp chất tinh sạch tới khả năng sống của dòng tế bào Raw 264.7 và 3T3-L1

Ảnh hưởng của các hợp chất tinh sạch tới khả năng sống của tế bào được đánh giá bằng sử dụng kít đếm tế bào (CellTiter 96 R Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay). RAW 264.7, 3T3-L1 được ủ cùng các hợp chất phân lập từ chè dây và lá đắng với dải nồng độ nhất định sau 48 giờ. Sau quá trình này, 10 μl của dung dịch kít được đưa vào các tế bào đã được ủ cùng với các hợp chất này trong 1 giờ. Khả năng hấp thụ của các mẫu này sẽ được đo ở bước sóng 450 nm bằng máy đọc ELISA.

2.3.7.3. Phương pháp thử hoạt tính kháng viêm [27], [48]

a. Phương pháp nuôi cấy tế bào và xử lý mẫu

Tế bào đại thực bào RAW 264.7 được nuôi cấy trong môi trường DMEM với thành phần kèm theo gồm 2 mM L-glutamine, 10 mM HEPES và 1,0 mM sodium pyruvate, ngoài ra bổ sung 10% fetal bovine serum – FBS (GIBCO) và nuôi trong tủ ấm CO2 ở điều kiện 37oC, 5% CO2. Thêm vào các giếng thí nghiệm của đĩa 96 giếng với lượng tế bào phù hợp (trong 190 μl môi trường) và ủ ở 37°C qua đêm cho tế bào ổn định. Chất thử (10 µl) pha trong DMSO 10% được đưa vào các giếng ở các nồng độ khác nhau. Một khay 96 giếng khác không có chất thử nhưng có tế bào (190 µl) và 10 µl DMSO sẽ được sử dụng làm đối chứng âm. Sau 2 giờ thêm LPS với nồng độ 1 µg/ml vào tất cả các giếng thí nghiệm. Sau 24 giờ, thu dịch nổi nuôi tế bào đã được thử chất để xác định sự có mặt của IL-6, IL-8, IL-10, TNF-α có trong môi trường nuôi cấy.

b. Phương pháp xác định IL- 6, IL-8, IL-10, TNF-α

Được thực hiện dựa trên IL-6, IL-8, IL-10 mouse ELISA Kit và TNF-α mouse

ELISA Kit (Promega) theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất. Thêm 100 µl hợp chất tinh sạch (môi trường nuôi cấy) vào các giếng thí nghiệm và 100 µl dung môi làm đối chứng âm. Ủ bản ở 37°C trong 90 phút. Loại bỏ dịch nổi và thêm 100 µl kháng thể IL-6/TNF-α gắn biotin vào các giếng thí nghiệm. Ủ bản ở 37°C trong 60 phút. Rửa bản 5 lần bằng PBS 0,01 M, thêm 100 µl Avidin-Biotin-Peroxidase Complex vào các giếng thí nghiệm. Ủ bản ở 37°C trong 30 phút. Rửa bản 5 lần bằng PBS 0,01 M, thêm 90 µl cơ chất TMB vào các giếng thí nghiệm. Ủ bản ở 37°C, tránh ánh sáng trong 20-25 phút. Dừng phản ứng bằng 100 µl stop solution. Đọc kết quả ở bước sóng 450 nm.

2.3.7.4. Phương pháp đánh giá khả năng ức chế kháng insulin trên tế bào [48]

Để hoạt hóa insulin bị bất hoạt, 3T3-L1 được xử lý cùng 50 ng/ml TNF-α trong 24 giờ. Sau đó, các tế bào được rửa bằng đệm (PBS) và đưa các nồng độ khác nhau của các hợp chất tinh sạch ủ trong 24 giờ. Hỗn hợp phản ứng được rửa bằng PBS và ủ với DMEM trong 3 h. Sau đó thêm 1 mg/ml bovine serum albumin (BSA) có chứa 100 mmol/l 2-[N-(7-nitrobenz-2-oxa-1, 3-diazol-4-yl) amino]-2-deoxy-glucose (2- NBDG-glucose) và 100 nmol/l insulin ủ trong 1 giờ ở nhiệt độ 37°C. Tiến hành đo trên thiết bị đọc đĩa huỳnh quang ở bước sóng 485 nm và 535 nm.

2.3.7.5. Đánh giá biểu hiện protein của IRS1 và Y20 bằng phương pháp

Western blot [107]

Các tế bào 3T3-L1 được nuôi cấy và biệt hóa trong các đĩa 6 giếng. Các tế bào đã được ủ với TNF-α để gây ra kháng insulin, như được mô tả trước đó, trước khi ủ với các hợp chất tinh sạch. Tế bào sau đó được ủ với 200 µg/ml các hợp chất tinh sạch và rosiglitazone trong 24 giờ. Các tế bào được kích thích bằng insulin trong 5 phút trước thu hoạch. Sau đó phá tế bào và phân tích Western blot. Trong phân tích Western blot: sử dụng đệm ly giải được bổ sung với 1 mM phenylmethylsulfonyl florua và 1% chất ức chế phosphatase. Protein được phân giải trên gel 8% SDS- polyacrylamide và thấm qua đêm trên màng immobilon-P polyvinylidene difluoride. Các protein không đặc hiệu được ngăn chặn bằng 5% BSA trong dung dịch muối đệm Tris với 0,1% Tween trong 1 giờ và sau đó được ủ qua đêm với

kháng thể. Các kháng thể sau được sử dụng để thăm dò: kháng thể p-IRS1 và p- Y20.

2.3.8. Chuẩn bị cao hỗn hợp các thảo dược có khả năng hạ đường huyết

2.3.8.1. Phối hợp các cây thảo dược để tăng hiệu quả trong điều trị ĐTĐ

Trong thí nghiệm này chúng tôi tiến hành kết hợp các thực vật đã nghiên cứu có hiệu quả trong điều trị ĐTĐ để tạo thành cao hỗn hợp có hiệu quả cao hơn trong điều trị ĐTĐ. Các mẫu thực vật bao gồm chè dây, lá đắng, cỏ ngọt, chuối hột, lá đu đủ, hạt đu đủ, dây thìa canh và giảo cổ lam, khi phối hợp các thực vật với nhau, mỗi sản phẩm cho khuyết một thành phần theo tỷ lệ 1:1:1:1:1:1:1:1 nhằm chọn lọc một cao hỗn hợp có tác dụng hạ đường huyết tốt nhất. Thí nghiệm nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của cao hỗn hợp bằng cách cho chuột nhắt ĐTĐ type 2 uống cao hỗn hợp với liều 500 và 1000 mg/kg chuột/ngày:

Lô 1 (lô đối chứng, n = 10): Uống nước cất 10 ml/kg.

Lô 2 (lô thử, n = 10): Uống cao hỗn hợp.

Lô 3 (lô chứng dương, n = 10): Uống Pioglite 20 mg/kg

Đường huyết chuột lúc đói được đo tại các thời điểm 0 giờ, 2 ngày, 7 ngày, 14 ngày và 21 ngày.

2.3.8.2. Xác định hàm lượng glycogen

Hàm lượng glycogen mô gan được xác định bằng phương pháp của Carroll et

al. [50].

Nguyên tắc: glycogen bị kết tủa bởi ethanol và được chiết ra từ dịch chiết mô, sau đó bị thủy phân thành glucose trong acid sulfuric và thực hiện phản ứng lên màu với thuốc thử anthrone.

Tiến hành: Cân chính xác khoảng 1 gam mô gan tươi nghiền đồng nhất với 5ml acid tricloacetic 7%. Sau đó ly tâm ở tốc độ 3000 vòng/phút trong 15 phút để loại bỏ tủa protein. Dịch trong thu được cho vào bình định mức 100 ml, bổ sung acid tricloacetic cho đủ thể tích, lắc đều. Lấy chính xác 1ml dịch trong vào ống ly tâm và thêm 5 ml ethanol để kết tủa glycogen. Để kết tủa hoàn toàn glycogen, đặt trong tủ điều nhiệt 37°C trong thời gian 3 giờ. Sau đó ly tâm trong 15 phút thu tủa glycogen.

Hòa tan tủa trong 2ml nước cất, thêm 10 ml thuốc thử anthrone, lắc đều đun sôi cách thủy 15 phút, thu được dung dịch có màu xanh, tiến hành làm lạnh đến nhiệt độ phòng. Đo quang ở bước sóng 620 nm.

2.3.9. Xác định độc tính cấp của cao hỗn hợp

Xác định liều LD50 theo tài liệu hướng dẫn [8]. Trước khi cho uống thuốc, chuột bị bỏ đói trong 18 h. Nước cất và thuốc thử được đưa thẳng vào dạ dày chuột bằng kim cong đầu tù với lượng thuốc uống hằng định mỗi lần 0,3 ml/10 g cân nặng, uống 3 lần/24 giờ, mỗi lần cách nhau 2 giờ.

Thử nghiệm sơ bộ: Chọn 2 con chuột cho uống liều tối đa có thể cho uống, quan sát chuột trong 72 giờ. Tìm liều cao nhất chuột không chết và liều thấp nhất gây chết 100%.

- Trường hợp 1: Nếu không có chuột nào chết, tiếp tục thử nghiệm chính thức.

- Trường hợp 2: Nếu tất cả chuột tử vong thì giảm liều đến khi tìm được liều làm 1 con sống 1 con chết thì lấy đó làm cơ sở tiếp tục cho các bước thử nghiệm xác định theo tài liệu hướng dẫn.

Thử nghiệm chính thức:

- Các mức liều thử nghiệm: Chia ngẫu nhiên chuột thành 5 lô, mỗi lô 10 con. Lô chứng uống nước cất, các lô thử uống thuốc với mức liều 9,6 g, 19,2 g, 28,8 g, 38,4 g thể trọng.

- Theo dòi tình trạng chung của chuột và số lượng chuột chết mỗi lô trong 72 giờ. Sau đó tiếp tục theo dòi tình trạng của chuột đến hết ngày thứ 7 sau khi uống thuốc. So sánh với mẫu đối chứng, ghi nhận các biểu hiện lâm sàng và nhận xét kết quả.

2.3.10. Phương pháp phân lập và xác định cấu trúc hóa học

2.3.10.1. Phương pháp phân lập

a. Sắc ký lớp mỏng

Sắc ký lớp mỏng dùng để kiểm tra độ tinh khiết của các hợp chất phân lập được. Sắc kí lớp mỏng dựa chủ yếu vào hiện tượng hấp thu trong đó pha động là một dung môi hoặc hỗn hợp các dung môi, di chuyển ngang qua một pha tĩnh là một là một lớp mỏng các chất hấp phụ là silica gel. Pha động bao gồm thành phần khác nhau của hỗn

hợp mẫu cần phân tích được hòa tan trong một dung môi thích hợp và được hút lên bản sắc kí bởi mao dẫn, tách dung dịch thí nghiệm dựa trên tính phân cực của các thành phần trong dung dịch.

Sau khi chạy sắc ký, phát hiện các chất trên bản mỏng bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 368 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ trên bếp điện đến khi hiện màu.

b. Sắc ký cột

Nguyên tắc của sắc ký là dựa vào tính ái lực khác nhau của hỗn hợp nhiều loại hợp chất đối với pha động và pha tĩnh, để từ đó tách những loại hợp chất đó ra riêng thành từng loại đơn chất. Trong đó, pha tĩnh được nhồi vào một cột thủy tinh, pha lỏng là dung môi dùng để chiết cho chảy qua cột. Mẫu được đưa vào một đầu của cột. Các phần khác nhau của mẫu sẽ đi qua cột với tốc độ khác nhau, các phân tử có kích thước nhỏ sẽ đi sâu vào mạng lưới của chất nhồi và bị giữ lâu trong cột, còn các phân tử có kích thước lớn hơn sẽ chỉ thâm nhập ở mức độ nhất định, các phân tử có khối lượng rất lớn sẽ không di chuyển được vào các mao quản. Kết quả là các phân tử được giải ly khỏi cột theo thứ tự trọng lượng phân tử giảm dần [15].

2.3.10.2. Phương pháp xác định cấu trúc

a. Phổ khối lượng hay còn gọi là khối phổ (Mass Spectroscopy, MS)

Kỹ thuật phổ khối được sử dụng khá phổ biến để xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ, đây là phương pháp nghiên cứu các chất bằng cách đo chính xác khối lượng phân tử chất đó. Hợp chất cần nghiên cứu đầu tiên được chuyển thành trạng thái hơi, sau đó được ion hóa bằng các phương pháp thích hợp. Ion phân tử hình thành bởi phương pháp ion hóa va chạm điện tử (EI-MS) có năng lượng cao và có thể bị bắn phá thành nhiều mảnh khác nhau. Mỗi một phân tử có cách phân mảnh riêng và cần đặc biệt quan tâm đến các pic có hàm lượng lớn trong phổ đồ. Các ion tạo thành được đưa vào nghiên cứu trong bộ phận phân tích của máy khối phổ. Tùy theo loại điện tích của ion đem nghiên cứu mà người ta phân biệt máy khối phổ ion dương hoặc ion âm.

b. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR- Nuclear Magnetic

Resonance)

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là một phương pháp phổ hiện đại và phổ biến nhất hiện nay dùng để cung cấp rất nhiều thông tin về cấu trúc phân tử và từ đó để xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ.

Nguyên lý chung của các phương pháp phổ NMR (phổ proton và cacbon) là sự cộng hưởng khác nhau của các hạt nhân từ (1H và 13C) dưới tác dụng của từ trường ngoài. Tại vị trí mà một hạt nhân hấp thu năng lượng để có hiện tượng cộng hưởng được biểu diễn bằng độ dịch chuyển hóa học (chemical shift). Ngoài ra, đặc trưng của các phân tử còn được xác định dựa vào tương tác spin các hạt nhân từ với nhau (spin coupling).

- Phổ đồ 1H-NMR: cho biết có bao nhiêu loại proton trong phân tử và cũng cho biết mỗi loại proton đó có bao nhiêu nguyên tử H. Các loại hạt nhân khác nhau trong một phân tử có độ dịch chuyển hóa học khác nhau là do mỗi loại hạt nhân được che chắn khác nhau bởi các đám mây điện tử chung quanh. Dựa vào những đặc trưng của độ dịch chuyển hóa học cũng như tương tác cặp đôi spin mà có thể xác định được cấu trúc hóa học của các hợp chất.

- Phổ 13C-NMR: cho thông tin quan trọng về khung sườn cacbon của hợp chất hữu cơ. Mỗi nguyên tử cacbon sẽ cộng hưởng ở một trường khác nhau và cho một tín hiệu phổ khác nhau. Thang đo cho phổ 13C-NMR cũng được tính bằng ppm và với dải thang đo rộng hơn so với phổ proton (từ 0-240 ppm). Khác với phổ proton 1H- NMR, ở phổ 13C-NMR mỗi cacbon riêng biệt chỉ cho một tín hiệu mũi đơn duy nhất và không có sự chẻ mũi như trong phổ 1H-NMR.

- Phổ DEPT: để xác định được các loại cacbon có trong phân tử hợp chất hữu cơ, hiện nay người ta sử dụng kỹ thuật DEPT-NMR. Kỹ thuật DEPT-NMR được thực hiện đồng thời trong cả hai kênh 1H và kênh 13C một loại những xung phức tạp đã được chương trình hóa. Hệ quả của xung nầy là các cacbon có gắn một, hai hay ba nguyên tử hidro sẽ được máy ghi thành những pha khác nhau. Để có được phổ này, người ta thực hiện ba lần ghi phổ khác nhau, trong đó một lần gọi là DEPT-45, cacbon nào có mang một hiđro sẽ xuất hiện một mũi trên phổ đồ. Ngay sau đó, một lần ghi

phổ thứ nhì gọi là DEP-90, chỉ có những cacbon loại metin >CH- mới xuất hiện trên phổ đồ. Một lần ghi phổ thứ ba gọi là DEP-135, những cacbon metin >CH- và metyl

–CH3 sẽ xuất hiện trên phổ đồ những mũi dương (hướng lên trên), cacbon metylen – CH2- sẽ cho mũi hướng về chiều ngược lại với mũi dương, cacbon tứ cấp >C< do không mang hiđro nên không xuất hiện trong phổ DEPT-NMR.

Đối với các hợp chất hữu cơ có cấu trúc đơn giản, chỉ cần phân tích phổ 1H- NMR, 13CNMR và DEPT-NMR là hoàn toàn có thể xác định được. Tuy nhiên, đối với các hợp chất có cấu trúc phức tạp thì nếu chỉ sử dụng phổ 1H-NMR và 13C-NMR một chiều sẽ rất khó để giải đoán các tín hiệu cộng hưởng và xác định chính xác cấu trúc hóa học. Khi đó việc sử dụng phổ NMR hai chiều để giải đoán phổ sẽ dễ dàng hơn. Hiện nay có nhiều loại phổ NMR hai chiều, một số loại được sử dụng phổ biến là: HMQC, 1H-1H COSY; HMBC.

+ Phổ HMQC (Heteronuclear Multiple Quantum Coherence): các tương tác trực tiếp H-C được xác định nhờ vào các tương tác trên phổ này.

+ Phổ HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Connectivity): Đây là phổ biểu diễn các tương tác xa của H và C trong phân tử, cho thông tin về tương quan hai, ba và đôi khi bốn nối giữa proton và cacbon.

+ Phổ 1H-1H COSY (1H- 1H Chemical Shift Correlation Spectroscopy): phổ này cho thông tin về các tương tác H-H, chủ yếu của các proton đính với cacbon liền kề nhau. Nhờ vào phổ này mà các phần của phân tử được nối ghép lại với nhau [16].

2.3.11. Xử lý số liệu

Kết quả được biểu diễn dưới dạng XTB ± SE (XTB: giá trị trung bình của từng lô, SE: sai số chuẩn). Xử lý số liệu bằng phần mềm SPSS (Version 22) với test thống kê paired samples T-Test để so sánh sự khác nhau giữa hai nhóm và test thống kê ANOVA để so sánh sự khác biệt giữa các thời điểm khác nhau trong cùng một nhóm và giữa các nhóm tại cùng thời điểm. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05, sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê khi p > 0,05.

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả tách chiết mẫu

Sau khi tham khảo tài liệu trong và ngoài nước cũng như kinh nghiệm dân gian, chúng tôi đã quyết định chọn ra các mẫu thực vật được dự đoán là có khả năng hạ đường huyết để làm đối tượng nghiên cứu. Kết quả tách chiết mẫu thực vật được trình bày ở bảng 3.1.

Bảng 3.1. Kết quả tách chiết các mẫu thực vật

STT

Mẫu thực vật	Khối lượng mẫu khô (g)	Khối lượng cao (g)	Phần trăm hàm lượng cao (%)
1	Chè dây	250	65	26,00
2	Cao vằng	320	73	22,81
3	Lá nếp	400	62	15,50
4	Quả chuối hột	287	58	20,21
5	Tầm bóp	310	56	18,06
6	Lá đu đủ	345	82	23,77
7	Hạt đu đủ	400	37	9,25
8	Quả sung	395	54	13,67
9	Ké đầu ngựa	338	64	18,93
10	Nở ngày đất	365	59	16,16
11	Râu bắp	390	60	15,38
12	Lá đắng	400	48	12,00
13	Lá sa kê	345	52	15,07
14	Giảo cổ lam	367	57	15,53
15	Dây thìa canh	380	93	24,47
16	Lá sen	348	82	23,56
17	Lá lược vàng	400	45	11,25
18	Quế	387	52	13,44
19	Lá húng quế	393	73	18,58
20	Cây cỏ ngọt	355	59	16,62