Ước Tính Tỷ Lệ Mắc Bệnh Trong Nghiên Cứu Dịch Tễ Học, Lâm Sàng

tuổi). Dùng tăm bông miết mạnh khu vực 2 Amidan hoặc thành sau vòm họng, sau đó nhúng tăm bông vào môi trường vận chuyển đã chuẩn bị sẵn. Đối với trẻ nhỏ dưới 5 tuổi dùng dịch tỵ hầu (phương pháp hút chân không). Bộ dụng cụ của mỗi trẻ bao gồm: một sonde hút vô khuẩn, một bơm tiêm 5 ml, một đôi găng vô khuẩn. Nghiên cứu viên đã tiến hành đưa sonde qua đường mũi của bệnh nhân, dùng ống thông plastic nhỏ mềm đưa sâu qua lỗ mũi một khoảng cách bằng 1/2 khoảng cách từ đỉnh mũi đến ống tai ngoài của bệnh nhân để hút dịch. Sau đó, bệnh phẩm được bảo quản trong môi trường

chuyển về phòng xét nghiệm. Tất cả bệnh phẩm được bảo quản ở -70oc cho

tới khi tiến hành phân tích.

+ Các bước tiến hành:

- Xử lý bệnh phẩm lấy bằng tăm bông: xử lý thô (để bảo quản mẫu, chưa

tách DNA).

- Tách DNA (sử dụng Kit tách chiết QIAgen hoặc Sepagene) theo hướng

dẫn của nhà sản xuất.

- Chương trình PCR đa mồi:

Chu trình phụ: [960C x 3’; 550C x 45’’; 720C x 1’] x 3 cycles Chu trình chính: [940C x 1’; 550C x 1’; 720C x 1’] x 35 cycles Kéo dài: 720C x 10’; giữ mẫu 150C

- Điện di sản phẩm PCR, đọc kết quả trong máy UVP.

+ Nhận định kết quả: mẫu được xác định là dương tính khi trên điện đồ sản phẩm PCR cho một băng AND duy nhất tương ứng một đoạn gen đặc hiệu cho M. pneumoniae, C. pneumoniae và L. pneumophila.

Các xét nghiệm được tiến hành tại Phòng xét nghiệm vi khuẩn hô hấp

Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương.

X-quang tim phổi

Được chụp theo phương pháp kĩ thuật số thực hiện trên máy X-quang Shimadzu R-20J.

Siêu âm phổi màng phổi

Thực hiện trên máy siêu âm Toshiba NemioXG khi có nghi ngờ tràn dịch màng phổi.

CT scanner lồng ngực

Thực hiện trên máy GE hispeed khi có tổn thương nghi ngờ u, nang hoặc

hỗn hợp.

Nuôi cấy vi khuẩn từ dịch tỵ hầu bằng phương pháp cấy đếm

Bệnh phẩm được nuôi cấy và phân lập theo qui trình của WHO.

+ Bệnh phẩm

Chất dịch hô hấp lấy bằng cách hút chân không nhẹ: cách này thay thế cho cách ngoáy tỵ hầu ở trên. Dùng ống thông plastic nhỏ mềm đưa sâu qua lỗ mũi một khoảng cách bằng 1/2 khoảng cách từ đỉnh mũi đến ống tai ngoài của bệnh nhân để hút dịch.

+ Các bước tiến hành

Bệnh phẩm được bảo quản vào ống nghiệm vô khuẩn và đưa ngay tới phòng xét nghiệm, được pha loãng với nồng độ 10-2 10-3 10-4 10-510-6 10-7. Sau đó bệnh phẩm pha loãng được nuôi cấy trên môi trường thạch máu 5%, thạch socola. Kết quả đọc sau 24 - 48 giờ.

+ Nhận định kết quả: kết quả được gọi là dương tính khi số lượng vi

khuẩn đạt ≥107 CFU/ml.

Xét nghiệm virus đường hô hấp

Vi rút RSV, cúm AB, Rhinovirus, Adenovirus được phát hiện bằng kỹ thuật RT- PCR thực hiện tại phòng nghiên cứu sinh học phân tử các bệnh nhiễm trùng – Bệnh viện Nhi Trung ương.

+ Bệnh phẩm

+ Các bước tiến hành:

Bệnh phẩm được bảo quản trong môi trường vận chuyển theo quy trình, mang đến khoa vi sinh và giữ ở nhiệt độ - 700. Tiến hành kỹ thuật RT- PCR dựa trên primer của Carla Osiwy (1998). Trong kỹ thuật này chúng tôi áp dụng phản ứng sử dụng Taqman probe.

- Bước 1. Tiến hành tách genome: ARN của virut được tách triết bằng bộ

Qiamp Viral RNA Mini kit.

- Bước 2. Tiến hành chạy PCR trên máy Biorad. Các thành phần của phản ứng RT-PCR được tiến hành theo Kit SuperSckip III One- Step của hãng Invitrogen, chu trình nhiệt được tiến hành trên máy iCycler của Biorad.

- Bước 3. Lấy sản phẩm PCR điện di trên Gel Garose, đọc kết quả.

+ Nhận định kết quả:

Mẫu được xác định là dương tính khi trên điện đồ sản phẩm PCR cho một băng ARN duy nhất tương ứng một đoạn gen đặc hiệu cho RSV, Rhinovirus, Adenovirus hoặc virut cúm.

2.7.2. Các chỉ số nghiên cứu cho mục tiêu 2

Các chỉ số liên quan đến mức độ nặng của viêm phổi không điển hình do 3 loại vi khuẩn nghiên cứu:

+ Mối liên quan giữa thời gian từ khi khởi bệnh đến khi nhập viện với

mức độ nặng của bệnh.

+ Mối liên quan giữa loại kháng sinh dùng trước khi nhập viện với mức độ nặng của bệnh.

+ Mối liên quan giữa các dấu hiệu, triệu chứng lâm sàng với mức độ

nặng của bệnh.

+ Mối liên quan giữa các thể lâm sàng viêm phổi với mức độ nặng của bệnh.

+ Mối liên quan giữa các bệnh đi kèm với mức độ nặng của bệnh.

+ Mối liên quan giữa tình trạng dinh dưỡng, tiêm chủng, các bệnh đi

kèm với mức độ nặng của bệnh.

+ Mối liên quan giữa số lượng bạch cầu, CRP, cytokin IL6, tình trạng miễn dịch (IgA, IgM, IgG, IgE) với mức độ nặng của bệnh.

+ Mối liên quan giữa tình trạng đồng nhiễm vi khuẩn khác, vi rút với mức độ nặng của bệnh (dự kiến đây là yếu tố chính có liên quan đến tình trạng nặng của bệnh).

2.8. Phương tiện nghiên cứu

Mẫu bệnh án nghiên cứu (theo phụ lục 3). Phần mềm thu thập số liệu EpiData 3.1.

Phần mềm phân loại suy dinh dưỡng WHO Anthro 2007 Phần mềm phân tích số liệu Stata 10, SPSS 13.

2.9. Phương pháp xử lý số liệu nghiên cứu

Thống kê mô tả:

Các biến số định lượng được kiểm tra phân phối của số liệu. Đối với các biến định lượng có phân bố chuẩn, giá trị trung bình và độ lệch chuẩn được sử dụng để trình bày. Đối với các biến định lượng không có phân bố chuẩn, giá trị trung vị và các phạm vi (giá trị nhỏ nhất, giá trị lớn nhất) được sử dụng để trình bày.

Các biến số phân loại được trình bày bằng bảng phân bố tần số và tỷ lệ

phần trăm.

Thống kê phân tích

Kiểm định t không ghép cặp được sử dụng để so sánh hai giá trị trung

bình. Kiểm định χ2, Fisher exact test được sử dụng để so sánh các tỷ lệ.

Tính tỷ suất chênh OR để tìm hiểu mối liên quan giữa các yếu tố liên quan đã được trình bày ở trên và tình trạng nặng của bệnh.

Hồi quy logistics được sử dụng để xác định mối liên quan giữa các yếu

tố với tình trạng nặng của bệnh để khống chế gây nhiễu.

Kiểm định Hosmer-Lemeshow được sử dụng để kiểm định tính phù hợp của mô hình. Mô hình được xem là phù hợp khi giá trị p của kiểm định này lớn hơn 0,05.

Các kiểm định thống kê được thực hiện với mức ý nghĩa 5%.

2.9.1. Ước tính tỷ lệ mắc bệnh trong nghiên cứu dịch tễ học, lâm sàng

2.9.2. Tỷ suất chênh (OR) trong nghiên cứu mô tả loạt bệnh

Tỷ suất chênh là số đo dùng để so sánh độ chênh của bệnh xảy ra trong nhóm phơi nhiễm và không phơi nhiễm. Công thức tính OR đối với các mẫu độc lập:

Độ chênh của phơi nhiễm trong nhóm bệnh ad

OR = …………………………………………………………………………………. = ……...

Độ chênh của phơi nhiễm trong nhóm không bệnh bc

Trong đó: - a: là số cá thể có phơi nhiễm và mắc bệnh.

- b: là số các thể có phơi nhiễm và không mắc bệnh.

- c: là số cá thể không phơi nhiễm và mắc bệnh.

- d: là số cá thể không phơi nhiễm và không mắc bệnh.

2.9.3. Khoảng tin cậy (CI) của tỷ suất chênh OR

Khoảng tin cậy 95% đối với OR nói lên rằng nhà nghiên cứu có thể tin đến 95% là khoảng tin cậy tính được có chứa giá trị thật của OR trong quần thể nghiên cứu từ đó mẫu được rút ra.

2.9.4. Kiểm định giả thuyết dùng OR

- Khả năng mắc viêm phổi không điển hình nặng ở các trẻ có phơi nhiễm với yếu tố liên quan lớn hơn OR lần khả năng mắc viêm phổi không điển hình nặng ở các trẻ không phơi nhiễm với yếu tố liên quan.

- Khi trị số của OR khác 1 thì có sự liên quan giữa viêm phổi không điển hình nặng và yếu tố liên quan. Trị số OR càng lớn thì sự kết hợp giữa viêm phổi không điển hình nặng và yếu tố liên quan càng mạnh.

- Khi khoảng tin cậy không chứa 1 thì ta loại bỏ giả thuyết Ho, nghĩa là “sự kết hợp giữa yếu tố liên quan và viêm phổi không điển hình nặng có ý nghĩa thống kê ở ngưỡng xác suất p (p < 0,05 nếu là khoảng tin cậy 95%)”. Nếu khoảng tin cậy quá rộng thì ít có giá trị thực tế, cần thận trọng khi phiên giải kết quả.

- Khi trị số của OR = 1 thì không có sự kết hợp giữa viêm phổi nặng và yếu tố liên quan vì độ chênh của phơi nhiễm trong nhóm nặng sẽ bằng độ chênh của phơi nhiễm trong nhóm không nặng.

- Khi OR nhỏ hơn 1 thì có kết hợp âm tính (nghĩa là có hiệu quả bảo

vệ) giữa yếu tố liên quan và viêm phổi không điển hình nặng.

2.9.5. Trắc nghiệm chính xác Fisher’s

Trắc nghiệm chính xác Fisher’s dùng để so sánh các tỷ lệ dưới dạng dữ kiện nhị thức và với bất kỳ cỡ mẫu nào, cho giá trị chính xác của p trong khác biệt quan sát.

2.9.6. Mô hình hồi quy đa biến Logistic

Phân tích ảnh hưởng của các yếu tố liên quan tới viêm phổi không điển

hình nặng bằng mô hình hồi quy logistic.

Phân tích đa biến: các yếu tố liên quan được tìm thấy trong phân tích đơn biến tiếp tục đưa vào phân tích đa biến bằng phương pháp từng bước (step - wise approach) để loại các yếu tố gây nhiễu, đồng thời xác định xem yếu tố liên quan nào trong nhóm góp phần tăng khả năng mắc viêm phổi không điển hình nặng

2.10. Khía cạnh đạo đức trong nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu được thông tin và giải thích rõ ràng về mục đích, quyền lợi và nghĩa vụ khi tham gia vào nghiên cứu.

- Nghiên cứu dựa trên các biện pháp chẩn đoán và điều trị truyền thống đúng quy định của Bộ Y tế, không gây nguy hiểm thêm cho bệnh nhân

- Chỉ nghiên cứu những đối tượng tự nguyện tham gia.

- Đảm bảo bí mật của người cung cấp thông tin.

- Thông báo kết quả cho người tham gia nghiên cứu biết.

- Kết quả nghiên cứu chỉ phục vụ cho sức khỏe cộng đồng và bệnh nhân, ngoài ra không nhằm mục đích nào khác.

- Việc tiến hành nghiên cứu có xin phép và được sự chấp thuận của Hội đồng chấm đề cương luận án của Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương và Hội đồng y đức của Bệnh viện Nhi Trung ương.

Chương 3

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. Đặc điểm dịch tễ học, lâm sàng của bệnh viêm phổi không điển hình do vi khuẩn ở trẻ em

Nghiên cứu sàng lọc trên 722 bệnh nhi viêm phổi chung đến khám và điều trị tại khoa Hô hấp Bệnh viện Nhi Trung ương, kết quả phát hiện 215 trường hợp viêm phổi không điển hình do các vi khuẩn M. pneumoniae, C. pneumoniae, L. pneumophila gây nên.

3.1.1. Đặc điểm dịch tễ học chung của viêm phổi không điển hình

3.1.1.1. Tỷ lệ các loại viêm phổi chung

Bảng 3.1. Tỷ lệ các loại viêm phổi chung

Loại viêm phổi

Số lượng	Tỷ lệ %
Viêm phổi điển hình do vi khuẩn	82	11,35
Viêm phổi do virus	80	11,08
Viêm phổi điển hình do vi khuẩn phối hợp virus	14	1,93
Viêm phổi không điển hình do vi khuẩn	215	29,8
Viêm phổi không rõ căn nguyên	331	45,84
Tổng cộng	722	100
Tỷ lệ mắc viêm phổi không điển hình trong	tổng số các	trường hợp

Số lượng	Tỷ lệ %
VPKĐH trong nhóm	VPKĐH đơn thuần: do hoặc M. pneumoniae, hoặc C. pneumoniae, hoặc L. pneumophila	144	67
VPKĐH trong nhóm	VPKĐH đồng nhiễm trong nhóm: do M. pneumoniae và C. pneumoniae hoặc M. pneumoniae và L. pneumophila hoặc C. pneumoniae và L. pneumophila	10	4,63 4,63
VPKĐH đồng nhiễm ngoài nhóm	VP không điển hình do vi khuẩn + VP điển hình do vi khuẩn	38	1177,,6677
	VP không điển hình do vi khuẩn + VP do virut	19	8,84 8,84
	VP không điển hình do vi khuẩn + VP điển hình do vi khuẩn + VP do virut	4	1,86 1,86
Tổng số		215	100

M. pneumoniae	C. pneumoniae	L. pneumophila	Tổng
Đơn nhiễm	175	13	12	200
Đồng nhiễm				15
M. pneumoniae + C. pneumoniae	14	14	0	14
M. pneumoniae + L. pneumophila	1	0	1	1
C. pneumoniae + L. pneumophila	0	0	0	0
M. pneumoniae + C. pneumoniae + L. pneumophila	0	0	0	0
Tổng số nhiễm	190	27	13	215
Tỷ lệ %( Số nhiễm/ 722)	26,3	3,7	1,8	29,8